CN1328415A - 植物脂肪酸去饱和酶启动子 - Google Patents

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Abstract

本文描述了脂肪酸去饱和酶5′调节元件,以及核酸构建物和含有这些调节元件的转基因植物。本文还描述了脂肪酸去饱和酶3′非翻译区域。

Description

植物脂肪酸去饱和酶启动子
发明领域
本发明涉及可用于在转基因植物中表达各种核酸分子的植物调节元件。
发明背景
用于植物基因工程的基本元件是能在各种植物组织中表达基因的。启动子元件所含的特异性序列指导形成转录复合物需要的蛋白质的结合，并使转录开始。组成型启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S和19S启动子，以及土壤杆菌属衍生的启动子如胭脂氨酸合成酶和章鱼氨酸合成酶启动子，已广泛用于在转化的植物中表达基因。
发明概述
本发明基于鉴定到植物脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，该元件让异源核酸分子在植物细胞和植物中表达。因此，可产生含有营养价值增加的改良的脂肪酸组合物或改良的碳水化合物、蛋白质或次级代谢产物的植物。另外，也可用该调节元件在植物中产生新药物。
另一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子，它包括脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件位于天然基因组中脂肪酸去饱和酶基因的5′。所述的脂肪酸去饱和酶基因可以是例如芸苔属fad2D基因或芸苔属fad2F基因。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，它具有SEQ ID NO：4、SEQID NO：5的核苷酸序列、SEQ ID NO：4的核苷酸5113-5796、或SEQ ID NO：5的核苷酸3197-3867，以及这些核酸分子的互补序列。核酸分子的长度可至少为100个核苷酸(如400、600或800个核苷酸)，至少有70％序列(如80％、90％或95％)与这些核酸分子相同。在一些实施例中，该分离的核酸分子包括SEQ ID NO：4的核苷酸5113-5796或SEQID NO：5的核苷酸3197-3867。
本发明还涉及一种核酸构建物。这种构建物包括的第一核酸分子可操纵连接于第二核酸分子(与第一核酸分子是异源的)。第一个核酸分子包括脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件位于天然基因组中的脂肪酸去饱和酶基因的5′。第一核酸分子启动异源的第二核酸分子的表达，第二核酸分子可编码如核酶或多肽，如赋予除草剂抗性的多肽。
该核酸构建物还可包括可操纵连接于第二核酸分子3′端的第三核酸分子。第三核酸分子包括脂肪酸去饱和酶基因的3′非翻译区域，所述的3′非翻译区域位于天然基因组中的脂肪酸去饱和酶基因的3′。该第三核酸分子包括的核酸分子具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、的核苷酸序列、SEQ ID NO：6的核苷酸1-894或SEQ ID NO：7的核苷酸1-817，以及这些分子的互补序列。核酸分子的长度可至少为100个核苷酸，至少有70％序列与具有SEQID NO：6的核苷酸1-894或SEQID NO：7的核苷酸1-817的核酸分子相同。
该核酸构建物还可包括可操纵连接于第一和第二核酸分子的第四核酸分子，所述的第四核酸分子是一转运肽或内含子。
另一方面，本发明涉及的分离的核酸构建物包括的第一核酸分子可操纵连接于第二核酸分子，这两个核酸分子是异源的。第一核酸分子包含脂肪酸去饱和酶基因的3′非翻译区域，所述的3′非翻译区域位于天然基因组中的脂肪酸去饱和酶基因的3′。
本发明还涉及转化的植物细胞和转基因植物。该转化的植物细胞和转基因植物包含一核酸构建物。该核酸构建物包含可操纵性连接于一异源核酸的脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件启动该异源核酸的表达，所述的调节元件位于天然基因组中的脂肪酸去饱和酶基因的5′。该转基因植物可以是双子叶植物(如苜蓿、大豆、油菜籽或向日葵)或单子叶植物(如玉米、小麦、黑麦、稻或高粱)。还涉及转基因植物的种子。
另一方面，本发明涉及ATCC登录号为PTA-2535的质粒pMB102和ATCC登录号为PTA-2536的质粒pMB103。
除非另有指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下列出了适当的方法和材料，但可用许多与本文所描述的类似方法和材料或等价物来实施本发明。本文所引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献本文全部纳入作为参考。为避免冲突，本发明的说明书包括定义受限。另外，材料、方法和实施例仅起说明作用，无任何限制作用。
本发明的其它特征和优点通过以下的发明详述和权利要求而显然易见。
附图简述
图1质粒pMB103的模式图，其含有亚克隆入pSP72的SalI位点的蔓菁“桥(Bridger)”的1-3A1A SalI基因组DNA片段，本图表明了与fad2D编码序列相关的fad2D启动子、fad2D内含子和fad2D3′非翻译区域(UTR)。
图2质粒pMB102的模式图，其含有亚克隆入pSP72的SalI位点的蔓菁“桥”的1-2A1A SalI基因组DNA片段，本图表明了与fad2F编码序列相关的fad2F启动子、fad2F内含子和fad2F3′非翻译区域(UTR)。
图3蔓菁fad2D启动子的核苷酸序列。
图4蔓菁fad2F启动子的核苷酸序列。
图5蔓菁fad2D3′非翻译区域的核苷酸序列。
图6蔓菁fad2F3′非翻译区域的核苷酸序列。
发明详述
本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含编码脂肪酸去饱和酶(FAD)基因的调节元件。在天然基因组中，该调节元件位于脂肪酸去饱和酶基因(fad)的5’，如fad1、fad2或fad3基因，包括这些fad基因的内含子。例如，该调节元件可在芸苔属fad2D、fad2F或fad2U基因的上游。本文所述的“fad基因的5′”是指fad编码区域的7000碱基对(bp)中的序列。本文所述的“分离的”是指相应于脂肪酸去饱和酶基因的调节元件的核苷酸序列，但不含植物基因组中通常侧接于该调节元件一边或两边的序列。分离的调节元件可以是例如重组DNA分子，只要除去或缺失通常在天然基因组中发现的侧接于此重组DNA分子的一个核酸序列。因此分离的调节元件包括(但并不限于)作为分离的分子存在的、无侧翼序列的重组DNA(如由PCR或限制性核酸内切酶处理产生的基因组DNA片段)，和掺入一载体、一自主复制质粒的重组DNA，或掺入一植物基因组DNA的重组DNA(作为杂合体或融合核酸分子的一部分)。
以Clustal算法，用MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI)序列对比软件确定，蔓菁fad2D、fad2F和fad2U基因的编码区域在核苷酸水平上有84-96％序列相同。fad2D和fad2F基因各编码胞质δ-12去饱和酶(也称为FAD2)，该酶参与油酸酶促转化成亚油酸。fad2D和fad2F基因的序列见美国专利No.5,850,026。fad2U基因的核苷酸序列编码表明其也编码胞质δ-12去饱和酶。fad2U基因的序列见WO98/56239。另外，fad2U可能编码胞质脂肪酸羟化酶、或环氧酶、或其它酶，因为编码这些酶的核酸与fad2基因家族是同源的。fad1和fad3基因分别编码δ-9和δ-15去饱和酶。
本发明的调节元件是用fad2D的编码区域作为探针，从蔓菁品种“桥(Bridger)”的基因组DNA文库筛选分离的。图3的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)是本发明调节元件的一个例子，其包括fad2D内含子5′端上游的约5800个碱基对。图4的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)是一调节元件，其包括fad2F内含子5′端上游的约3800个碱基对。本发明的调节元件可具有从SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列衍生的核苷酸序列，并保留了启动核酸分子表达的能力。例如，具有与SEQ ID NO：4和5的核苷酸序列至少70％相同的核酸序列能启动核酸分子的表达。在一些实施例中，该核酸序列可具有与SEQ ID NO：4或5的核酸分子至少80％、90％或95％相同的序列。
通常，序列相同百分比是通过将相对比核酸序列中匹配位置数除以对比核苷酸总数，再乘以100计算的。匹配的位置是指相同的核苷酸位于相对比核酸序列的相同位置。排列对比核酸序列，用MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI，1997)序列对比软件的Clustal算法计算相同性百分比。在该方法中，通过检验所有碱基对间的距离将序列排成组。Clusters先对比碱基对，然后对比组。在排列对比中采用100为空隙罚分，2为空隙长度罚分。
可制造保留启动感兴趣核酸分子表达能力的调节元件的片段。图1和2提供了产生片段的方便的限制性内切位点。例如，产生的fad2D调节元件的片段含有SEQ ID NO：4的核苷酸4581-5796或SEQ ID NO：4的核苷酸5113-5796。fad2F调节元件的片段可含有SEQ ID NO：5的核苷酸2081-3867或SEQ ID NO：5的核苷酸3197-3867。可用本文描述的方法检验这些片段启动核酸分子表达的能力。具体地说，可将该片段可操纵性连接于一核酸序列，用于瞬时或稳定转化一植物细胞。可用标准方法该核酸序列编码的基因产物监测在这种转化的植物细胞中的表达。
通常，调节元件片段的长度至少为100个核苷酸，例如长约200、400、600或800个核苷酸，且至少有70％序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的核苷酸序列相同，或与它们的片段如SEQID NO：4的核苷酸5113-5797或SEQ ID NO：5的核苷酸3197-3867相同。在一些实施例中，这些片段至少有80％、90％或95％序列与SEQ ID NO：4或5或它们的片段的核苷酸序列相同。也可将调节元件片段作为杂交探针或用于启动核酸分子的表达。己鉴定了不到400bp的调节元件，其能启动植物中核酸分子的表达。例如，在缺失了转录起始上游的290bp的核苷酸(该区域相应于翻译起始的358核苷酸)后，一酰基载体蛋白(ACP)保留了功能。蔓菁ACP启动子的分离及其使用见欧洲专利-91303098和美国专利NO.5,767,363。在转录起始140bp(该区域相应于翻译起始的167核苷酸)缺失后，拟南芥属质体(plastidial)乙烯基辅酶A羧化酶的生物素羧化酶亚基保留了功能启动子。另外，转录起始位点47bp的缺失不改变种子表达烯酰基-ACP还原酶启动子，表明在这个小区域存在种子高水平表达所需的所有元件。
本文所公开的调节元件的片段可在高度严谨条件下与SEQ ID NO：4或SEQID NO：5或它们的片段杂交。杂交通常包括Southern分析(Southern印迹)。见如Sambrook等人，1989，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”第二版，Cold SpringHarbor Press，Plainview：NY，的第9.37和9.52章节。高度严谨条件包括用低离子强度和高温洗涤，例如0.015M NaCl/0.0015 M柠檬酸钠(0.1XSSC)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，65℃。另外，在杂交时可用变性试剂如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％甲酰胺/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠(pH6.5)和750mM NaCl、75mM柠檬酸钠(42℃)。另一例子是用50％甲酰胺、5XSSC(0.75MNaCl、0.075柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt溶液、超声处理过的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯(42℃)，用0.2XSSC和0.1％SDS洗涤(42℃)。
也可从基因组fad基因的5′侧翼序列克隆本发明的调节元件，或用其它方法获得，包括化学合成和聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR指扩增靶核酸的一种方法或技术。通常用感兴趣区域终端或其前的序列信息来设计寡核苷酸引物，该引物与待扩增模板相反链的序列相同或相似。可用PCR扩增DNA以及RNA的特异性序列，包括基因组总DNA或细胞总RNA的序列。引物长度通常为14-40个核苷酸，但其长度范围也可从10个核苷酸到数百个核苷酸。例如PCR Primer：ALaboratory Manual，Dieffenbach C.和Dveksler，G.，编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，1995中描述了PCR。可用连接酶链式反应、链置换扩增、自身支持的序列置换或基于核酸列的扩增。见例如Lewis，R.Genetic Engineering News，12(9)：1(1992)；Guatelli等人，proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874-1878(1990)；和Weiss，R.，Science，254：1292(1991)。
核酸构建物
本发明的调节元件可用于在植物中表达核酸分子。本文所用的“异源核酸分子”是指脂肪酸去饱和酶5′调节元件以外的核酸分子，其结合的编码序列，且包括对该植物是部分或完全异源(即外源的)性的外源核酸，或对植物的内源核酸分子是同源的外源核酸。可以有义或反义取向连接调节元件和异源核酸分子。本文所用的“可操纵性连接”是指以可能发生转录或翻译的方式(即利于产生多肽或RNA分子的方式)，将两个或多个核酸分子共价连接。
用完整的cDNA序列以及部分cDNA序列，可用反义RNA抑制植物靶基因。也有证据表明3′非编码序列片段和5′编码序列片段在反义抑制中起重要作用。反义核酸构建物包括可操纵性连接于(反义方向)感兴趣核酸分子(与调节元件是异源的)的本发明的调节元件。
可用以有义方向可操纵性连接的构建物来抑制内源基因的表达。用全长cDNA序列以及部分cDNA序列进行共抑制是本领域已知的。见如美国专利No.5,231,020。
异源性核酸分子可编码例如设计的核酶来切割特定的mRNA转录物，从而防止某多肽的表达。可用锤头核酶来破坏特定mRNA，也可用各种核酶在位点-特异性识别序列上切割mRNA。锤头核酶切割mRNA的位点是由形成与靶mRN互补碱基对的侧翼区域指定的。唯一的要求是靶RNA含有5′-UG-3′核苷酸序列。构建物和锤头核酶的产生是本领域熟知的。见如美国专利No.5,254,678。可将锤头核酶序列嵌入一稳定的RNA如转运RNA(tRNA)中，以增加体内的切割效率。Perriman，R等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(13)：6175-6179(1995)；de Feyter，R和Gaudron，J.，Methodsin Molecular Biology，Vol.74，第43章，“植物中核酶的表达”，Turner P.C.编辑，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。RNA内切核糖核酸酶如噬热四膜虫中的，以及那些由Cech和其合作者详细描述的都是有用的。见例如美国专利No.4,987,071。
异源核酸分子也可编码多肽。本文所用的“多肽”指氨基酸链，无论其长度或翻译后的修饰。多肽可包括调节生长、激素产生、光合作用的效率、营养价值和油或蛋白成分的酶或其片段，或受体多肽，如绿荧光蛋白、新霉素磷酸转移酶II、或β-葡糖醛酸酶。多肽也可提供对环境应力的抗性，如对干旱、寒冷、病原体、昆虫或除草剂的抵抗力。可在植物中表达苏云金芽孢杆菌毒素基因，以提供对昆虫的抗性。见如美国专利No.5,380,831。表达编码5-烯醇丙酮酰基莽草酰基(enolpymvylshikimate)-3-磷酸合成酶(EPSPS)多肽和thricin膦基乙酰基转移酶(PAT)多肽的核酸分子，分别提供对草甘膦和glufosinate的除草剂抗性。例如见美国专利No.4,940,835和5,489,520。另外，对草甘膦和glufosinate的抗性也可通过在植物质体中表达编码潮霉素磷酸转移酶(HPH)多肽的核酸或假单胞菌属的glpA和glpB基因来提供。例如见WO99/05265。对咪唑啉类除草剂的抗性可通过表达编码羟乙酸合成酶多肽的核酸分子来提供，例如见美国专利No.4,761,373。通过在玉米中表达编码除草剂抗性乙酰辅酶A羧化酶多肽(ACC1和ACC2)的核酸分子，可提供对环己二酮或芳氧基苯氧基丙酸类除草剂的抗性。如见WO98/08963和Herbert等人，Pestic.Sci.，1997，50：67-71。抗卟啉(porphyrric)除草剂的原卟啉原氧化酶多肽的表达提供了除草剂对原卟啉原抑制除草剂的抗性。如见WO98/29554。对苯酰基环己二酮类除草剂的抗性可通过表达编码抗4-羟苯基丙酮酸双加氧酶多肽除草剂的核酸分子来提供。如见Barta和Boger，Pestic.Sci.，1996，48(2)：109-116；WO98/02562；和WO99/24586。除草剂抗性也可由编码单链Fv抗体(能结合除草剂)的核酸分子的表达来提供。对病毒衣壳蛋白有特异性结合亲和力的单链Fv抗体在植物细胞液中的表达，能提供对病毒病原体的抗性。如见Conrad和Fiedler，Plant Mol.Biol.，1998，38(1&2)：101-109和WO98/42852。
本发明的核酸构建物还包括编码3′非翻译区域(3′UTR)的核酸分子，通过在转录的mRNA序列的3′端添加多个腺苷酸核糖核苷酸，增加转录序列的稳定性。3′UTR可以是胭脂氨酸合成酶(NOS)的3′UTR或fad基因的3’UTR，在天然基因组中位于fad编码序列的3′。本文所用的“3′”指fad编码区域下游的4000bp或更少的序列(如约2000bp或更少)。如本文所述，fad2D和fad2F基因的3′UTR是分离的，且分别具有图5(SEQ ID NO：6)和图6(SEQ ID NO：7)列出的核苷酸序列。fad2D和fad2F的3′非翻译区域的一部分与各种植物品种的肌动蛋白基因是同源的。在pMB103中，肌动蛋白同源区域自核苷酸9341(5′端)开始，在核苷酸位点8846(3′端)结束。在pMB102中，肌动蛋白同源区域在核苷酸7491(5′端)开始，在核苷酸位点7007(3′端)结束。可产生SEQ ID NO：6和7的核酸分子片段，例如包含SEQIDNO：6的1-894核苷酸或SEQIDNO：7的1-817核苷酸的核酸片段，其不包括部分肌动蛋白基因。也可产生长度至少为100个核苷酸，且有至少70％序列与SEQID NO：6的1-894核苷酸或SEQ ID NO：7的1-817核苷酸序列相同的其它片段，用于本发明的构建物。例如，可将fad基因的3′UTR连接于一异源核酸分子的3′端，其还可连接于任何5′调节元件，包括35SCaMV启动子。
核酸构建物也可包含元件如可诱导元件、内含子序列、增强子序列或靶序列。这些元件对异源核酸分子的功能而言不是必须的，虽然它们能提供较好的表达或让核酸分子靶向特定的细胞器(如质体)。例如，为提高表达，可提供核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的5′UTR。可用编码核酮糖二磷酸羧化酶或其它质体靶蛋白质小亚基的运输肽的核酸分子，使编码的产物靶向质体。见美国专利No.5,925,806和Tingey等人，J.Biol.Chem.，1988，263(20)：9651-9657。适用于本发明的内含子包括fad2D和fad2F内含子。WO98/56239中公开了fad2D内含子的序列。
由fad基因5′调节元件控制的核酸分子表达的时间不同于由ACP或napin启动子控制的核酸(以相应天然基因的不同表达为根据)。另外，fad5′调节元件的表达和调节水平与napin和ACP启动子的不相同。在调节外源或内源基因的表达中，fad基因的5′调节元件优于其它启动子。
令人惊讶的是，fad2D和fad2F基因的启动子能在许多不同的植物中表达核酸分子。如上述鉴定的导致canola(低芥酸菜籽)植物种子中油酸含量改变(而根和叶子中含量没有改变)的fad2D突变体基因，希望fad2D基因特异性表达在植物种子中。另外，当在低温或在田地中培养时，含fad2D和fad2F基因点突变的canola植物的种子中含有高达85％油酸。这些植物根中显示改变的脂类组合物与种子中油酸含量类似。基于这些数据，认为种子和根都表达fad2F，而fad2D在种子中表达。如本文所述，根中表达的fad2D水平甚至比fad2F水平高(基于RT-PCR分析)。可用本发明的调节元件指导感兴趣基因在适当发育阶段和相应于内源性fad2D和fad2F表达的组织中的表达和共抑制。
在指导芸苔属和大豆叶子以及芸苔属胼胝体中β-葡糖醛酸酶(GUS)的瞬时表达方面，本发明的调节元件与35S启动子类似。在芸苔属根和胚胎组织中，fad2D和fad2F启动子表达GUS的水平比35S启动子高。另外，fad2F启动子在指导玉米叶子GUS表达的水平与35S启动子类似。这意味除在双子叶植物中表达外，fad2F启动子可用于在单子叶植物中表达感兴趣的基因。
转基因植物
如本文所述，可通过将至少一个核酸构建物引入植物细胞获得转基因植物。适合的植物包括双子叶植物如苜蓿、大豆、油菜籽(高芥酸和canola)或向日葵，以及单子叶植物玉米、小麦、黑麦、稻或高粱。可培养转基因植物产生种子，自交(或杂交和自交)，以得到含构建物的纯合植物。可以分析种子以鉴定那些具有所需的构建物表达的纯合子。可将转基因植物引入繁殖程序，如增加种子、将新的构建物逐渐渗入其它品系或属、或进一步选择其它理想性状。另外，也可通过营养繁殖转化的植物细胞得到转基因植物(对那些适合于这些方法的品种)。
本文所述的转基因植物还指初始转基因植物的后代。所述的后代包括特定植物或植物系的后代，如直接从植物发育得到的种子。植物的后代也包括F1、F2、F3形成的种子和及其后代植物，或BC1、BC2、BC3形成的种子及其后代植物。
本发明所用的转基因方法包括，但并不限制于，土壤杆菌属介导的转化、电穿孔法和粒子枪转化。PCT专利申请No.99/04117(芸苔属的粒子轰击)和美国专利5,188,958(土壤杆菌属)中描述了转化方法的实例。用土壤杆菌亚类的Ti和Ri质粒的转化方法通常用双类型的载体。Walkerpeach，C等人，Plant Molecular BiologyManual，S.Gelvin和R.Schilperoort编辑，Kluwer Dordrecht，C1：1-19(1994)。若将细胞或组织培养物作为转化的接受组织，可用本领域技术人员已知的方法从转化的培养物中再生植物。
本发明的转基因植物可用于各种商业和研究目的，本发明的调节元件可用于表达感兴趣的异源核酸分子。由于转基因植物细胞能在培养中能连续繁殖，所以是有用的。这些培养物可用于在体外生产各种有用材料，如二级代谢物和香精油。
以下实施例进一步描述了本发明，但对本发明在权利要求书所定的本发明范围无任何限制。
实施例
实施例1-启动子序列的鉴定
通过与fad2D编码区域的杂交，筛选蔓菁品种“Bridger”的基因组DNA文库(300,000噬斑)。在第三轮筛选中鉴定到约16个阳性噬斑，然后纯化。用各种限制性内切酶作16个阳性噬斑的噬菌体DNA图，Southern分析用fad2D编码区域作探针。将两个噬斑(克隆1-3A1A和1-2A1A)的阳性基因组DNA片段(用SalI消化产生的，用Southern分析鉴定)，分别亚克隆入pSP72载体的SalI位点，产生质粒pPMB103和pMB102(图1和2)。质粒pMB102和pMB103保藏于美国典型培养物保藏中心，ATCC登录号分别为PTA-2535和PTA-2536。用各种限制性内切酶作pSP72中亚克隆的SalI DNA片段的图谱。
用PCR验证了在pMB103和pMB102的亚克隆SalI DNA片段中存在fad2D和fad2F。反应条件包括5μl 10XPCR缓冲液(含Mg2+)(Boehringer Mannheim，带有Taq聚合酶)、1μl 10mMdNTP(Boehringer Mannheim，产品编号#1051458，1051440，1051466和1051482)、1μl 10μMFad2D RT-1(caucaucaucauACCGCTACGCTGCTGTCCAA，SEQ ID NO：1)或1μl 10μMFad2F-RT2(caucaucaucauCTCTTCCGTTACGCCTTCACGTAC，SEQ ID NO：2)、1μL 10μMBS4(caucaucaucauCATAACTTATTGTTGTACCAG，SEQ ID NO：3)、0.5μl Tag DNA聚合酶(Boehringer Mannheim分案号1647679)、40.5μL ddH2O和1.0μl 10ng/μl DNA模板。将样品加热到95℃4分钟，然后扩增30轮：94C变性1分钟，65℃退火2分钟，72℃延伸3分钟，然后72℃最后延伸10分钟。Fad2FRT-1和BS-4引物对特异性扩增fad2F基因，而Fad2DRT-1和BS-4特异性扩增fad2D基因。产生的反应产物与含fad2F基因的1-2A1A片段和含fad2D基因的1-3A1A片段一致。
另外，用根据fad2D和fad2F编码区域合成的引物测定1-2A1A和1-3A1A克隆的序列。用ABI PRISM310(Perkin Elmer)测序仪、AmpliTaq DNA聚合酶和染料终止剂进行DNA测序(如制造商所述)。鉴定到1-2A1A和1-3A1A基因组克隆中的编码序列与先前fad2F和fad2D编码区域测定的序列相同，证实了1-2A1A和1-3A1A片段分别含有fad2F和fad2D基因。从每个构建物得到基因组DNA片段的完整核苷酸序列，并在图3和4中列出。这两个克隆的翻译“ATG”密码子起始处上游四个核苷酸处存在有一个内含子。
用消化pMB102和pMB103的SalI和PpuMI限制性内切酶，来分别产生约3.9kB和5.8kB的DNA片段，它们含有启动子但无内含子或编码序列。将限制性内切酶消化释放的DNA片段在琼脂糖凝胶中分辨和纯化(如制造商所述，Qiagen)。将纯化的片段连接入pMB160的SalI/SmaI位点，其含有克隆入pSP72的Xbal/EcoRI位点的GUS-NOS DNA片段，以分别得到新质粒pMB168和pMB166。如制造商(BRL)所述，用T4DNA连接酶进行DNA的连接，然后在DH5α细菌细胞中增殖。将fad基因的5′调节元件置于pMB160中，从而该调节元件能推动GUS的表达。
用MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI)序列排列对比软件和Clustal V方法和算法(Higgins和Sharp，Gene，1988，73(1)237-44；和Comput.Appl.Biosci.，1989，5(2)：151-153)比较pMB166和pMB168启动子区域的核苷酸序列。在多个对比中以100为空隙罚分，2为空隙长度罚分。两两对比的参数包括Ktupe(2)、以5为空隙罚分、4窗口4对角线。pMB166和pMB168中fad2D和fad2F启动子的对比，分别鉴定出有86.4％相同的一个区域。fad2D启动子(图3，SEQ ID NO：4)中该区域分别起始和结束于4940和5796核苷酸，fad2F启动子(图4，SEQ ID NO：5)中该区域分别起始和结束于3132和3867核苷酸。看来这个保守的区域含有两种启动子全部功能的所有必须元件(见实施例3)。用相同的计算机程序和参数排列对比fad2D和fad2F内含子核苷酸序列。这两个内含子有73％是相同的。
实施例2-RT-PCR分析Fad2F和Fad2D在不同植物组织中的表达：
RNASTAT-60RNA分离：从温室中培育2周的蔓菁(Westar品种)的叶子和根分离RNA，并从田间生长的蔓菁IMC129开花后第10、20、30、30-50和45-55天收集的种子中分离RNA。美国专利No.5,668,299中描述了IMC129。在提取RNA前，-70℃保存样品。按RNASTAT-60产品说明(Tel-Test"B"简报No.1)进行RNA的分离。每2ml试剂用于约200mg组织。在液氮下，用研钵和研杵研磨组织，加入试剂，在提取前用polytron匀化器匀化。见Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.，1987，162：156-159；和Kedzierski和Porter，Biotechniques，1991，10：210-214。
逆向转录：制备单链cDNA反应混合物，含有10μl5X单链缓冲液(BRL)、5μl各种dNTP(5mM)、1μl寡dT(12-18)引物(0.5mg/ml)、1μlpd(N)6引物(0.5mg/ml)、1μlRNA(共1-2μg)和28μl dH2O。65℃培育此反应混合物2分钟后，在室温中冷却到35℃，加入2μl 100mM DTT、1μl RNasin(Promega)和1μl SuperscriptII反转录酶(BRL)，混合。再将反应物在25℃培育5分钟，30℃培育5分钟，37℃培育60分钟。用2.5μl第一链cDNA反应混合液或0.5μg pMB102或pMB103DNA构建物、0.5μl 10XPCR缓冲液II(Perkin-Elmer)、2.5μl各dNTP(5mM)、1.0μl上游引物(共50μM)、1.0μl下游引物(共50μM)、0.5μl Amplitaq聚合酶(Perkin-Elmer)和37.5μldH2O(共50μl)进行PCR。反应条件包括94℃、15秒变性，60℃、30秒退火，和72℃、60秒延伸共35轮。所用的引物包括下游引物BS-4(SEQ ID NO：3)和FadD-RT1或Fad2F-RT2(分别为SEQID NO：1和SEQID NO：2)作为上游引物。
扩增产物为fad2D和fad2F的434个核苷酸，并用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检测。用BalI或SspI限制性内切酶消化证明了扩增产物的特异性。BalI限制性消化产生fad2D的274和160碱基对的片段，而SspI消化产生fad2F的234和200碱基对的片段。RT-PCR数据表明fad2F和fad2D基因在所有检验的组织中表达，包括叶子、根和种子，但fad2D基因的表达水平比fad2F基因高。这一数据与下述fad2F和fad2D启动子分析相关。
实施例3-fad2D和fad2F启动子分析：在fad2D启动子(pMB166)调控下，在fad2D启动子5′缺失(pMB179和pMB180)调控下、在fad2F启动子(pMB168)调控下、在fad2F启动子5’缺失(pMB167和pMB176)调控下，或在35S启动子(pMB146)调控下，制备含有GUS报告基因无启动子(pMB160)的构建物。
                        表1
                 质粒的描述
质粒     描    述 启动子长(bp)
pMB103 从“Bridger”基因组文库分离得的1-3AIA SalI基因组DNA片段，含有fad2D基因和启动子。将此片段亚克隆入pSP72载体的SalI位点。
pMB102 从“Bridger”基因组文库分离得的1-2A1A SalI基因组DNA片段，含有fad2F基因和启动子。将此片段亚克隆入pSP72载体的SalI位点。
pMB166 将pMB103构建物的SalI和PpuMI(平头的)DNA片段(含有fad2D内含子上游基因组DNA序列)连接到pMB160构建物的SalI和SmaI位点。     5800
pMB179 用PstI消化pMB166构建物并再连接，以除去上游启动子区域。     683
pMB180 用HindIII消化pMB166构建物并再连接，以除去上游启动子区域。     1215
pMB168 将pMB102构建物的SalI和PpuMI(平头的)DNA片段(含有fad2F内含子上游基因组DNA序列)克隆到pMB160构建物的SalI和SmaI位点。     3800
pMB167 用PvuII消化pMB168构建物并再连接，以除去上游启动子区域。     1786
pMB175 用PsfI消化pMB168构建物并再连接，以除去上游启动子区域。     670
对照质粒
pMB146 用HindIII和EcoRI消化，从pBI121二元(binary)载体(Clontech)释放35S-GUS-NOSDNA片段，然后亚克隆入SP72的HindIII和EcoRI位点。
pMB160 用XbaI和EcoRI消化，从pBI121二元(binary)载体(Clontech)释放GUS-NOS DNA片段，然后亚克隆入SP72的XbaI和EcoRI位点。该质粒不含启动子
生物弹射(biolistic)转化后，根据在各种植物组织中驱动瞬时GUS表达的能力，评价各种启动子-GUS构建物的强度。见PCT申请No.99/04117，其描述了芸苔属的生物弹射转化。用于粒子轰击的装置是Biolistic PDS-1000/He系统(Dupont)。粒子轰击步骤用0.6μm金粒子按照Bio-Rad US/EG Bulletin1689进行。每次轰击送递约2μg DNA。轰击后，培养组织或将它们保存在潮湿环境中24小时，如PCT申请No.99/04117所述，然后染色测定GUS表达。Stopm在Gus Protocols：Usingthe GUS Gene as a Reporter of Gene Expression，Sean R.Gallagher(编辑)，1992，第103-13页，Academic Press，San Diego，California中描述了GUS染色方法。
用评分系统0-5，估计GUS染色的启动子长度。“0”表示未观察到蓝色点；“1”表示观察到1-10个蓝色点；“2”表示观察到11-100个蓝色点；“3”表示观察到101-1000个蓝色点；“4”表示观察到1001-5000个蓝色点：“5”表示观察到的蓝色点＞5000个。用小麦和大豆作了1-4个实验。用芸苔属、玉米和向日葵作了2-8个实验。表2列出了在实验中观察到的最高评分。
用pMB160构建物评价GUS基因的背景表达。在芸苔属的叶子、小孢子胚胎和根中，按所检验的组织不同GUS的背景表达从0-1不等。在大豆叶子中测得的GUS背景表达水平为1-2。
pMB168构建物中的fad2F启动子(3866bp)在芸苔属(蔓菁和蔓芥子)的叶子、根、小孢子胚胎、培养的组织、子叶和下胚轴中，瞬时表达GUS的评分水平分别为5、2、2、3和2。在大豆叶子(评分为5)和向日葵叶子(评分为3)中观察到高GUS表达。fad2F启动子能指导玉米叶子中GUS的表达评分为1。
当用fad2F启动子的片段时，也得到了GUS表达。已缺失5’1800核苷酸的pMB167构建物的fad2F启动子(剩下SEQ ID NO：5的核苷酸2081-3867)，在芸苔属叶子、小孢子胚胎和培养的组织中瞬时表达GUS，评分分别达到4、2和2。pMB175构建物的fad2F启动子(SEQ ID NO：5的核苷酸3197-3867)在芸苔属叶子和小孢子中瞬时表达GUS的水平评分分别达到3和1。pMB167和pMB168构建物的fad2F启动子以类似水平瞬时表达GUS，而用pMB175构建物检测到较低的GUS瞬时表达。这些数据表明pMB168的fad2F启动子具有指导GUS瞬时表达所需的所有元件，而没有减少表达水平(用全启动子构建物pMB167观察到的)。用pMB175构建物观察到的较低GUS活性可能表明已除去了影响启动子结构的活性元件或区域。
pMB166构建物的fad2D启动子(5800bp)在芸苔属叶子、根、小孢子胚胎和培养组织中瞬时表达GUS的水平分别达到4、1、2和3。也在大豆叶子中达到“3”表达水平。
fad2D启动子片段也表达GUS。pMB179构建物的fad2D启动子(685bp，SEQIDNO：4的核苷酸5113-5796)在芸苔属叶子中瞬时表达GUS至多达到级别3(取决于组织发育的阶段)。pMB构建物的fad2D启动子(1216bp，SEQ ID NO：4的核苷酸4581-5796)在芸苔属叶子中瞬时表达GUS的水平达到级别4(取决于所用组织的发育阶段)。pMB180和pMB166构建物的fad2D启动子瞬时表达GUS的水平相似，表明pMB180启动子具有指导GUS瞬时表达所需的所有元件。用pMB179构建物观察到略微较低的GUS活性，表明可能已除去影响启动子结构的活性元件或区域。
作为对比，用35S启动子检验了GUS的表达。35S启动子在芸苔属叶子、小孢子胚胎和培养组织中瞬时表达GUS的水平达到的级别分别为5、1和2。但35S启动子不能在根中表达可检测的GUS活性(表II)。在玉米和小麦叶子、大豆叶子和向日葵叶子中观察到表达水平分别为2、5和3。
pMB166和pMB168的fad2D和fad2F启动子在不同植物组织(表II)中指导了GUS报导基因的瞬时表达强度相似。如上述RT-PCR分析表明fad2D基因的表达比fad2F高。fad2D和fad2F基因内源性表达和fad2D和fad2F启动子瞬时分析之间的差异，可能是由内源性fad2D和fad2F转录物半衰期(half-live)的差异造成的。另外，fad2D和fad2F转录物的内源性表达可能受染色体结构的影响。
本文所述的数据提供了fad2D和fad2F启动子是功能性的，且可用于在所有植物组织中表达感兴趣的基因(瞬时和稳定转化后)的证据。
                    表II
        粒子轰击后用GUS瞬时表达测定不同启动子的GUS分析
品种     组织    35S(pMB146)   Fad2D(pMB166) Fad2D5′△(pMB179) Fad2D5′△(pMB180)   Fad2F(pMB168) Fad2F 5′△(pMB167) Fad2F 5′△(pMB175)
蔓芥子 嫩叶子     4     -    -     -     5     -     -
蔓菁 子叶和下胚轴     3     -    -     -     2     -     -
根     0     1    -     -     2     -     -
细胞培养物     2     3    -     -     3     2     -
小孢子胚胎     1     2    -     -     2     2     1
叶子     5     4     3     4     4     4     3
玉米 叶子     2     -    -     -     1     -     -
大豆 叶子     5     3    -     -     5     -     -
向日葵 叶子     3     -    -     -     3     -     -
小麦 叶子     2     -    -     -     0     -     -
“-”＝未测试
实施例4-转基因植物中启动子的活性：在fad2D或fad2F启动子的调控下，用GUS报告基因构建了pMB177和pMB178双载体。也可制备类似的含有编码HPH、NPTII或PAT核酸分子的构建物。
用土壤杆菌转化，用上述双构建物在canola植物中进行稳定的整合。评价转基因植物在不同发育阶段，各种组织中GUS活性。将fad2D和fad2F启动子调控下，GUS的表达与无启动子的GUS表达和在napin启动子调控下GUS的表达(用相同的载体骨架)比较。分别在含潮霉素、卡那霉素或glufosinate的培养基上选择用HPH、NPTII或PAT双构建物产生的转化体。将潮霉素、卡那霉素或glufosinate抗性的转化体在植物中再生，并进入繁殖程序。
其它实施例
易于理解已用详述的实施例联合描述了本发明，上述描述仅起说明作用，对本发明的范围无任何限制作用，本发明的范围由权利要求书明确。本发明的其它方面内容、优点和改进都在权利要求书的范围之中。
                                 序列表
<110>Shorrosh，Basil
<120>植物脂肪酸去饱和酶启动子
<130>07148/093001
<150>60/095，317
<151>1998-08-04
<160>7
<170>FastSEQ for Windows Version3.0
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1caucaucauc auaccgctac gctgctgtcc aa                                    32
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2caucaucauc auctcttccg ttacgccttc acgtag                               36
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3cuacuacuac uacataactt attgttgtac cag                                  33
<210>4
<211>5796<212>DNA<213>蔓菁<400>4tcgacctgca ggtcaacgga tctggtttta tggatacttt cgtgcactgg tttaagatgc     60aatgtttgac acatttctca acgtcggttg aaagagaaat ttgtgccgaa aacatcatta     120tacatatagc tactatcatg aaaatagtgc atgaattttt aaaattttga gttttcataa     180tgtatatatg attacaacaa atgtgaaata tgtattagtt tagtcatttt tagatcgtga     240acaagatgat tctgaaatta tgttagtctt ggtgaattat atagtaaagt aaattatggg     300tatttttaga aatttgtttt agcttgtttg ttgttgtttt ttaatgtata tacatcgatt     360aagttgtgtg gaacttacct atattttgtt gtgctagcta tctaaccatt ttttgttata     420acaataaaat atatcctttt ttatcagcag caataagata tatttttggg taattattat     480agttatattt aaaaatttaa ataatatcat actattatgt caaaactttg tgatctaaac     540acaaaaacta ttttactaaa attttcacat aattcaagtt atattatgta tttttttaat     600taaactttag ttttatcatt tgttatatgt tttacttttg gttctcaatt ttaaaaatct     660attatggttt tctatttttt tgtaattttt tcaaatttga aatttgtgac ttgaacaatt     720atatttcttg taagatatat atatatatat atatatatat atatatatat atactgactt     780tcactgcttc gttttcaaca aaataattta gtttctacat aaatatacag taattttgta     840agatgatttt cctcttttaa atttttttgg tttggtacct aaccaaaccg acccggtgtc     900cgaagtgctt agagctaaaa acccattcgg tatttgcctg gtcccgttac cgaaccggac     960ccattatttc ggttcggttt aaggtgtgga ctctgtttta agttaaaaac gtccagccct    1020aaggtaaatt ataaaacatt ggttgtgtgt ctgtctcctc ggtatggaaa acataataga    1080atccgaactt actagaccag tacgcgattt atttttcgtc ttacgtcgta agatgtcgaa    1140taaggaacaa gcaacgtcat tatacatgtt aaccgtatca aaggaatcga aacagcctca    1200tcttgcgaat ccggttatct tccatccttt tttcaggaca ctccggttta cctttttgtt    1260tgttcgatac gtcactccgg tttaaatcga atttaaaaaa aaaaatcggg aagagttagg    1320aaaaaaaagg aaaatctcat ctcaccggct caccctcgac gacaagacaa caccaccctt    1380agggttaaaa aggtttattt atcttattac tagggtcggc ccgccctacg ggcgggatat    1440tagttaattt gatattcact aaatgctcga gttgaaattt gttttaagat ttaagaattt    1500ggttatctgt tatgtcttac ttattagtat gcggtggtat agttgttttt cgattattct    1560tgctttggta ttgtatcaaa ttaactaatt gtataactca taattataga tgtacaaatg    1620tagatttgtg ataaagtctg atgacaatac tgtttttttt ttaattttta ttcatagtgg    1680agtgtgcatg tgtcagaaag aagcctgtaa caacttttat gtttttgtgt atggatttta    1740aatatatatt attttgtata atgcatactt gttctacaac atttgcttgt agactaaaaa    1800aattgttttt tatattttta aaagagaaaa tatttagtct agaatataac atgcacatat    1860gtattgacta tatatagaag ttgagtgtta ttttaaaata acatatgtat agagattttt    1920caactattac ttcactggca caaaacattt ataactgtaa ataatttctt ttaaaagcaa    1980aactaataaa agcgtgtaca acaaatgtat tttgatatat attatatgca tcaagttata    2040aaggttggaa acattgcaaa actgtttgga gcaaagtttt taacttcacg attttcatct    2100tgacgtcagt tcagtgtcgg ccctggccac aagcagaaga agcatgggct tccagctgac    2160acgataataa gtattttcgc ggccacatat ttataaaaag tgactttagc ctagtggttc    2220taagagaaat taccagtgct agaggtgctg ggttcaatta cccttaactg catttattta    2280ttttggccct aaatataaaa tgggacacgt gtcactccca aaacgcacaa attgatgatg    2340tggcttcacg ggagagaggc gaacatttct ttatatatat agattattct cttctctcta    2400ctcgttcctt ctccctttaa tcccgatttc gatttgtctt ctccgattcg ctctctagac    2460actcacacag tagggtttct aattcggatc tgtacacctt tagccatgga tgctcgtaag    2520aggggacggc ctgaagctgg ctcattcaac tccaatggcg gcggattcaa gaagtcgaag    2580caaggttagc tctttcgcta ttcctcttac tttgctatct cgaaagagtg ttatagttct    2640gttgtgcttc acttgctctg ttaaaggttg aaactttaga tcttaattga tggatgaata    2700gttcctttgt tgtcaatttg atttggggta gcgatgattt cttcaattcg agcttcgtac    2760tgtttttact caacaaaagt ttttgttttt agttatgaga ttctctagga aattcaagtt    2820tggatctttg ctgcagtctt tgatctgatg caaatctaaa gtccattaat ttttcagttt    2880aatgatggat gagcttttga taagtgatct taaagttaat caagcttata gttcttttaa    2940ctgtcttttg agtttgcttt agtttaatcc ctcttgtaac atattatcac catgcccaaa    3000gcttgagttt gctgtgattg aattagcttt tttatgtgtt agttattcat gtggtagttg    3060ttggtaaata atcctgaaaa ttctagagta gcagctttga tttaagtgtg aagttacata    3120tagatgagaa tttatgaatg atatgtatga ttctaaaagc aaatattatt gagcatcagc    3180aaagtcttaa ctaaagaaaa acacttaatc tttggaacag agatggaatc tggtttagga    3240agcaaatcga agccatgcac aaaatttttc aggttataat cctttttctt aactaaatta    3300atattcaaaa ttgttattta tagtctgagc ttcaaattaa caactaaaaa tgtatatgct    3360aatgaagtga ttagctctta ttacaggtat gtattattat tcatgctgaa ccagttaaaa    3420aaaagtttca atataacaaa tatgatattc gattataaat ttagaaatgt attgagctca    3480actggtgatt atagcgtaga aaatcaatcc acaccttttg tttgagctgt ggcagtagtt    3540aagatatgtg ttgtagtttt ctgtttggtg gtaagatatt agttattttg tgtttgtatc    3600atcatggtca tatagtgtct agtaaggttg ttgcattact gaatactggt gaacatgtcc    3660gtcgtagaca agcagttagc atagttgcta tgtgccaatt cttctgtgtt tcaactgttt    3720gttctcttgt gtcttctcaa tgccaatggt ttttaactct cttgacatat ttattatgcg    3780tctgttgcag cacttctggc tgtccttttg gtgagaactg ccatttcttg cactttgttc    3840ccggaggata caatcctgta tcacagatga caaacatggg atcacccatg tctcaagttt    3900ccagaaacat gcaaggatct ggtggtggtg gtggtggagg tcggttttcg gggagaggag    3960agtcagggcc tggccatgtc tctagctttg gtgcctcagc cacagccaag atcagtgtgg    4020atgcttcctt ggcaggcgca atcattggaa aaggtggagt ctgttcgaaa cagatatgtc    4080gtcagac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  <213>蔓菁
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  <213>蔓菁
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  <210>7
  <211>1102
  <212>DNA
  <213>蔓菁(Brassica napus)
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Claims (30)

1.一种分离的核酸分子，其特征在于，它包含脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件位于天然基因组中所述脂肪酸去饱和酶基因的5′。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述的脂肪酸去饱和酶基因是芸苔属fad2D基因。
3.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述的脂肪酸去饱和酶基因是芸苔属fad2F基因。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，选自：
(a)具有SEQID NO：4核苷酸序列的核酸分子；
(b)具有SEQID NO：5核苷酸序列的核酸分子；
(c)具有SEQ ID NO：4核苷酸5113-5796的核苷酸序列的核酸分子；
(d)具有SEQID NO：5核苷酸3197-3867的核苷酸序列的核酸分子；
(e)具有互补于(a)、(b)、(c)或(d)所述的核酸分子的核苷酸序列的核酸分子；和
(f)长度至少为100个核苷酸且至少有70％序列与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述核酸分子相同的核酸分子。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的(f)部分的核酸分子长度至少为400个核苷酸。
6.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的(f)部分的核酸分子长度至少为600个核苷酸。
7.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的(f)部分的核酸分子长度至少为800个核苷酸。
8.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的(f)部分的核酸分子至少有80％与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子相同。
9.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的(f)部分的核酸分子至少有90％与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子相同。
10.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的(f)部分的核酸分子至少有95％与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子相同。
11.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子片段含有SEQID NO：4的核苷酸5113-5796。
12.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子片段含有SEQ ID NO：4的核苷酸3179-3867。
13.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包含的第一核酸分子可操纵性连接于与第一核酸分子异源的第二核酸分子，所述的第一核酸分子包含脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件位于天然基因组中所述的脂肪酸去饱和酶基因的5′，和所述的第一核酸分子启动所述第二核酸分子的表达。
14.如权利要求13所述的核酸构建物，其特征在于，所述的构建物还包含可操纵性连接于所述第二核酸分子的第三核酸分子，所述的第三核酸分子包含脂肪酸去饱和酶基因的3′非翻译区域，所述的3′非翻译区域位于天然基因组中所述的脂肪酸去饱和酶基因的3′。
15.如权利要求14所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第三核酸分子选自：
(a)具有SEQID NO：6核苷酸序列的核酸分子；
(b)具有SEQID NO：7核苷酸序列的核酸分子；
(c)具有SEQ ID NO：6核苷酸1-894的核苷酸序列的核酸分子；
(d)具有SEQID NO：7核苷酸1-817的核苷酸序列的核酸分子；
(e)长度至少为100个核苷酸且至少有70％序列与(c)或(d)所述的核酸分子相同的核酸分子；和
(f)具有互补于(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核酸分子的核苷酸序列的核酸分子。
16.如权利要求13所述的核酸构建物，其特征在于，所述的构建物还包含将所述第一核酸分子可操纵性连接于所述第二核酸分子的第四核酸分子，所述的第四核酸分子是转运肽。
17.如权利要求13所述的核酸构建物，其特征在于，所述的构建物还包含将所述第一核酸分子可操纵性连接于所述第二核酸分子的第四核酸分子，所述的第四核酸分子是内含子。
18.如权利要求13所述的核酸构建物，其特征在于，所述的异源核酸序列编码核酶。
19.如权利要求13所述的核酸构建物，其特征在于，所述的异源核酸序列编码多肽。
20.如权利要求19所述的核酸构建物，其特征在于，所述的多肽具有除草剂抗性。
21.一种转化的植物细胞，其特征在于，所述的植物细胞含有核酸构建物，该核酸构建物包含可操纵性连接于异源核酸的脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件启动所述的异源核酸的表达，所述的调节元件位于天然基因组中所述的脂肪酸去饱和酶基因的5′。
22.一种转基因植物，其特征在于，所述的转基因植物至少含有一个核酸构建物，所述的核酸构建物包含可操纵性连接于异源核酸的脂肪酸去饱和酶基因的调节元件，所述的调节元件启动所述异源核酸的表达，和所述的调节元件位于天然基因组的脂肪酸去饱和酶基因的5′。
23.如权利要求22所述的转基因植物，其特征在于，所述的植物是双子叶植物。
24.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述的双子叶植物是苜蓿、大豆、油菜籽或向日葵。
25.如权利要求22所述的转基因植物，其特征在于，所述的植物是单子叶植物。
26.如权利要求25所述的转基因植物，其特征在于，所述的单子叶植物是玉米、小麦、黑麦、稻或高粱。
27.权利要求22所述的转基因植物的种子。
28.ATCC登录号为PTA-2535的质粒pMB102。
29.ATCC登录号为PTA-2536的质粒pMB103。
30.一种核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物含有的第一核酸可操纵性连接于对所述第一核酸分子为异源性的第二核酸分子，所述第一核酸分子含有脂肪酸去饱和酶基因的3′非翻译区域，所述的3′非翻译区域位于天然基因组中所述的脂肪酸去饱和酶基因的3′。
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JPH10215880A (ja) 植物プロモーター遺伝子、それを含むベクター、および形質転換体

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