CN1368887A - 与PEG－IFN－α结合的霉酚酸酯Mofetil - Google Patents

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Abstract

治疗有效量的IFN－α或PEG－IFN－α与治疗有效量的霉酚酸可作药用的盐或其前药的结合使用制备治疗肝病的药物。一段时期内服用该药,在结束治疗后24周,至少可将该病人外周血中HCV－RNA的含量降到低于100拷贝/毫升的水平。

Description

与PEG-IFN-α结合的霉酚酸酯Mofetil
发明领域
本发明涉及通过服用(i)α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素和(ii)霉酚酸可作药用的盐或其前药治疗肝脏疾病，尤其是丙型肝炎。
发明背景
丙型肝炎病毒(HCV)使肝脏受到损伤性感染，这种感染可造成肝硬化，肝功能异常或肝癌。据目前估计全世界有1.7至2亿人感染了这种病毒。
干扰素(IFNs)是一族天然存在的有诸如抗病毒，免疫调节和抗肿瘤这些特征性生物功效的小蛋白和糖蛋白，作为对一些疾病的反应，特别是对病毒感染的反应，大多数动物有核细胞可产生和分泌干扰素。
干扰素系统的意义不仅仅在更多的抗病毒保护机制方面，它还有比此更广的意义。在许多病毒性的、恶性的、血管原的、过敏性的、炎性的和纤维化的不同疾病方面，都可显示出IFNs的意义(A.Billiau(1984)，Elsevier Sciences Publisher B.V.，VOL.，25-28)。
人类干扰素的四种不同种类已有描述(Peska等，(1987)，Ann.Rev.Biochem，56，727-777和Emanuel和Peska(1993)，J.Biol.Chem.，268，12565-12569)。从自然资源中提纯IFNs以及利用重组DNA技术制备IFNs已经成为许多出版物的主题。重组干扰素的制备方法是已知的，例如见《自然》295，(1982)，503-508，《自然》284，(1980)，320-326，《自然》290，(1981)，20-26，Nucleic Acids Res.8(1980)，4057-4074，也可见欧洲专利Nos.32134，43980和211148。
在IFNs家族中，IFN-α是IFNs的优势种类，它可以通过刺激外周血白细胞(Peska等，loc.cit.；Have等，(1975)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72，2185-2187；Cavalieri等，(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，3287-3291)，和类淋巴母细胞与类成粒细胞系(Familletti等，(1981)，Antimicrob.Agents.Chemother.，20，5-9)而产生。作为生长和分化的重要调节因子，IFN-α影响细胞通讯和免疫控制。在治疗慢性肝炎如慢性丙型肝炎方面常常用到IFN-α。
事实上，对慢性丙型肝炎病毒感染(CHC)的治疗，IFNs方法是唯一获得承认的单疗法。治疗的目标是为了在结束治疗后6个月获得可持续性病毒反应(外周血中检测不到丙型肝炎病毒RNA，(HCV-RNA)＜100拷贝/毫升)。然而，在治疗慢性丙型肝炎病毒感染方面，干扰素所发挥的效力还不能令人满意，在总的CHC群体中仅有5-20％用IFN-α单疗法导致了持续性反应的发生(Fried等，(1995)，“丙型肝炎的疗法”，Semin.LiverDis.，15(1)，82-91)。此外，在治疗初期IFNs通常产生类似流感的症状。
主要由于IFNs能被很快地从系统中清除掉，所以有理由相信IFNs不会获得最大临床应用潜力。已经发现结合有聚乙二醇(PEG)的IFN-α降低这种清除作用，而且在II期研究中，最近显示一种PEG IFN-α2A的共轭物可造成病毒持续性下降，在非硬化CHC中36％已经降到了检测不到的水平(Shiffman M，Pockros PJ，Reddy Rk等，“聚乙二醇化α-2A干扰素(PEG)与标准干扰素(IFN)在治疗慢性丙型肝炎方面的随机、对照、多中心、升高剂量II期试验”，Gastroneterology 1999，116(pt2)：1275.Abstract LO418)。在随后对硬化的CHC病人进行III期研究中，证实29％有持续性病毒反应。(Heathcote J，Shiffman ML，Coolsley G，等，“对代偿性肝硬化CHC患者每周一次用α-2A干扰素(PEG-IFN)的效力和安全性进行多种民族评估”《肝病学》(Hepatology)1999，30(增刊)：316A)。
霉酚酸(MPA)是一活性剂，它通过非竞争和可逆性抑制肌苷单磷酸脱氢酶(IMP-DH)抑制B和T淋巴细胞的增生。IMP-DH是鸟嘌呤核苷酸体内合成途径的关键酶。霉酚酸酯mofetil，MPA的吗啉代乙基酯前药，已经被证实作为一种免疫抑制剂在排异反应的治疗中特别是在肝移植受体中发生作用。它已被单独使用或和环胞苷菌素A和皮质甾类结合使用(J.Neyts and E.declercq，(1998)，Antiviral Research 40，53-56；Gong等，“免疫抑制剂对HBV体外复制的影响”和K.P.Platz等，(1998)，Elsevier Science Inc.，2232-2233)。
IFN-α与霉酚酸可作药用的盐或前药的结合可能在治疗肝病，尤其是慢性病毒性丙型肝炎方面发挥重要作用。
发明的概要
本发明提供了利用IFN-α与霉酚酸的可作药用的盐或其前药的结合来制备治疗肝病的药物。本发明还涉及含有IFN-α和霉酚酸的可作药用的盐或其前药的目的药物，它作为同时、部分同时，分别或依次给药的结合制剂被用于肝病的治疗。最后，本发明还涉及治疗肝病患者方法，该方法包括用IFN-α和MPA或其前药，例如霉酚酸酯的结合对病人用药。
实际应用该项发明结合疗法的IFN-α的剂量是3-6百万国际单位，每周用药三次。本发明中结合疗法的实际应用较好的剂量是每周用药三次，3百万国际单位。实际应用本发明结合疗法的PEG-IFN-α的剂量是40-270μg，每周一次。较好的剂量选择是180μg，一周一次。实际应用本发明MPA或其前药或可作药用的盐(例如MMF)的剂量是每天用药250-2000mg，较好的选择剂量500-1000mg。日用药剂量可每天分成2-4次服用。
换算的结果：1mg IFN-α为2.7×108国际单位。因此，3百万国际单位IFN-α为11.1μg IFN-α。
本发明尤其涉及将IFN-α与霉酚酸的可作药用的盐或其前药结合用于被HCV感染的患者，以降低病毒感染的严重程度。该用途包括给患者结合服用第一和第二两种组分，其中第一组分由药物组合物构成。该组合物含有MPA的前药或可作药用的盐作为活性成分，其含量为治疗上有效降低病毒感染的严重程度，且第二组分由注射溶液组成，该注射液含有IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α共轭物作为活性成分，其含量为治疗上有效降低病毒感染的严重程度。上述组分应至少服用一段时间，以保证在该段时间后该病人外周血中HCV-RNA的含量降到低于100拷贝/毫升的水平。
更具体地，本发明涉及用IFN-α与霉酚酸的可作药用的盐或其前药的结合来治疗丙型肝炎病毒感染的患者。该用途包括给患者结合服用：(i)由药物组合物构成的第一组分，该药物组合物含有作为活性成分的下式化合物的可作药用的盐：
Figure A0081139700091
或下式化合物
Figure A0081139700092
其中Y是
Figure A0081139700093
Z是氢或-(CO)R，R是低级烷基或芳基。其中足够药量的第一组分是按每日约250-2000mg的量给药。
(ii)由注射液构成的第二组分，该注射液含有作为活性成分的α-干扰素或聚乙二醇化的α-IFN共轭物，其中第二组分的活性成分，每周服用三次，每次3-6百万国际单位。所述组分在约24-72周时期内被结合服用。
意外地发现服用本发明两种组分导致外周血中HCV-RNA的含量在例如停止服药后24周降至低于100拷贝/毫升的水平。
另一方面，本发明涉及到一药盒，该药盒中含有第一组分和第二组分，第一组分含有一种或多种口服单位剂量形式的活性成分，每个单位含有活性成分约250-2000mg，该活性成分是MPA可作药用的盐或其前药。第二组分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有单个或多个注射液剂量，每剂量中含有活性成分α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素约40-270μg。
具体地，本发明涉及含有第一组分和第二组分的药盒，第一组分含有一种或多种口服单位剂量形式的活性成分，每个单位含有活性成分约250-2000mg，该活性成分为具有下面通式的化合物，
Figure A0081139700101
其中Y是Z是氢。第二组分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有单个或多个注射液的剂量，每剂量中含有约40-270μg聚乙二醇化的α-干扰素共轭物作为活性成分。本发明的详细描述
MPA是一具有如下通式的已知化合物，
Figure A0081139700111
由药物组合物构成的本发明第一组分含有作为活性成分的MPA前药或其可作药用的盐，其含量为降低病毒感染的严重程度的治疗有效量。
这里所用的术语“MPA可作药用的盐”是指任一常规盐或碱加盐，它保留有生物学的效力和MPA的特性，并由一合适的无机或有机酸或有机或无机碱形成。优选的是阳离子盐，例如，碱金属的盐，特别是钠盐。霉酚酸钠是已知的，例如见WO97/38689
这里所用的术语“MPA前药”是指在生理条件下，被转化成MPA或可通过溶剂分解后转化成MPA的化合物，MPA的前药在治疗时可能不具有活性，但是在体内可转化成MPA。
优选的MPA前药是下式化合物：
Figure A0081139700121
其中Y是
Figure A0081139700122
Z是氢或-(CO)R，R是低级烷基或芳基。
这些化合物可从美国专利4753935中获知，该美国专利特此以参考文献的方式并入本文，最优选的是MMF化合物(Z是氢)。
由注射液构成的第二组分，含有活性成分IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α共轭物，在疗效剂量下降低病毒感染的严重程度。
本文所用的术语“IFN-α”指源于任何天然材料(例如，白细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)或由此衍生来的材料(例如细胞系)或那些用重组DAN技术制备的材料。IFN-α克隆和由此进行的直接表达，尤其是在大肠杆菌中表达，在许多出版物中均有详细记载。IFN-α的制备方法是已知的，例如见Goeddel等，(1980)，《自然》284，316-320和(1981)，《自然》290，20-26，和欧洲专利Nos.32134，43980和211148。IFN-α有许多种形式，象IFN-αI，IFN-α2及进一步的它们的亚型，包括但不限于IFN-α2A，IFN-α2B，IFN-α2C和IFN-α2II(也称作IFN-αII或w-IFN)。本发明中优先使用IFN-α2A。IFN-α2A的制备在欧洲专利NOs.43980和211148中已有描述。
本发明中用到的IFN-α可和聚合物如聚二醇(取代的或未被取代的)结合，例如聚乙二醇，形成PEG-IFN-α。可利用现有技术中各种已知的连接物完成结合，尤其是在欧洲专利申请公开号0510356和593868以及欧洲专利申请号97108261.5中已公开的那些连接物。聚合物优选聚乙二醇的分子量在300-30000道尔顿，且一个或多个聚合物，优选1-3个聚合物和IFN-α结合。
更优选的是反应物连到例如赖氨酸的伯氨基上或IFN-α的N末端。反应物也可连到例如丝氨酸的羟基上，一个或多个PEGs结合到IFN-α，优先选用的是1到3个。
更优选的是具有下面通式的反应物，
Figure A0081139700131
其中共两个单甲氧基PEG(m-PEG)链和赖氨酸相连，一个经氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)键连在α和ε氨基上，并且赖氨酸羧基被激活成琥珀酰亚氨基酯。该反应物可通过常规方式，利用已知的方法获得(Monfardini等，“用于蛋白质修饰的支链单甲氧基聚乙二醇”，Bioconjugate Chem.6：62，1995)。该已知方法适用于其中R为低级烷基且具有所需数目n的反应物。反应物可从Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Alabama)获得。优选的PEG平均分子量约是20000道尔顿，在PEG2-NHS中提供的PEG总质量大约为40000道尔顿(其它的分子量可通过常规方式，改变作为上式反应物的PEG-乙醇起始物的n的数值获得)。
优选具有下面通式的聚乙二醇化的IFN-α共轭物：
其中R和R′分别是低级烷基，x是NH或O，n和n′是其和为600-1500的整数，在所述共轭物中聚乙二醇的平均分子量约26000-66000道尔顿。最优选的是具有下式的聚乙二醇化的α-干扰素：
Figure A0081139700142
其中n和n′分别为420或520。该聚乙二醇化的IFN-α共轭物是已知的，例如见欧洲专利申请EP809996，该专利以参考文献的方式并入本文。
实际中应用本发明，是给肝病患者服用IFN-α和霉酚酸可作药用的盐或其前药。
特别指出的是，本发明中已经描述了IFN-α与霉酚酸可作药用的盐或其前药的结合，该结合对治疗病毒感染是有效的，尤其是对慢性丙型肝炎。
根据本发明，通过分别用药，霉酚酸可作药用的盐或其前药和IFN-α的结合用药协同促进了慢性丙型肝炎的治疗，这种协同效应导致可持续性反应。“可持续性反应”意味着以HCV-RNA拷贝数表示的外周血中HCV的量例如在结束用两种组分后24周时低于100拷贝/毫升。
以外周血中HCV-RNA拷贝数/毫升表示的外周血中HCV的量由已知的方法测定，用于测定含量的体外诊断药盒可商业性的购得。例如AmplicorHCV Monitor Test(定量检测敏感度至1000拷贝/毫升)，AmplicorHepatitis C Virus(HCV)Test(定量检测敏感度至100拷贝/毫升)，CobasAmplicorTM Hepatitis C Virus Test(自动定量检测敏感度至100拷贝/毫升)，Cobas AmplicorTM HCV Monitor Test(自动定量检测敏感度至1000拷贝/毫升)(每种药盒都可从罗氏诊断系统公司(Branchburg，NJ))，实施例中已给出用于测定含量的优选方法。
IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α的注射液通过肠道外途径给药，优先选用的是皮下注射(sc)或肌肉注射(im)。优选的是MPA可作药用的盐或其前药以口服单位剂量形式，更优选的是以胶囊，丸剂，袋剂或片剂的形式用到病人身上，同时结合IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α的非肠道用药。
当然，两种药物的其它服用方式，例如通过鼻喷、经皮、栓剂、缓释药剂形式等等，也在被考虑使用。只要适当的剂量在输送过程中没有被破坏活性成分，则任何一种用药方式都可发挥作用。
可以有效降低丙型肝炎感染严重程度的任何数量和任何期间服用本发明的组分。
一般说来，在约24周到约72周的一段时期内，第一组分和第二组分一起服用是优选用的用药方式，较好的时间在约24-48周，最优选的时间是约48周。
一般来说，注射液的活性成分(IFN-α或聚乙二醇化的IFN-α)的剂量约0.5-3.6μg/kg体重，每周用药一次。一般情况下，MPA可作药用的盐或其前药的剂量约3-40mg/kg体重，优选用5-36mg/kg体重，最优选的是12-25mg/kg体重，每日用药。根据病人的需要和病人治疗后的反应，该剂量水平可由医生来调整，或高或低于这里所述的剂量。
根据病人需要，可按医生开出的任一药单的剂量形式服用该药。例如两种组分每种药剂可以单剂量或多剂量形式服用。
治疗有效量的IFN-α或PEG-IFN-α与治疗有效量的MPA或其一前药或可作药用的盐(例如MMF)可以同时、部分同时、分开或依次服用。治疗有效量的MPA或其一前药或可作药用的盐(例如MMF)与治疗有效量的IFN-α或PEG-IFN-α可结合使用。IFN-α或PEG-IFN-α的服用可在病人服用MPA或其一前药或可作药用的盐(例如MMF)的同一时期或不同时期。
本发明提供了一种对治疗丙型肝炎病毒有用的药盒。该药盒含有第一组分和第二组分，第一组分含有一种或多种口服单位剂量形式的活性成分，每个单位含有活性成分约250-2000mg(优先选用的是500-1000mg)，其中活性成分是MPA的可作药用的盐或其前药。第二组分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有单个或多个注射液的剂量，每剂量中含有约40-270μg(优先选用的是180μg)的活性成分α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素共轭物。
优选的是，第一组分含有足够量单位以致于病人在约1-4周的期间内每天服用的活性成分量约为2g。并且第二组分含有足够的剂量以致于在约1-4周的期间内每周服用约为180μg的α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素共轭物。
优选的是，第一组分的活性成分是有如下通式的霉酚酸酯mofetil：其中Y是
Figure A0081139700172
Z是氢或-(CO)R，R是低级烷基或芳基。
最优选的是，第一组分的活性成分是下面通式的化合物：
Figure A0081139700181
其中Y是
Figure A0081139700182
和Z是氢。
优选的是每一注射液剂量的活性成分是聚乙二醇化的α-2a干扰素共轭物，更优选下式聚乙二醇化的α-2a干扰素共轭物：
Figure A0081139700183
其中R和R′分别是低级烷基，x是NH或O，n和n′是其和为600-1500的整数。在所述的共轭物中聚乙二醇的平均分子量约26000-66000道尔顿。
最优选的是，每一注射液剂量的活性成分是下式聚乙二醇化的α-2a干扰素共轭物：其中n和n′独立地为420或520。
如下面的实施例所示，通过对照的临床实验举例说明本发明。这些实施例仅在于说明，而不是限定本发明。
实施例患者
60位患者接受治疗，所有的患者都有HCV的血清证据。血清HCV-RNA的可测量＞2000拷贝/毫升。已证明在开始服用试验药物前35天具有升高的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。并且经在开始服用实验药物前24个月内获得的活检结果证实有对应于慢性HCV感染的慢性肝病。
患者最好没有其它形式的肝病(包括硬化)、贫血、肝细胞癌、先天性严重抑郁症或其它的精神病、心脏病、肾病、癫痫失控或严重的视网膜病。药物制剂制剂1片剂
成分 mg/片
MMF 500.00
微晶纤维素 244.00
交羧酸甲纤维素钠 32.50
聚乙烯吡咯酮K90 24.40
硬脂酸镁 12.20
总数 813.10
纯水 足量
制剂2
成分 每毫升单位配方
聚乙二醇化的α-2a-干扰素本体溶液1 360g
氯化钠2 8.0g
苯甲醇 10.0mg
三水合乙酸钠 2.617mg
乙酸(冰的)2 0.0462mg
多聚山梨酸酯80  0.05mg
三水合乙酸钠10％3 足量至pH6.0 0.2
乙酸10％3 足量至pH6.0 0.2
注射水4 足量至1.0mL(1.004g4)
1Bulk PEG-IFN以水溶液的形式提供在20mM醋酸钠中，缓冲pH值为6，含50mM氯化钠，所需的量是根据实际蛋白含量和原药物质的实际密度计算出来。理论上PEG-IFN的含量是1.3mg/mL，理论密度为1.002g/mL。2氯化钠的量必须校正，且醋酸钠和冰醋酸已包括在原药中。3等量的不同浓度的也可用。4药溶液密度(20C)是1.004g/mL。治疗
每位患者口服制剂1，每天两次，用48周。另外，每位患者皮下注射制剂2，每周一次，用48周。基本效能参数
基本效能参数是可维持病毒反应的比例(在24周治疗结束后随访期间检测不到HCV-RNA(＜100拷贝/毫升))。
为了检测HCV-RNA，首先从血清或血浆中分离出HCV-RNA，它是通过用离液剂裂解病毒颗粒，然后用乙醇沉淀RNA而完成。在有溶菌试剂下，第二种目标序列(标准物)被引进。优选的是，该标准物是非感染性的，351个核苷酸体外转录的RNA分子，其引物结合区与HCV靶序列的结合区相同。优选的是，这一标准物含有KY78和KY80引物结合区，并且与HCV靶RNA一样产生相同长度(244碱基)产物及碱基组成。从HCV靶扩增子标准扩增子的探针结合区域被扩增分化成标准扩增子。标准物要经历样品的制备，反转录，扩增和检测这几步，标准物弥补了抑制的影响并且控制扩增过程以容许HCV-RNA的精确定量分析。
为HCV选择靶RNA序列取决于从HCV基因组中鉴别出在各种HCV基因型中显示最大保守性的区域。在已知的HCV基因型中，HCV基因组5’非翻译区已经显示了有RNA序列的最大保守性。优先使用的是引物KY78和KY80来确定在HCV基因组高度保守的5’非翻译区244个核苷酸序列(Young，K.，Resnick和Myers，T.，1992，“结合反转录酶—聚合酶链式反应试验检测丙型肝炎病毒RNA”，《临床微生物学杂志》，31：882-886)。捕获探针序列和引物序列被定位在5’非翻译区最保守的区域(Bukh，j.，Purcell，R.H.和Miller，R.H.，1992，“丙型肝炎病毒5’非编码序列分析”，《国家科学院学报》，美国，89：4942-4946)。
反转录和扩增反应在热稳定重组酶嗜热菌DNA聚合酶(rTth pol)作用下发生，在镁离子和合适的缓冲液下，rTth pol聚合酶具有反转录酶和DNA聚合酶的活性，这就允许在同一反应混合物里反转录和PCR扩增都发生。
把已处理过的样品加到反应管里扩增混合物中，反应管中反转录和PCR扩增都在进行。下游或反义引物(KY78)在5’端被生物素化，上游或有意义引物(KY80)没有被生物素化。加热反应混合物以允许下游引物针对HCV靶RNA和HCV标准物RNA发生特异性退火，在脱氧三磷酸核苷酸(dNTPs)过量存在情况下，包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、脱氧尿苷(替代脱氧胸苷)三磷酸，rTth pol延伸已退火的引物以形成一DNA链(cDNA)互补于靶RNA。
随着HCV靶RNA和HCV标准RNA的反转录，反应混合物被加热以变性RNA：cDNA的杂交并且露出引物的靶序列。随着引物的冷却，上游引物(KY80)于cDNA链退火，rTth pol延伸引物，第二条DNA链被合成，完成了PCR的第一个循环，生成HCV和标准RNA靶区域双链DNA拷贝，反应混合物再次被加热分开已形成双链的DNA，并且露出引物的靶序列。随着混合物的冷却，引物KY78和KY80退火成靶DNA，在dNTPs过量存在情况下，rTth pol沿着靶模板延伸已退火的引物，产生244碱基对的双链DNA分子，命名为扩增子。按照设计的循环次数重复这一过程，扩增反应仅发生在HCV基因组上引物间的区域，整个HCV基因组并未被扩增。
利用尿嘧啶-N-糖苷酶，UNG和脱氧尿苷三磷酸(dNTP)，可获得临床样品靶核苷酸的选择性扩增。尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)识别和催化含有脱氧尿苷的DNA链的分解，而对含有胸苷的DNA无作用。自然存在的DNA中并不存在有脱氧尿苷，但由于在Master Mix试剂中利用脱氧尿苷酸而不是胸苷三磷酸作为一种dNTP，所以脱氧尿苷存在于扩增子里。因此，仅在扩增子里含有脱氧尿苷，脱氧尿苷使被污染的扩增子在靶DNA扩增子里易于被尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)破坏。Master Mix试剂中包括的尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)通过在C-1位置打开脱氧核糖链，催化含有尿苷残基的DNA在脱氧尿苷残基处裂解。当在第一个热循环步骤里于碱性pH Master Mix中加热时，扩增子DNA链在脱氧尿苷处被打断，从而使得DNA不可扩增。当温度高于55℃时，即在整个热循环过程中尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)没有活性，因而不能破坏靶扩增子。扩增后，通过加入变性溶液使任何残留的酶变性，因而阻止任一靶扩增子的降解。已证实在每一个PCR里至少有103拷贝的含有脱氧尿苷的HCV扩增子被尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)灭活。
PCR扩增后，加入变性溶液使HCV扩增子和标准扩增子被化学变性，形成单链DNA。将变性扩增子的等分试样加到覆有HCV-特异性(如KY150)和标准物-特异性(如SK535)寡核苷酸探针的微孔板的各个孔中，通过与MWP结合的寡核苷酸探针的杂交，HCV和标准扩增子分别被结合到HCV和标准物孔。为在大的动力学范围内获得定量结果，在MWP中分析变性扩增子的系列稀释液。
杂交反应之后，MWP被冲洗除去未结合的材料，并且生物素-辣根过氧化酶共轭物被加到MWP的各个孔中。生物素-辣根过氧化酶结合生物素标记的扩增子，该生物素标记的扩增子被结合到MWP上的靶特异性寡核苷酸探针(HCV或标准物)所捕捉。MWP再次被冲洗除去未结合的共轭物，含有过氧化氢和3，3’5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液被加到孔中，在过氧化氢存在下，结合的生物素-辣根过氧化酶催化TMB氧化形成有色的复合物。加入弱酸终止反应，并且利用自动微孔板读数器在450nm处测量出光密度。
在检测的线性范围内，MWP每孔中光密度(OD)值和孔中HCV扩增子或标准扩增子的含量成比例。相应地，计算的总OD值与每一反转录/PCR扩增反应中存在的HCV RNA或标准RNA的量成正比。从总HCVOD与总标准OD的比例和标准RNA的输入数，利用下面的公式可计算出各个样品中HCV-RNA的量。
Figure A0081139700251
其中总HCV OD＝计算的HCV扩增子总OD值总QS OD＝计算的QS扩增子总OD值输入的HCV QS拷贝数/PCR＝每个反应中QS拷贝数200＝转化拷贝数/PCR成拷贝数/毫升的因子数结果
通过用上述实施例中的所述两种配方给药，未曾预料地发现，接受治疗病人中有高于20％患者外周血中HCV-RNA的量在结束治疗后24周降到了低于100拷贝/毫升的水平。

Claims (20)

1.治疗有效量的IFN-α或PEG-IFN-α结合治疗有效量的霉酚酸可作药用的盐或其前药用于制备治疗肝病患者的药物。
2.根据权利要求1的用途，其中霉酚酸可作药用的盐或其前药的足够疗效量是每日约250-2000mg。
3.根据权利要求1的用途，其中IFN-α的足够疗效量是3-6百万国际单位，每周用药三次。
4.根据权利要求1的用途，其中PEG-IFN-α的足够疗效量是约40-270μg，每周一次用药。
5.根据权利要求1-4的用途，其中IFN-α是IFN-α2A。
6.根据权利要求1-5的用途，其中肝病是指病毒感染的肝病。
7.根据权利要求6的用途，其中病毒感染是慢性丙型肝炎。
8.根据权利要求1的用途，其中足够量的霉酚酸可作药用的盐或其前药的用药形式是口服。
9.根据权利要求1的用途，其中足够量的IFN-α或PEG-IFN-α是非肠道服用。
10.根据权利要求1-9的用途，其中首先用一部分治疗有效量霉酚酸可作药用的盐或其前药给药，接着用剩余的治疗有效量霉酚酸可作药用的盐或其前药和治疗有效量的IFN-α或PEG-IFN-α结合给药。
11.根据权利要求1-9的用途，包括在一给定时期内给病人结合服用两种药物组分，其中由药物组合物构成的第一组分含有治疗有效量活性成分霉酚酸可作药用的盐或其前药，用以降低病毒感染的严重程度，且由注射液构成的第二组分含有治疗有效量作为活性成分的IFN-α或PEG-IFN-α，用以降低病毒感染的严重程度，一段时期内该两种药物组分被结合服用后至少可满足该段时期后该病人外周血中HCV-RNA的含量低于100拷贝/毫升。
12.含有IFN-α或PEG-IFN-α与霉酚酸可作药用的盐或其前药的药物，作为结合制剂被同时、部分同时、分别或依次使用。
13.根据权利要求12的药物，其中IFN-α是IFN-α2A。
14.根据权利要求12的药物，其中PEG-IFN-α是PEG-IFN-α2A。
15.根据权利要求10-14的药物，其中肝病是指病毒感染的肝病。
16.根据权利要求14的药物，其中病毒感染是慢性丙型肝炎。
17.一种药盒包含：
(a)第一组分含有一种或多种口服单位剂量形式的活性成分，每个单位含有活性成分约250-2000mg，其中的活性成分是霉酚酸可作药用的盐或其前药，
(b)第二组分包含有一瓶或一系列瓶，每瓶中含有单个或多个注射液的剂量，每剂量中含有作为活性成分的IFN-α约3-6百万国际单位或约40-270μgPEG-IFN-α。
18.根据权利要求17的药盒，其中第一组分含有足够数量单位以致于病人在1-4周的时期里每天可服用约2g霉酚酸可作药用的盐或其前药，且第二组分含有足够的剂量以致于病人在1-4周的时期里每天可服用约180μgIFN-α或PEG-IFN-α。
19.根据权利要求17-18的药盒，其中每注射液剂量的活性成分是PEG-IFN-α。
20.治疗肝病患者以降低疾病严重性的方法，该方法包括将治疗有效量的α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素与治疗有效量的霉酚酸可作药用的盐或其前药的结合给病人服用。
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