CN1379110A - 一种生产3－羟基癸酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产3－羟基癸酸的方法,其目的是提供一种工艺简单,具有一定生产效率的制备3－羟基癸酸的方法。本发明的技术方案是发酵培养含有基因phaG的重组微生物菌株而获得3－羟基癸酸。实现本发明方法的具体步骤可以是:(1)将基因phaG克隆到质粒中构建出新质粒;(2)将所构建质粒转到菌株中构建DNA重组菌株;(3)培养重组菌株获取3－羟基癸酸。本发明运用基因工程及微生物发酵相结合的方法,创造性地使一步法直接生产3－羟基癸酸得以实现。简化了从聚合物降解获得3－羟基癸酸的生产工艺,提高了生产效率,具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产3-羟基癸酸的方法，属基因工程及微生物发酵领域。
背景技术
传统的生产3-羟基癸酸的方法一种是化学合成法，另一种是先采用微生物合成(R)-3-羟基辛酸和-(R)-3-羟基癸酸的共聚物(Poly(3-hydroxyoctanoate-co-3-hydroxydecanoate)或PHOD)，然后降解该聚合物得到产品。由于上述两种方法的工艺均较复杂，生产投入大，分离困难，使3-羟基癸酸的生产成本较高。
基因phaG编码催化由(R)-3-羟基癸酰-酰基转移蛋白向(R)-3-羟基癸酰辅酶A转化的(R)-3-羟基癸酰-酰基转移蛋白：辅酶A转酰基酶，单独运用辅酶A转酰基酶即能够催化(R)-3-羟基癸酰-酰基转移蛋白向(R)-3-羟基癸酰辅酶A转化，进而生成3-羟基癸酸。基因phaG来源是很广泛的，它们可以来自绝大多数假单孢菌以及伯克霍尔德氏菌等多种微生物，比如Genebank上的AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF052507、AF169252、AF209711(Genebank登陆号)等。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，具有一定生产效率的制备3-羟基癸酸的方法。
一种生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于发酵培养含有基因phaG的重组微生物菌株而获得3-羟基癸酸。
基因phaG的来源选择范围很宽，具有前述功能的微生物基因均可以选择作为phaG的来源。所述基因phaG可以选自下述序列家族中的一种：AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF052507、AF169252、AF209711。
所述重组微生物菌株优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌选自JM109、HB101、DH5α或野生型菌株。
实现本发明方法的具体步骤可以是：(1)将基因phaG克隆到质粒中构建出新质粒；(2)将所构建质粒转到菌株中构建DNA重组菌株；(3)培养重组菌株获取3-羟基癸酸。
所述重组菌株的培养温度较适宜的为28-42℃；培养的pH值较适宜的为4.5-7.2。
用分批培养的方式或流加(fed-batch)培养的方式及补加三氯生培养的方式培养所述重组菌株均会取得较好的效果。
本发明巧妙地运用基因phaG编码催化由(R)-3-羟基癸酰-酰基转移蛋白向(R)-3-羟基癸酰辅酶A转化的(R)-3-羟基癸酰ACP：辅酶A转酰基酶，单独运用即能够催化(R)-3-羟基癸酰ACP向(R)-3-羟基癸酰辅酶A转化，进而生成3-羟基癸酸的原理，运用基因工程及微生物发酵相结合的方法，创造性地使一步法直接生产3-羟基癸酸得以实现。简化了从聚合物降解获得3-羟基癸酸的生产工艺，提高了生产效率，降低了传统化学合成对设备的高要求，简化了繁琐的工艺流程，省去了手性分离的复杂过程，因此可以使3-羟基癸酸的生产成本得到大幅度降低。同时利用本发明的方法生产3-羟基癸酸还解决了由于化学合成和手性分离带来的环境污染问题。
本发明所涉及的质粒构建与重组菌株筛选均采用现有基因工程操作的方法，包括对含有基因phaG的DNA片段和所用质粒进行PCR扩增，限制酶切割，连接酶连接，质粒转化，重组菌株筛选，重组菌株的培养，产物合成的确认及高性能重组生产菌株的获得等。发酵过程中不需购置新的设备，既可以采用微生物常规工业发酵方法，也可以采用自动控制为基础的流加发酵法。
下面结合附图对本发明的具体实施例做进一步说明。
附图说明
图1为质粒pLZZGPp的构建图。
具体实施方式
实施例1、重组大肠杆菌E.coli的获得
菌种：大肠杆菌E.coli HB101
基因：基因phaG为AF052507。
质粒构建：如图1所示，从含有基因phaG的质粒中，采用PCR方法得到phaG的基因片断，限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切后片段插入质粒载体pBluescriptSK-中。所得到的质粒pLZZGPp含有位于启动子lac下游的基因pbaG。所用引物为：上游引物：5’-GGT TCTAGACTGCAGGAGTCGATGACATGAGGC-3’；下游引物为：5’-TCCAAGCTTCCCGGGCTCAGATGGCAA ATGCATG-3’。
培养基为LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10；或矿物培养基(g/L)：4.5 Na2HPO4.2H2O，1.5 KH2PO4，0.5(NH4)2SO4，0.2 MgSO4，0.05Fe(III)-NH4-Citrate(17％)，0.02 CaCl2·2H2O以及SL-6微量元素。为了维持质粒在重组菌中的传代，应加入100mg/L氨卞青霉素。碳源可以选择葡萄糖或果糖，浓度根据需要而定。
质粒转化：用电击转化法或化学转化法将质粒转入菌株E.coli。
在该实施例中，大肠杆菌E.coli还可以选自JM109，DH5α以及野生型大肠杆菌如AB1157等，phaG还可以是AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF169252、AF209711，但构建基因重组菌株的方法和步骤是相同的。
实施例2、以葡萄糖为碳源利用重组大肠杆菌在LB培养基上合成3-羟基癸酸
菌种：含质粒pLZZGPp的重组大肠杆菌HB101，(质粒中基因phaG为AF052507)
质粒转化方式：电转化法
培养温度：37℃
培养基：LB培养基
初始pH：7.2
培养48小时后pH：4.5
发酵时间：48小时
搅拌转速：200rpm
工艺流程如下：将种子液接入加有灭菌发酵液的摇瓶中，接种量为每100毫升发酵液接入2毫升种子液。葡萄糖起始浓度5g/L。9小时后加入1mMIPTG，12小时后加入15g/L葡萄糖。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到细胞干重和3-羟基癸酸含量等有关数据。
分析结果表明，48小时后得到3-羟基癸酸含量为196mg/L。
实施例3、以果糖为碳源利用重组大肠杆菌在LB培养基上合成3-羟基癸酸
菌种：含质粒pLZZGPp的重组大肠杆菌HB101，(质粒中基因phaG为AF052507)
质粒转化方法：电击转化法
培养温度：37℃
培养基：LB培养基
初始pH：7.2
培养48小时后pH：5.0
发酵时间：48小时
搅拌转速：200rpm
工艺流程如下：将种子液接入加有灭菌发酵液的摇瓶中，接种量为每100毫升发酵液接入2毫升种子液。果糖起始浓度5g/L。9小时后加入1mMIPTG，12小时后加入25g/L果糖。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到细胞干重和3-羟基癸酸含量等有关数据。
分析结果表明，48小时得到3-羟基癸酸678mg/L。
实施例4、补加三氯生(triclosan)为添加剂，以果糖为碳源利用重组大肠杆菌在LB培养基或矿物培养基上合成3-羟基癸酸
菌种：含质粒pLZZGPp的重组大肠杆菌HB101，(质粒中基因phaG为AF052507)
质粒转化方法：电击转化法
培养温度：35℃
培养温度：37℃
培养基：LB培养基或矿物培养基
初始pH：7.2
培养48小时后pH：5.0
发酵时间：48小时
搅拌转速：200rpm
工艺流程如下：将种子液接入加有灭菌发酵液的摇瓶中，接种量为每100毫升发酵液接入2毫升种子液。果糖起始浓度5g/L。9小时后加入1mMIPTG，12小时后加入15g/L果糖，24小时后加入0.1mg/L三氯生。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到细胞干重和3-羟基癸酸含量等有关数据。
分析结果表明，48小时得到3-羟基癸酸342mg/L(矿物培养基上)及722mg/L(LB培养基上)。
Claims (8)
1、一种生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于发酵培养含有基因phaG的重组微生物菌株而获得3-羟基癸酸。
2、根据权利要求1所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：所述基因phaG选自下述序列家族中的一种：AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF052507、AF169252、AF209711。
3、根据权利要求1所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：所述重组微生物菌株为大肠杆菌。
4、根据权利要求1或2或3所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)将基因phaG克隆到质粒中构建出新质粒；(2)将所构建质粒转到菌株中构建DNA重组菌株；(3)培养重组菌株获取3-羟基癸酸。
5、根据权利要求4所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：所述重组菌株的培养温度为28-42℃。
6、根据权利要求4所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：所述重组菌株的培养pH值为4.5-7.2。
7、根据权利要求4所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：用分批培养的方式培养所述重组菌株。
8、根据权利要求4所述的生产3-羟基癸酸的方法，其特征在于：用补加三氯生培养的方式培养所述重组菌株。
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