CN1393474A - 肿瘤坏死因子受体的亲和肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤坏死因子受体亲和肽，它的氨基酸残基具有以下通式：A－B－C－E－F－G－H－I－J－K－L，其中，A、C均代表芳香族氨基酸；B代表组氨酸；E代表色氨酸；F代表芳香族氨基酸或含羟基氨基酸；G、H、I、J、K、L代表任意氨基酸。在所述氨基酸残基序列的C与E之间设有氨基酸残基D，D代表含羟基氨基酸。本发明的亲和肽可以在制药、纯化和检测TNF受体中得到广泛应用。

Description

肿瘤坏死因子受体的亲和肽及其应用

本发明涉及肿瘤坏死因子抑制剂及其应用，具体涉及能够与肿瘤坏死因子受体特异结合并抑制肿瘤坏死因子活性的亲和肽及其应用。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种有多种生物学活性的免疫和炎症介质，其在体内的过量表达可造成严重的炎症反应，导致血栓、低血压、休克、组织损伤甚至死亡。肿瘤坏死因子-α的非正常表达还与一些常见的自身免疫性疾病，如：类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症、节段性回肠炎(Crohn’s)等有关。因此以抑制肿瘤坏死因子-α为目的的治疗药物，受到人们的广泛关注(Andreas等，Immunology Today 18：487(1997))。

通过抑制TNF-α与受体的结合是一种比较好的抑制TNF-α活性的方法。目前抑制TNF-α与受体的结合主要采用TNF-α抗体、可溶性TNF受体或TNF-α受体模拟肽，这些药物都是通过封闭TNF上的受体结合位点来阻断TNF与受体的结合，从而实现抑制TNF活性的目的。

在开发TNF-α抗体药物的努力中，一些药物已经获得成功。Centorcor公司生产的抗TNF-α抗体REMICADE(infliximab)于1998年8月获FDA批准用于Crohn’s的治疗(van Deventer等，Aliment Pharmacl Ther 13 Suppl 4：3(1999)；Scand J Immunol 51：18(2000))，该药于1999年11月再次获FDA批准用于RA的治疗。这是第一种用于RA治疗的抗体类药物。另外，英国BASF公司在成功实验了人-鼠杂合抗TNF-α抗体cA2对RA的治疗之后，目前正在开展新抗体D2E7治疗RA的三期临床实验(Baert等，Int J Colorectal Dis 14：47(1999))。

可溶性TNF-α受体对TNF的抑制作用，也同样显示出较好的效果。美国的Immunex公司于1993年就开始研究使用人TNFR2胞外区与IgG1Fc段融合的重组蛋白(商品名：ENBREL)治疗RA，并于1998年5月获得FDA批准，用于RA的临床治疗(Moreland等，Rheum Dis Clin North Am 24：579(1998))。1999年5月再次获准用于青少年类风湿性关节炎(JRA)的治疗。目前该公司正在实验用ENBREL治疗充血性心力衰竭。

小分子的TNF结合肽也可作为拮抗剂，用于抑制TNF的活性(Lie等，Biochemical and Biophysical Research Communication 1992，188：503-509；Takasaki等，Nature Biotech1997，15；1266；Chirinos-Rojas等，Journal of Immuology161；5621(1998)；Immunology 96；109(1999))。目前这类小分子肽类药物还处于实验室研究阶段。

通过与TNF结合来抑制TNF活性虽然取得一定的效果，但由于TNF在炎症反应中浓度较高，难以完全被抑制物结合，仍然存在残留TNF对靶细胞的激活作用，使治疗效果受到影响。TNF浓度的不确定性，也使抗TNF药物的用量难以控制。

本发明的目的是提供一类能够与肿瘤坏死因子受体专一结合，并能抑制肿瘤坏死因子活性的肿瘤坏死因子受体亲和肽。

本发明的肿瘤坏死因子受体亲和肽，它的氨基酸残基具有以下通式；

A-B-C-E-F-G-H-I-J-K-L

其中，

A、C均代表芳香族氨基酸；

B代表组氨酸；

E代表色氨酸；

F代表芳香族氨基酸或含羟基氨基酸；

G、H、I、J、K、L代表任意氨基酸。

在所述氨基酸残基序列的C与E之间还可以设有氨基酸残基D，D代表含羟基氨基酸，即丝氨酸或苏氨酸。

A、C代表芳香族氨基酸中的一种，即色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，其中优选的是色氨酸。

G代表任意氨基酸残基，但优选的是含羟基氨基酸，即丝氨酸或苏氨酸。

H代表任意氨基酸残基，但优选的是脯氨酸。

I、J、K、L代表任意氨基酸残基，但优选的是含羟基氨基酸、酪氨酸、精氨酸或脯氨酸中的一种。

本发明有代表性的肿瘤坏死因子受体亲和肽可以是下述多肽之一；

FHWWLSPPSRV

FHWSWYTPSRPS

WHYSWFSPYRTS

WHWTWLSEYPPP

WHWSWIQNAAPN

WHWSLWRPPYTL

本发明的肿瘤坏死因子受体亲和肽即可以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白或多肽融合，或插入蛋白质表面的特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。

本发明的肿瘤坏死因子受体亲和肽可以用多种途径获得，例如，按已知的多肽合成方法制备，用基因工程方法生产重组蛋白，以及通过其他化学改造方法进行生产。下面着重说明本发明肽的融合表达和纯化方法；

将合成的编码TNF受体亲和肽的DNA片段与pGEX-KG载体在EcoRI/HindIII酶切位点处连接，并转化E.coli RRI感受态细胞。各挑取数个单菌落进行PCR鉴定，并测序。

将经鉴定正确的重组菌菌液按1∶100接种于含有氨卞青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG诱导表达3h，离心去上清，菌体可进行纯化或冻存于-20℃。将诱导表达的菌体按原菌液1/10的体积重悬于PBS超声缓冲液中，在超声破碎仪上冰浴超声裂解；将超声处理后的菌液于4℃，12,000r/m离心15min；其间将GlutathioneSepharose 4B亲和纯化树脂用10倍柱体积的PBS平衡。将离心上清上柱，使GST-结合肽融合蛋白与树脂结合；用10倍柱体积PBS洗去非特异结合的杂蛋白。用10mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱目的蛋白并通过SDS-PAGE鉴定纯度。

本发明的另一个目的是提供肿瘤坏死因子受体亲和肽在制造抗肿瘤坏死因子药物中的应用。

以本发明肿瘤坏死因子受体亲和肽为活性成分的药物，含有治疗有效量的本发明多肽。研究结果表明，本发明的多肽不仅能够与TNF受体结合，还可竞争性地抑制TNF与受体的结合，并能抑制TNF对细胞的细胞毒性，为各种炎症或相关免疫性疾病的治疗提供了一条新的途径。

需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的再一个目的是提供肿瘤坏死因子受体亲和肽在其它领域的应用。

本发明的肿瘤坏死因子受体亲和肽可以作为配体，与琼脂糖偶联后用于TNF受体的亲和纯化；与指示标签偶联后作为探针用于TNF受体的检测；通过合成或基因重组的方式，将含本发明序列模式的肽段与其他蛋白或肽融合，用于以抑制TNF活性为目的的各种感染性疾病、自免疫疾病以及其他相关疾病的治疗。

本发明利用噬菌体多肽展示技术，以TNF受体为靶标，巧妙地设计出肿瘤坏死因子受体亲和肽，这种亲和肽通过竞争抑制TNF与受体的结合，从而实现抑制TNF活性的目的。肿瘤坏死因子受体亲和肽可与TNF受体专一结合，阻断TNF与受体的结合，抑制TNF的生物学活性，包括抑制TNF的细胞毒性以及TNF诱导细胞凋亡的活性。

下面结合附图对本发明作进一步说明。

图1-A为噬菌体展示肽与TNF受体1结合的ELISA分析

图1-B为噬菌体展示肽与TNF受体2结合的ELISA分析

图2为GST融合肽对TNF-TNFR1的竞争抑制作用

图3为噬菌体克隆抑制TNF-α对MCF-7细胞杀伤作用

实施例1、具有代表性的TNF受体结合肽

本发明选用以下6个具有代表性的肽，并用普通的固相合成方法进行合成。

1号肽：  FHW-WLSPPSRV

2号肽：  FHWSWYTPSRPS

3号肽：  WHYSWFSPYRTS

4号肽：  WHWTWLSEYPPP

5号肽：  WHWSWIQNAAPN

6号肽：  WHWSLWRPPYTL

实施例2、六个具有代表性肽在噬菌体表面的展示

本发明的肽通过基因重组的方法展示在M13噬菌体表面。所用克隆化的噬菌体展示肽系从New England Biolabs公司的噬菌体11、12肽库，以TNF受体1为靶，用标准生物淘洗的方法筛选得到。

实施例3、ELISA方法检测肿瘤坏死因子受体亲和肽与TNF受体的结合

用PBS将纯化的可溶性肿瘤坏死因子受体1(sTNFR1)或肿瘤坏死因子受体2(sTNFR2)稀释至5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶联板，4℃孵育过夜；200μl/孔加入1％的明胶或BSA，室温孵育1h；分别在不包被孔、包被sTNFR1的孔或sTNFR2孔中加入滴度为10⁹pfu/ml的噬菌体克隆，使其结合，并以无关噬菌体作为阴性对照，室温结合1h，每个样品设三个平行；用PBST(0.05-0.1％Tween)洗涤三次；加入一抗(抗pVIII多抗兔血清1∶5000-1∶8000稀释)，100μl/孔，室温孵育30-60min；用PBST洗涤六次；加入酶标羊抗兔IgG(按产品说明书要求进行稀释)，100μl/孔，室温孵育30-60min；用PBST洗涤六次；加入底物显色系统A+B(现用现配)等比例混合，100μl/孔，反应10-15min(避光)；加入终止液(1mol/L H₂SO₄)50或100μl/孔，测定OD₄₅₀。

结果如图1-A，1-B所示，0表示无关噬菌体，1、2、3、4、5、6分别表示1、2、3、4、5、6号肽所对应的噬菌体克隆，用最后测得的包被孔OD₄₅₀减去相应不包被孔的OD₄₅₀作图。从图1-A可以看出，噬菌体克隆能够与sTNFR1特异性结合；从图1-B可以看出，噬菌体克隆与sTNFR2结合能力较弱。ELISA结果说明本发明筛选得到TNFR1特异性的结合肽配基。

实施例4、融合肽的竞争性受体结合抑制实验

用PBS将纯化的sTNFR1稀释至终浓度为5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶联板，4℃孵育过夜；200μl/孔加入1％的明胶或BSA，室温封闭1h；分别用终浓度为20μg/ml和1mg/ml的TNF-α，与20μg/ml的实施例1中2、3、4、6号肽与谷光甘肽S转移酶(GST)的融合肽混合，100μl/孔与包被在板上的sTNFR1竞争结合，以GST为阴性对照，室温结合1h；用PBST(0.05-0.1％Tween)洗涤三次；100μl/孔加入一抗(抗GST单抗1∶2000稀释)，室温30-60min，用PBST洗涤六次；100μl/孔加入酶标二抗(按说明书要求进行稀释)，室温30-60min，用PBST洗涤六次；100μl/孔加入底物显色系统A+B等比例混合，10-15min(避光)加入终止液(1mol/L H₂SO₄)50或10μl/孔；测定OD₄₅₀。结果如表1所示：

表1  GST融合肽与不同浓度TNF-α竞争结合sTNFR1的ELISA结果，

          样  品            样  品                 样  品

                         +20μg/ml TNF-α                +1mg/ml TNF-α2号肽      0.3397±0.0060    0.2793±0.0186         0.1920±0.00693号肽      0.9960±0.0185    0.8036±0.0142         0.7006±0.02774号肽      1.1640±0.0174    1.0370±0.0165         0.6657±0.01756号肽      0.8197±0.0520    0.7180±0.0170         0.5247±0.0255GST        0.2140±0.0052    0.2477±0.0216         0.1587±0.0170

从表1中可以看出，与GST对照相比，四种GST融合肽均能与sTNFR1特异性结合，不同浓度的TNF-α可以竞争它们的结合，并且呈一定的浓度梯度关系。说明通过生物淘选和富集，从噬菌体随机十二肽库中筛选得到了与TNFR1特异结合的结合肽，并能竞争TNF-α与TNFR1的结合。

实施例5、GST融合肽的放射性受体结合分析

在可拆卸酶联板中加入60μl封闭液(含有1％BSA的PBS)对实施例1中2、3、4、6号四种GST融合肽和GST对照进行系列倍比稀释，然后加入60μl/孔¹²⁵I-TNF，混匀后取25μl/孔加入到包被受体的平板上，室温反应2.5h。用封闭液充分洗涤后，在γ计数器中测定放射强度，每个样品做三个平行孔，以BSA作为对照。抑制百分数＝[(cpm_BSA-cpm_样品)/cpm_BSA]×100％

如图2所示，GST融合肽都可以特异性地抑制TNF-α与sTNFR1的结合，IC₅₀值约为70-200μmol/L。证明所筛选的亲和肽能够特异性地与TNF受体的配体结合部位结合，从而抑制TNF-α与sTNFR1的作用。

实施例6、融合肽对TNF细胞毒活性的抑制实验

将实施例1中2、3、4、6号肽的四种噬菌体单克隆扩增和纯化，用PBS溶解，除菌后稀释成不同浓度梯度；将MCF-7细胞5×10⁴cells/孔，50μl/孔传于96孔板，37℃，5％CO₂贴壁生长3h；每孔中加入50μl含放线菌素D(终浓度为1μg/ml)的DMEM/5％FBS；加入50μl浓度对MCF-7细胞有不同杀伤效率的TNF-α(选用杀伤率为30％的浓度)，和50μl经DMEM/5％FBS稀释的不同浓度的噬菌体单克隆，每个样品设三个平行点，37℃，5％CO₂孵育18-24h；轻轻去掉培养基，用PBS洗2至3次；作为调零的孔用0.2mol/L NaOH裂解细胞，并用PBS洗2次；每孔加入100μl含0.5％结晶紫的20％乙醇溶液，37℃孵育15分钟；倒掉染料，用自来水冲洗，尽量去除多余的结晶紫，测定OD₅₉₅或每孔加入100μl 30％HAC溶解结晶紫后，测定OD₅₉₅。以加TNF-和加含放线菌素D的孔作为阴性和空白对照，以野生型噬菌体M13KE作为对照，计算抑制百分数，抑制百分数＝[(OD_样品-OD_TNF-)/(OD_空白-OD_TNF-)]×100。如图3所示的结果表明，噬菌体克隆对TNF-α的活性有比较显著的抑制作用。

Claims (10)

1、肿瘤坏死因子受体亲和肽，它的氨基酸残基具有以下通式：

A-B-C-E-F-G-H-I-J-K-L

其中，

A、C均代表芳香族氨基酸；

B代表组氨酸；

E代表色氨酸；

F代表芳香族氨基酸或含羟基氨基酸；

G、H、I、J、K、L代表任意氨基酸。

2、根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽，其特征在于：在所述氨基酸残基序列的C与E之间设有氨基酸残基D，D代表含羟基氨基酸。

3、根据权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽，其特征在于：所述芳香族氨基酸A、C为色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸中的一种，其中优选的是色氨酸。

4、根据权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽，其特征在于：所述氨基酸残基G代表含羟基氨基酸。

5、根据权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽，其特征在于：所述氨基酸残基H代表脯氨酸。

6、根据权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽，其特征在于：所述氨基酸残基I、J、K、L代表含羟基氨基酸、酪氨酸、精氨酸或脯氨酸中的一种。

7、根据权利要求2所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽，其特征在于：所述亲和肽为下述多肽之一：

FHWWLSPPSRV

FHWSWYTPSRPS

WHYSWFSPYRTS

WHWTWLSEYPPP

WHWSWIQNAAPN

WHWSLWRPPYTL

8、以权利要求1所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽为活性成分的药物。

9、以权利要求1所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽为活性成分的药物。

10、权利要求1或2所述的肿瘤坏死因子受体亲和肽在纯化和检测TNF受体中的应用。

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