CN1355254A - 石莲花多糖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保健食品、医药品领域的功能型食品或药品,还涉及到石莲花多糖(EGP)的提取、分离、纯化的操作技术,EGP不仅具有原始石莲花提取物的降血糖功效,而且本发明还发现了经提取分离或纯化的EGP都具有保肝、抗动脉硬化、减肥等功效。
Description
石莲花(Echevaria glsuca)是一种野生或人工栽培的肉质景天科常绿植物,最先发现其提取的混合组分具有高效降血糖功能(中国专利申请号为97100285.1)。经长期动物实验研究与临床发现,其有效组分中富含多糖,即石莲花多糖(Echevaria glaucapolysaccharides),简称EGP,现就EGP的提取分离,纯化和保肝以及抗动脉硬化(降血脂的功能),人群实验降低体脂肪(减肥)的效果,阐述如下:1、EGP的提取方法:
现将石莲花的根、茎、叶乃至全株或从石莲花原粉(按中国专利申请号为97100285.1方法提取)中分别用不同的方法提取石莲花多糖(EGP)。1.1实施例1
取洗净的鲜石莲花全株1kg,粉碎后,用石油醚(30-60)回流脱脂2h,残渣置于1升无离子水,煮沸0.5h,过滤,残渣继续重复上述操作3次,合并4次滤液,浓缩至小体积,加氯仿(A、R)至分层,沉淀弃蛋白,上层溶液浓缩至小体积,加无水酒精浓度调至95%,沉淀EGP,过滤,沉淀干燥。粗EGP产量:2.196g,收率2%。(见附图1-1)。1.2实施例2
取石莲花原粉200g溶于2升无离子水,加热煮沸5分钟,过滤,滤液浓缩至小体积,再用3%的三氯乙酸(V/V)沉淀蛋白,静置后离心,以200mol/L NaoH中和后,透析,浓缩,加放3倍体积乙醇,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,干燥,得到粗石莲花多糖(EGP)19.6g,为灰棕色粉末。取10g粗EGP溶于100ml无离子水中,进行DEAE-Cellulose柱层析(CI型,90cm×3.0cm)先用水洗脱,再以0.2mol/L NaCL梯度洗脱,水洗脱部分得到3.5g,NaCL洗脱部分得到6.02g,将9.52gEGP再经Sepharose 4B柱层析(50cm×2.0cm),用0.05mol/L Nacl洗脱,得到纯化的EGP占98g,产率为69.8%。1.3实施例3
取60g石莲花原粉,加入无离子水100ml,加热煮沸10分钟,冷却,过滤,保留,滤渣,重复上述操作2次,合并3次滤液浓缩至一定体积用酒精调至70%,沉淀蛋白、蛋白多糖、多糖,过滤,滤液再调至95%的酒精浓度,沉淀粗多糖,过滤,合并沉淀,烤干,得2.196gEGP,收率为10%。(见附图1-2)1.4实施例4
为了日常保健和用药剂量的方便,现按实施例1-3内容中收率关系,鲜石莲花、干石莲花、石莲花原粉、粗EGP、EGP重量关系对照表汇总于后(见表1-1)
表1-1
鲜石莲花(g) | 干石莲花(g) | 石莲花原粉(g) | 粗EGP(g) | EGP(g) |
1000 | 75[注] | 20 | 2.196 | 1.533 |
10 | 0.75 | 0.2 | 0.02196 | 0.01533 |
[注] 不同季节采摘时,其含水量不同,这里的重量取平均值。1.5实施例5
取实施例3提取的粗EGP7mg配以43mg褐藻酸钠和150mg螺旋藻粉制粒后压片(200mg/片)或灌装胶囊(200mg/粒),每日3片或3粒胶囊作为人群实验药品使用。2、EGP的抗肝炎功能:1.1实验材料:2.1.1动物:昆明小鼠(体重18-22g)北京大学动物学部提供。2.1.2实验试剂:四氯化碳(A、R)、市售纯香油,配成5%四氯化碳的香油溶液。2.1.3试验灌胃样品:取1粗EGP、EGP各50mg分别加100ml蒸馏水,浓度均为0.5mg/ml,每只小鼠灌胃(PO)0.15mg/0.3ml/日,共灌胃9天。2.2方法与结果:2.2.1对四氯化碳所致的小鼠GPT升高的保护作用将小鼠随机分组,对照组给蒸馏水,四氯化碳组和实验组分高低剂量给3实验第3、6、9天注射(ip)5%四氯化碳香油溶液,灌胃9天,第10天断头取血,以常规方法测定谷一丙转氨酶(GPT)。2.2.2实验结果:如表2-1所示表2-1
*与5%CCL4组比较
组别 | 鼠数 | 给药途径 | 剂量 | GPT(unit) | P* | |
EGP(mg/kg×d) | 5%CCL4(ml/100g×d) | |||||
对照组 | 10 | PO | 45.56±6.02 | |||
5%CCL4组 | 11 | IP | 0.2×3 | 106.08±4.81 | ||
粗EGP+5%CCL4 | 11 | PO | 64×9 | 0.2×3 | 76.51±1.72 | <0.01 |
EGP+5%CCL4 | 11 | PO | 32×9 | 0.2×3 | 71.18±2.24 | <0.01 |
从表2-1中可见,CCL4组与对照组比较升高133%,而PO给予粗EGP(64×9、32×9mg/kg×d)加5%CCL4与对照组比较,GPT分别仅升高56%和68%,表明EGP能明显对抗由CCL4引起的肝炎,起到消炎保肝作用。3、EGP抗动脉硬化(降血脂)功能:
本发明的EGP可明显降低高脂血症大鼠血清游离胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、β-脂蛋白含量,降低高胆固醇血症小鼠血清胆固醇含量,并可防止高胆固醇引起的小鼠高胆固醇血症的形成。高脂血症作为动脉硬化、冠心病的危险因素之一。也是作为衡量动脉硬化的标准。3.1材料与方法3.1.1动物 昆明种小鼠,体重18~25g,北京大学动物学部,雄性。高胆固醇小鼠模型的形成用常规方法。Wistar大鼠,雌雄兼有,体重200~250g。高脂血症大鼠喂以高胆固醇饲料(配方:4%胆固醇、10%猪油、0.2%甲基硫氧嘧啶及89%基础饲料)。3.1.2药品与试剂粗EGP及其精品由北京泰达士经贸公司生物化学所提供。洋地黄皂甙(杭州第一制药厂)。肝素、高碘酸钠、4-甲基硫化尿嘧啶均为分析纯,胆固醇(Merck)公司。3.1.3仪器:721型分光光度计3.1.4方法:用乙醇提取、高铁-硫酸显色法测定血清总胆固醇(TC)含量。用洋地黄皂甙沉淀法测定血清游离胆固醇(FreeCh)及胆固醇(chE)。用正庚烷—异内醇混合液提取法测定血清甘油三酯(TG)。用肝素—锰比浊法测定血清β脂蛋白(β-Lp)。3.2实验结果3.2.1粗EGP与EGP对高胆固醇血症小鼠血清胆固醇含量的影响3.2.1.1 EGP降血脂作用的时效关系
取健康雄性小鼠52只,随机分成5组,1组为正常对照组,其余4组在禁食16h后,每鼠一次静脉注射75%蛋黄乳剂0.5ml,以形成高胆固醇血症,其中1组为实验对照组。另外3组为给药组,在给蛋黄乳剂后第13,16,19h分别注射EGP 10mg/kg,高胆固醇血症实验对照组在乳剂注射后第20h,由眶静脉取血,3组给药组分别在注射后1,4,7h取血,然后测定血清TC。如表3-1所示,粗EGP后1h,血清TC已有所降低,4h降TC作用最强,7h作用已减弱。
表3-1 EGP对小鼠血清TG降血脂作用的时效关系
组别 | 剂量(mg/kg) | 鼠数 | TC(mg/dl) |
正常对照组 | 16 | 89.18±18.18 | |
实验对照组 | 9 | 932.533±29.39 | |
EGP 1h | 10 | 10 | 909.99±431.871) |
4h | 10 | 9 | 591.99±210.122) |
7h | 10 | 8 | 705.28±280.531) |
1)P>0.05 2)P<0.05与实验对照组比较3.2.1.2 EGP降血脂作用的量效关系3.2.1.2.1对高胆固醇血症小鼠的治疗作用
取健康小鼠47只,随机分成5组,1组为正常对照组,1组为高胆固醇血症实验对照组,其余3组为给药组。禁食16h后静脉注射75%蛋黄乳剂0.5ml/只,16h后高胆固醇血症实验对照组静脉注射生理盐水,每只0.5ml,给药组注射EGP,剂量组注射分别为3,6,10mg/kg。注射后4h,自眶静脉取血,测血清TC。结果(见表3-2)表明:EGP需较大剂量(10mg/kg)方可对抗已形成的高胆固醇血症。
表3-2 EGP对小鼠血清TC降血脂作用的量效关系 (
x±SD)
1)P>0.05 3)P<0.01与实验对照组比较3.2.1.2.2对高胆固醇血症形成的预防作用
组别 | 剂量(mg/kg) | 鼠数 | TC(mg/dl) |
正常对照组 | 16 | 89.16±18.18 | |
实验对照组 | 8 | 318.83±140.88 | |
EGP | 3 | 7 | 349.98±60.191) |
6 | 8 | 322.56±112.441) | |
10 | 8 | 199.23±69.593) |
取健康小鼠72只,随机分成9组,1组高胆固醇血症组为实验对照组,1组为正常对照组,4组EGP组,3组粗EGP组,计9组,每组8只,禁食4h后,高胆固醇血症实验对照注射生理盐水0.5ml/只,给EGP药组注射剂量分别为6,10,14,18mg/kg,给粗EGP注射组剂量分别为6,10,14mg/kg,注射后2h,给药组及高胆固醇血症实验对照组静脉注射75%蛋黄乳剂0.5ml/只,20h后自眶静脉取血,测定血清TC。表3-3指出:小剂量的EGP、粗EGP即可对抗高胆固醇血症的形成,其作用强度EGP>粗EGP。
表3-3 EGP、粗EGP对小鼠高胆固醇血症形成的预防作用
1)P>0.05 2)P<0.05 3)P<0.01与实验对照组比较3.2.2 EGP、粗EGP对正常小鼠血清胆固醇含量的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 鼠数 | TC(mg/dl) |
正常对照组 | 8 | 89.18±18.18 | |
实验对照组 | 8 | 797.06±54.611) | |
EGP | 6 | 8 | 667.32±1832.542) |
10 | 8 | 494.44±97.393) | |
14 | 8 | 488.95±68.363) | |
18 | 8 | 356.84±108.863) | |
粗EGP | 6 | 8 | 782.11±93.792) |
10 | 8 | 609.92±184.732) | |
14 | 8 | 505.79±93.653) |
取健康小鼠31只,随机分成3组,禁食12h后,1组为对照组,其余3组分别注射EGP、粗EGP各10mg/kg,注射后4h自眶静脉取血,测定血清TC。结果(见表3-4)表明:10mg/kg EGP、粗EGP均不降低正常小鼠血清TC。
表3-4 EGP与粗EGP对小鼠血清TC含量的影响(
x±SD)
1)P>0.05 与正常对照组比较3.2.3 EGP、粗EGP对高血脂症大鼠血脂含量的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 鼠数 | TC(mg/dl) |
正常对照组 | 11 | 82.8±11.16 | |
EGP | 10 | 10 | 75.67±15.031) |
粗EGP | 10 | 10 | 75.67±11.001) |
取健康大鼠43只,随机分成4组。1组正常对照组,1组高脂血症对照组(HI),其余2组为给药组。正常对照组及高脂血症对照组每天上午注射生理盐水0.6ml/只,其余各给药组注射剂量分别为EGP 20mg/kg、粗EGP 30mg/kg,下午除对照组外,均用高脂肪胆固醇饲料饲养,连续8d。第9天禁食12h后,心脏穿刺取血。测TC、Free Ch、ChE、TG、β-Lp。表3-5表明:EGP、粗EGP使进食高脂肪胆固醇饲料大鼠血清中TC、Free Ch、ChE、TG、β-Lp含量明显降低。表3-5 EGP、粗EGP对高血脂症大鼠血清TC、Free Ch、ChE、TG和β-Lp含量的影响
(x±SD)
1)P>0.05 2)P<0.05 3)P<0.01与III对照组比较3.4 附图简要说明
组别 | 剂量(mg/kg) | 鼠数 | TC(mg/dl) | Free Ch(mg/dl) | ChE(mg/dl) | TG(mg/dl) | β-Lp(mg/dl) |
正常对照组 | 13 | 57.29±11.01 | 13.54±3.56 | 46.3±8.67 | 101.43±25.44 | 288.03±83.15 | |
HI对照组 | 10 | 468.28±141.68 | 95.57±32.22 | 354.47±111.45 | 138.00±31.40 | 1097.98±227.46 | |
EGP | 20 | 10 | 308.14±68.392) | 61.93±7.972) | 264.22±70.192) | 96.39±15.973) | 842.34±120.353) |
粗EGP | 30 | 10 | 245.13±101.123) | 51.79±17.623) | 193.34±106.123) | 118.22±14.332) | 520.01±176.443) |
图1是从鲜石莲花生产其粗多糖的工艺流程
图2是从石莲花原粉生产其粗多糖的工艺流程
图3是人群实验组体脂肪分布图
图4是血糖值与GOT、GPT、γ-GTP关系图
图5是从体脂肪下降观察服用EGP的效果
图6是从体脂肪观察服用EGP降GOT的效果
图7是从体脂肪观察服用EGP降GPT的效果
图8是从体脂肪观察服用EGP降γ-GTP的效果
图9是从饮酒量水平观察服用EGP降γ-GTP的效果
图10是人群实验对象每周饮酒水平分布图
图11是人群实验对象的动脉硬化分布图
图12是从动脉硬化症观察服用EGP降体脂肪的效果
图13是从动脉硬化观察服用EGP降低γ-GTP的效果
图14是从动脉硬化观察服用EGP降低TC的效果3.5实验结果讨论
根据损伤反应学说,动脉硬化首先是高血脂使动脉内膜受到损伤而引起。动脉硬化症的发生和发展,随血脂含量的增加而危险性增大,血清中的TC、β-Lp和TG是冠心病的促进因子。本发明的实验表明,EGP、粗EGP可有效地阻止小鼠实验性高胆固醇血症的形成,并且可使进食高脂饲料大鼠血清TC、Tree Ch、ChE、TG、β-Lp含量较对照组明显降低,本实验证实了EGP有肯定抗动脉硬化、降血脂效果。4、EGP人群保肝、抗动脉硬化、降体脂肪的减肥实验4.1实验对象和方法:4.1.1人群实验组:其对象为40岁至60岁(平均年龄52岁)的健康成人男性42名,女性2名,共44例。4.1.2实验方法:用现代医学检查肝功能与体脂肪每天饭前或饭后服用1片,EGP 3个月,每日3片,每月医生问诊1次,见表4-1指标检验生化指标。谷氨酸草酰酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酸(GPT)、乌苷三磷酸酶(γ-GTP)和体脂肪。在服用EGP片前后比较上述肝功能与体脂肪的变化。
表4-1 服用EGP前后人群实验对象的生化指标变化一览表4.1.3判断标准:肝功能(GOT、GPT、γ-GTP)指标除正常外,均为异常,体脂肪除正常外,对瘦身、轻度肥胖、肥胖、超肥胖均属超标。4.1.4生化指标处理方法:采用统计学处理,P<0.05具有显著意义。4.2实验结果4.2.1服用EGP前的状况:4.2.1.1人群实验组的具体对象的体脂肪为:瘦身型占16%;正常型占18%;轻度肥胖型占43%;肥胖型占14%;超肥胖型占9%;肥胖型居多。见图3。4.2.1. 2生化指标主要是指肝功能与体脂肪值正常、异常。见表4-1。4.2.2服用EGP后的状况:4.2.2.1从血糖值变化观察其效果:
从图4血糖值跟GOT、GPT、γ-GTP的关系可见,高血糖组和正常血糖组随着GOT、GPT、γ-GTP的降低而降低。4.2.2.2从体脂肪值的变化观察服用EGP的效果:
现将肥胖、超肥胖(体脂肪在30%以上)组、轻度肥胖组(体脂肪在25%-29%)、正常和瘦身型组(体脂肪在24%以下)分成3个组,观察体脂肪、GOT、GPT、γ-GTP的变化。4.2.2.2.1、3个组体脂肪值都下降,但在肥胖度亢进时下降的幅度有增大的倾向,从体脂肪下降观察服用EGP的效果(见图5)。4.2.2.2.2、对GOT来说,轻度肥胖组可见变化略有上升,其它组都降低、以肥胖、超肥胖组降低幅度最大,从体脂肪下降观察服用EGP降GOT的效果(见图6)。4.2.2.2.3、GPT 3组都降低,但降低幅度从大到小依次为肥胖、超肥胖组、正常与瘦身型组、轻度肥胖型组,从体脂肪观察服用EGP降GPT的效果(见图7)。4.2.2.2.4、对γ-GTP来说3组都下降,但降低幅度从大到小依次排列如下肥胖、超肥胖型组、正常与瘦身型组,轻度肥胖组,从体脂肪观察服用EGP降γ-GTP的效果(见图8)。
体脂肪降低幅度大的组(相对值降低在10%以上),同样可观察到GOT、GPT、γ-GTP的变化,对肥胖、超肥胖组下降的倾向几乎是相同的,尤其是γ-GTP数值大幅度降低。见图6、7、8所示。4.2.2.3从饮酒量水平观察服用EGP的效果:4.2.2.3.1、普通饮酒组:每周饮10小瓶以下(二锅头白酒180ml/小瓶)的人群。4.2.2.3.2、多饮酒组:每周超过10小瓶的饮酒人群(见图9,从饮酒量水平观察服用EGP降γ-GTP的效果)。
从服用EGP片的前后γ-GTP值的变化如图9可见,每周喝10小瓶以下的普通饮酒组的γ-GTP的平均值服用前60.4,而服用后γ-GTP下降至56.4。而每周喝10小瓶以上的多饮酒组,服用前γ-GTP平均值为208.5,服用后降至138.9,这就证明EGP片显著地改善了肝功能。4.2.2.3.3、饮酒人群分布图:(见图10,人群实验对象每周饮酒水平分布图)。4.2.2.4从动脉硬化观察服用EGP的效果:见表4-1,从动脉硬化观察EGP双向调节血糖的效果(见图11,人群实验对象动脉硬化分布图),将人群实验对象动脉硬化分成:无、有倾向、有、亢进四个组、动脉硬化与血糖值、体脂肪、γ-GTP、TC乃至TG有关。4.2.2.4.1血糖值随动脉硬化变化的状况:无、有倾向、有动脉硬化3个组降低可见,尤以有动脉硬化组、统计值P<0.05具有显著意义。从动脉硬化与亢进组可见,血糖值反而升高(见图12,从动脉硬化症观察服用EGP降血糖的效果)。4.2.2.4.2体脂肪随无动脉硬化、有动脉硬化倾向,有动脉硬化3组变化而大幅降低,其P<0.05。动脉硬化亢进组未见体脂肪变化反而上升。(见图13,从动脉硬化症观察服用EGP服用降体脂肪的效果)。4.2.2.4.3观察无动脉硬化、有动脉硬化倾向、有动脉硬化以及亢进等4组降低γ-GTP、特别对有动脉硬化具有显著的意义,其P<0.05,(见图14,从动脉硬化观察服用EGP降低γ-GTP的效果)。4.2.2.4从TC来看,对无动脉硬化、有动脉硬化倾向、有动脉硬化及亢进4组具有对抗倾向,尤其有动脉硬化具有显著的意义P<0.05,(见图15,从动脉硬化观察服用可见EGP降TC的效果)。4.3结果讨论:
综上所述,随着体脂肪降低,糖耐量趋于正常化,同时改善了胰岛素的感受性,由于降低了肝功能GOT、GPT、γ-GTP的指标,使肝功能转为正常,服用EGP片后血糖值、肝功能、动脉硬化、体脂肪均有明显的改善,因此EGP具有预防内脏胖肥、动脉硬化、脂肪肝的效果。
Claims (7)
1、本发明是一种新近发现的石莲花多糖(EGP)的最新功效,主要具有保肝、抗动脉粥样硬化,减肥等功能。
2、根据权利要求1所述,从提取液中沉淀的石莲花多糖(EGP)其中含蛋白多糖,将沉淀多糖的酒精浓度调为70-95%。
3、根据权利要求1所述,加热煮沸温度90-100℃,不低于90℃。
4、根据权利要求3述,加热煮沸不仅起破坏细胞壁的作用,而且还可增大EGP或蛋白多糖的溶解度。
5、根据权利要求1所述,EGP与粗EGP(均含量蛋白多糖)在动物实验中它们之间无显著差异。
6、本发明的EGP或粗EGP均具有保肝、抗动脉粥样硬化、减肥(减体脂肪)攻效,均具有非常显著的意义,其P<0.01。
7、本发明,对食品、保健食品以及药品临床推荐EGP在7~30mg/日。
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2000
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |