CN1328237C

CN1328237C - 含有4－羟基－脯氨酸亚结构的肽的合成法

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Publication number: CN1328237C
Application number: CNB2003801053858A
Authority: CN
Inventors: B·维特费尔德; W·普里科斯佐维奇; B·埃尔布; W·帕欣格
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Recordati SA
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2007-07-25
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: ZA200504299B; CN1723182A; GB0229020D0

Abstract

本发明涉及制备肽的方法以及在该方法中所涉及的中间体，例如，制备式(VIII)化合物的方法，其中R₁₂和R₁₃如本文所定义。

Description

含有4-羟基-脯氨酸亚结构的肽的合成法

本发明涉及制备肽的方法以及在该方法中所涉及的中间体。

一个方面，本发明涉及：

(A)制备游离或盐形式的式I化合物的方法，

其中R₁为反应活性取代基或固相连接物；

R₂为反应活性取代基；且

R₃、R₄和R₅彼此独立地为氢或者与苯环连接的一个或多个取代基，所述取代基选自羟基、氨基、C_1-10-烷基、C_1-10-烷氧基、C_1-10-烷基氨基、二-C_1-10-烷基氨基、氨基甲酰基、C_1-10-烷基氨基甲酰基、二-C_1-10-烷基氨基甲酰基、卤代-C_1-10-烷基、卤素和硝基；

该方法包括

(a)使游离或盐形式的式VI化合物与亲电子试剂反应：

其中R₃、R₄和R₅如上定义；

R₉为-OH、-OM或-OMX，其中M为金属且X为亲核取代基；

R₁₀为-M或-MX，其中M为金属且X为亲核取代基；

并将所得化合物水解以形成其中R₂为羟基的式I化合物；

(b)任选将其中R₂为羟基的式I化合物转化为其中R₂不为羟基的式I化合物；

(c)任选将式I化合物中的R₁转化为另一R₁基团；

(d)任选将被保护形式的式I化合物去保护；以及

(e)当需要时，将以游离形式获得的式I化合物转化为所需的盐形式，反之亦然；

(B)制备固相载体系统的方法，该方法包括按照如上所定义的方法制备式I化合物，并将该化合物与适宜衍生或官能化的固相物质偶连；

(C)游离或盐形式的式V化合物，

其中R₃、R₄、R₅和R₉如上定义；且

R₇为亲核取代基；

(D)游离或盐形式的式VI化合物，

其中R₃、R₄、R₅和R₉如上定义；且

R₁₀为-M或-MX，其中M为金属且X为亲核取代基。

本发明提供了制备式I化合物的简单途径，其中式I化合物可用于固相化学合成。本发明的方法可直接生成与固相连接的式I化合物，或者氮其中R₁为活性取代基时，式I化合物可容易地在后期与固相偶连。活性取代基R₂的存在允许式I化合物在合成寡聚物和高聚物如糖肽、核苷酸和蛋白质中、尤其在固相肽合成中作为连接剂使用。式I化合物、特别是其中R₂为卤素的式I化合物还可在化学合成中用作保护试剂来保护官能团如氨基或羟基。

式V和VI化合物可在式I化合物的制备中用作中间化合物。

式VI化合物可通过使式V化合物与金属或有机金属化合物反应来制备：

其中R₃、R₄、R₅和R₉如上定义；且

R₇为亲核取代基。

式V化合物可如下制备：

(i)使式II化合物与金属或有机金属化合物反应，

其中R₆和R₇均为亲核取代基，且R₃如上定义，如果需要的话，R₃通过可除去的保护基团进行保护；和

(ii)使(i)中所得的化合物与式III化合物反应，

其中R₄和R₅如上定义，如果需要的话，通过可除去的保护基团进行保护。

本发明的方法可适宜地在单一反应容器中进行，而不需中间分离步骤。

本文中所用的术语具有下述含义：

“烷基”可以是直链或支链的。优选烷基为C_1-4-烷基。

“烷氧基”可以是直链或支链烷氧基。优选烷氧基为C_1-4-烷氧基。

“酰氨基”指式-NH-C(O)-R的基团，其中R是直链或支链的C_1-10-烷基、环烷基或芳基。优选R为C_1-4-烷基。

“酰氧基”指式-O-C(O)-R的基团，其中R如上定义。

“芳基”优选是C_6-10-芳基，例如苯基。

“卤素”指氟、氯、溴或碘。

“卤代烷基”指直链或支链的C_1-10-烷基，该烷基被一个或多个、例如一个、两个或三个卤原子、优选氟或氯原子取代。优选卤代烷基是被一个、两个或三个氟或氯原子取代的C_1-4-烷基。

“有机金属化合物”指其中有机基团的碳原子与金属结合的化合物。有机金属化合物优选是烷基金属化合物，例如烷基锂，例如直链或支链C_1-10烷基锂化合物，或者可以是芳基金属化合物，例如芳基锂。更优选烷基锂化合物为C_3-6烷基锂化合物，例如丁基锂或己基锂。

或者，有机金属化合物可以是有机镁化合物，例如直链或支链烷基镁或芳基镁化合物，优选是C_1-6烷基镁化合物。有机镁化合物通称为格氏试剂。有机镁化合物优选是有机镁卤化物，尤其是碘化物或溴化物。

在另一可选择的实施方案中，有机金属化合物可以是烷基-或芳基-锌化合物如C_1-6-烷基锌化合物，或者是C_1-6烷基-或芳基-锡化合物。

M优选为锂或镁。

R₁可以是适于将所述化合物与固相连接的反应活性取代基。R₁可适宜地是-C(O)R′、-C(O)-OR′、-C(O)-NR′R″、-R₁₂-NR′R″、-R₁₂-OR′、-NR′R″或-C(O)X，其中R′和R″彼此独立地为氢或者直链或支链C_1-10-烷基，例如C_1-4-烷基，R₁₂是直链或支链C_1-10-烷基，例如C_1-4-烷基，且X为亲核取代基，优选为卤素，例如氯。R₁可适宜地位于对位、邻位或间位，优选位于对位。

或者，R₁可以是与固相物质如聚苯乙烯连接的连接物。优选该连接物具有式-C(O)-P、-C(O)-OP、-C(O)-NR′-P、-R₁₂-NR′-P、-R₁₂-OP、-NR′-P、-C(O)-R₁₂-P、-C(O)-OR₁₂-P、-C(O)-NR′-R₁₂-P、-R₁₂-NR′-R₁₂-P、-R₁₂-OR₁₂-P、-NR′-R₁₂-P或-R₁₂-P，其中R′、R″和R₁₂如上定义，且P为固相物质。更优选R₁为-C(O)-OP、-C(O)-OR₁₂-P、-C(O)-NH-P、-C(O)-NH-R₁₂-P、-NH-R₁₂-P或-R₁₂-P，其中R₁₂为甲基，例如-CH₂-P。

R₂优选是适于将所述化合物与生物寡聚物或高聚物或其单体单元(如氨基酸或多肽)连接的反应活性取代基，。R₂可适宜地为羟基、酰氨基、酰氧基、氨基、卤素、巯基、C_1-10-烷氧基或C_6-10-芳氧基，优选为卤素。

式I至VII中的每个苯环可被一个或多个基团取代。例如，R₃可以指与式I、II和IV至VII中的苯环连接的一至四个取代基、优选一或两个取代基。R₄和R₅可以指与式I、II和IV至VII中的每个苯环连接的一至五个取代基、优选一至三个取代基。每个取代基可处于它们所连接的苯环的任意适宜位置。更优选R₄和/或R₅是处于其所连接的苯环的邻位或对位的取代基。

如果需要的话，每个R₃、R₄和R₅可被可除去的保护基团保护，例如当其含有不参与反应的-OH或-NH₂基团时。保护基团、其引入和除去的方法例如在“有机合成中的保护基团”(T.W.Greene等人，John Wiley & SonsInc.，第2版，1991)中有描述。优选每个R₃、R₄或R₅是不需被保护的基团，例如为上述所列出的除羟基、氨基或硝基以外的任何基团。

当R₃、R₄或R₅为卤素时，优选为氟或氯。当R₃、R₄或R₅为卤代烷基时，优选为三氟甲基。优选R₃为C_1-4-烷基、卤素或氢。优选R₄和R₅彼此独立地为C_1-4-烷基氨基甲酰基、二-C_1-4-烷基氨基甲酰基、氨基甲酰基、三氟甲基、氟或氯。优选R₄和R₅相同。

优选亲核取代基R₆和R₇彼此独立地为卤素，更优选为溴或碘，最优选R₆和R₇均为溴。R₇可适宜地位于对位、邻位或间位，优选位于对位。

在本发明的一个实施方案中，式II化合物首先与金属或有机金属化合物反应，形成式IV化合物：

其中R₃和R₇如上定义，且R₈为-M或-MX，其中M为金属且X为亲核取代基，优选为卤素。

当金属为锂或有机金属化合物为有机锂化合物时，R₈为-Li。当金属为镁或有机金属化合物为格氏试剂时，R₈为-MgX且X优选为卤素。然后式IV化合物与式III化合物反应，形成式V化合物。

式IV和V化合物不需分离或分开而可原位制备。

适用于该方法的亲电子试剂包括二氧化碳、异氰酸盐、腈、酰卤(如光气)，其导致形成例如其中R₁为羧基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基或酰基的式I化合物。或者，亲电子试剂可以是衍生化的固相物质，例如Merrifield聚合物，其能使式VI化合物与固相直接偶连。在一个实施方案中，亲电子试剂是式X′-(CH₂)_n-P化合物，其中X’为亲核取代基如卤素或甲苯磺酰氧基，n为1至4的整数，优选为1，且P为固相物质。

当亲电子试剂为二氧化碳时，该方法优选包括：首先使式V化合物与金属或有机金属化合物反应，形成如上定义的式VI化合物，以及使式VI化合物与二氧化碳反应，优选原位进行反应。

当亲电子试剂为二氧化碳时，优选形成盐形式或游离形式的式VII化合物：

其中R₃、R₄、R₅和R₉如上定义；且

R₁₁为-OH、-OM或-OMX，其中M为金属且X为亲核取代基，优选为卤素。

或者，羧基化步骤包含使式V化合物与二氧化碳在金属或有机金属化合物的存在下反应，形成式VII化合物。

水解步骤优选包含：使其中R₁₁为-OM或-OMX和/或R₉为-OM或-OMX的式VII化合物与水或酸反应，得到其中R₁为羧基且R₂为羟基的式I化合物，为盐或游离形式。适宜的酸包括氯化铵、乙酸、硫酸和盐酸。还可使用pH-缓冲的溶液。优选使用弱酸和/或该步骤在pH为4至7的条件下进行。反应温度通常为-50℃至50℃，优选为-10℃至10℃。

或者，其中R₁₁为-OM或-OMX的式VII化合物可与亲核试剂如胺或卤化物反应，形成式I化合物，其中R₁为-C(O)-NR′R″或-C(O)-X，且R′、R″和X如上定义。

本发明的方法通常在惰性有机溶剂中进行，优选在醚溶剂中进行，例如乙醚、四氢呋喃和叔丁基甲基醚。或者可使用烃溶剂。步骤(a)的反应温度通常为-30℃至+10℃，优选为-5℃至约0℃。反应可例如每当量式II化合物使用0.5至2当量、优选0.8至1.2当量、最优选约1当量的金属或有机金属化合物。每当量的式II化合物可使用0.5至2当量、优选0.8至1.2当量的式III化合物。

式V化合物与金属或有机金属化合物的反应温度通常为0℃至+50℃，优选为+20至+30℃。与亲电子试剂(如CO₂)反应的反应温度通常为0℃至-30℃，优选为-5℃至-10℃。水解步骤，例如酸水解步骤，通常在-10℃至+10℃、例如0至+5℃进行。每当量式V化合物优选使用0.5至2当量、更优选使用0.8至1.2当量的金属或有机金属化合物。

基团R₁和R₂可通过标准方法转化为上述可选择的R₁和R₂基团，例如通过酯化、酰胺化或亲核取代。例如，其中R₂为羟基的式I化合物可通过与酰卤如酰氯反应而转化为其中R₂为卤素的式I化合物。

优选式I化合物为游离形式。游离或盐形式的化合物可以以水合物或含有结晶所用的溶剂的溶剂化物的形式获得。

式I化合物可从反应混合物中回收，并以常规方法纯化。

原料式II或III化合物是已知的，或者可按照与本领域类似的方法制备。有机金属化合物可通过标准方法制备，例如通过使烷基或芳基卤化物与悬浮在乙醚或四氢呋喃中的金属如锂或镁反应来制备。有机金属化合物优选在惰性(不含氧)无水氛围如氮气中制备和使用。

本发明的方法可适宜地包括使其中R₁为反应活性取代基的式I化合物与固相物质偶合的其它步骤。适宜的固相物质例如在DE4306839A1中公开，其包括颗粒形式的天然存在或合成的有机或无机聚合物，所述颗粒形式例如是珠状，或者优选是在适宜惰性底物材料上的表层。适宜聚合物物质的实例包括交联聚苯乙烯，例如聚苯乙烯柱状物(pins)、Gly-HMDMA/DMA柱状物和HEMA柱状物。式I化合物可通过使固相上的基团与R₁反应而与固相物质方便地偶合。因此，固相物质优选包含反应活性基团，如氨基。优选其中R₁为羧基或活化羧基的式I化合物与载有游离氨基的聚合物反应，其中所述羧基例如通过与二异丙基碳化二亚胺反应而活化。

式I化合物可用作连接剂。因此，本发明的方法还可适宜地包括使任选与固相物质连接的式I化合物与生物寡聚物或高聚物或其单体单元偶合的其它步骤。该化合物可通过使生物分子中存在的基团与R₂反应而方便地与生物分子如氨基酸或多肽偶连。例如，当R₂为羟基且生物分子为多肽或氨基酸时，生物分子的末端羧酸可被R₂羟基酯化，任选最初经式I化合物与酰卤反应，使羟基被卤素原位取代。

另一方面，本发明提供了：

(E)制备式VIII化合物的方法，

其中R₁₂和R₁₃均为可除去的保护基团且R₁₂和R₁₃不同；

该方法包括使式IX化合物

与适宜的R₁₂供体化合物反应；

(F)用于上述方法的中间体，以通式XIV定义，

其中，R₁₆为除芴甲氧羰基以外的可除去的保护基团，并且不同于R₁₈；

R₁₇为氢或可通过水解或氢解可除去的保护基团；且

R₁₈为氢或除芴甲氧羰基以外的可除去的保护基团。

本发明提供了制备式VIII化合物的简单且有效的途径，其中式VIII化合物可用于合成肽，例如在WO02/10192中所描述的。式XIV化合物可在式VIII化合物的制备中用作中间化合物。

式IX化合物可由式X化合物制备，

其中R₁₃如上定义，

R₁₄为可除去的保护基团，且R₁₄不同于R₁₂和R₁₃，以及

R₁₅为可通过水解或氢解除去的保护基团。

保护基团、其引入和除去的方法例如在“有机合成中的保护基团”(T.W.Greene等人，John Wiley & Sons Inc.，第2版，1991)中有描述。适宜的保护基团供体化合物、例如氨基保护试剂是本领域技术人员众所周知的，例如提供下述保护基团之一的酐、卤化物、氨基甲酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺。

保护基团R₁₂优选是芴甲氧羰基。R₁₃或R₁₆优选是除芴甲氧羰基以外的保护基团，并且优选比R₁₂和/或R₁₄更不易于通过水解(例如碱催化水解)和/或氢解除去，例如比芴甲氧羰基和/或苄氧羰基更不易于除去。更优选R₁₃或R₁₆为叔丁氧羰基。

优选保护基团R₁₄或R₁₈比R₁₂更不易于通过水解除去，例如比芴甲氧羰基更不易于除去。R₁₄或R₁₈优选可通过氢解除去。适宜的R₁₄或R₁₈取代基包括苄氧羰基、1，1-二甲基丙炔氧基羰基、乙烯氧基羰基、N-羟基哌啶氧基羰基、9-蒽基甲氧羰基和苯基氨基硫代羰基、烯丙基、硝基苄基、三苯甲基、(对-甲氧基苯基)二苯基甲基、二苯基-4-吡啶基甲基或苄基磺酰基。优选R₁₄或R₁₈是含有氧基羰基的保护基团，例如苄氧羰基。

R₁₅或R₁₇可适宜地是：

(i)C_1-10-烷基，例如C_1-4-烷基，优选甲基、乙基、丙基或除叔丁基以外的丁基，更优选甲基。

(ii)C_3-8-环烷基，为未取代的或者被一个或多个C_1-4-烷基如甲基取代。优选环烷基是C_3-6-环烷基。

(iii)C_6-10-芳基，为未取代的或者被一个或多个稳定取代基如卤素或硝基取代。优选芳基是未取代或被一个、两个或三个卤素如氯取代的苯基。

(iv)(C_6-10-芳基)_1-3-C_1-10-烷基，为未取代的或者在芳基上(i)被一个或多个稳定取代基如卤素或硝基取代；或(ii)被两个与它们所连接的碳原子一起形成5-或6-元环的取代基所取代，其中所述的环任选含有一个或两个氮或氧原子。(C_6-10-芳基)_1-3-C_1-10-烷基优选是(i)(苯基)_1-3-C_1-4-烷基，更优选是苄基、二苯甲基或三苯甲基，其为未取代的或者在每个苯环上被一个、两个或三个卤素如氯取代，(ii)蒽基甲基，例如9-蒽基甲基，或者(iii)胡椒基。

(v)C_6-10-芳基-C_1-4-烷氧基-C_1-4-烷基，优选是苄氧甲基。

(vi)C_6-10-芳基-羰基-C_1-4-烷基，优选是苯甲酰甲基。

优选R₁₅或R₁₇是可通过氢解除去的基团，例如苄基、苄氧甲基、苯甲酰甲基、三苯甲基、胡椒基或9-蒽基甲基，优选是苄基。

式IX化合物可如下制备：(i)使式X酯化合物水解，得到相应的羧酸，以及(ii)除去保护基团R₁₄。优选水解步骤在除去保护基团R₁₄之前进行。保护基团R₁₄可通过还原氢化(氢解)方便地除去。当R₁₅不可通过氢解除去时，可适宜地遵循该包括水解步骤的途径。水解步骤优选是碱催化的水解，例如采用氢氧化钠，并且可在极性溶剂如甲醇中适宜地进行。

或者，式IX化合物可通过其中R₁₅为可通过氢解除去的基团、如苄基的式X化合物的氢化(氢解)来方便地制备。氢化步骤可采用适宜的催化剂如披钯炭来方便地进行。

式X化合物可如下制备：使式XI化合物

其中X为亲核取代基且R₁₄和R₁₅如上定义，

与式XII化合物反应，

其中R₁₃如上定义。该步骤可在任意适宜的有机溶剂中进行，优选在烃溶剂、更优选在甲苯中进行。

式XII化合物是被保护的1，2-乙二胺，其中一个氨基已经被可除去的保护基团保护。式XI中的亲核取代基X优选是卤素，例如氟、氯、溴或碘，更优选是氯。其中X为卤素的式XI化合物可通过使式XIII化合物

与酰卤反应来制备，所述酰卤例如是光气、三光气、氯甲酸苯酯或4-硝基氯甲酸苯酯，优选是4-硝基氯甲酸苯酯。该步骤可适宜地在有机碱如二甲氨基吡啶的存在下于非极性溶剂如甲苯中进行。

式XIII化合物可自商业购得，例如当R₁₅为甲基时可自商业购得，或者可按照本领域已知的方法通过使4-羟基-脯氨酸酯化而形成，例如通过与苄醇或甲醇酯化来形成。然后将所得酯通过与适宜的R₁₄供体化合物如苄氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺反应来进行保护。

式XI化合物不需分离或分开，因为式XIII化合物可与酰卤反应，并且该反应的产物随后可与式XII化合物在同一容器中反应。

在式IX化合物中加入保护基团R₁₂可适宜地在有碳酸钠/乙腈的存在下进行。

式VIII化合物可按照常规方法从反应混合物中回收并纯化。

在上述式VIII-XI和XIII化合物中，脯氨酸上的氧基取代基可处于顺式或反式位置，优选为反式。其顺式或反式异构体可采用相应的顺式或反式羟基脯氨酸作为原料来分别制备。

虽然没有具体描述原料的生成，但是这些化合物是已知的，或者可按照本领域已知的类似方法或如下所述进行制备。

在另一方面，本发明涉及制备其中R₁₂为芴甲氧羰基且R₁₃为除芴甲氧羰基以外的可除去的保护基团的式VIII化合物的方法，该方法包括使式VIII化合物与芴甲氧羰基供体化合物如芴甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺反应。

本发明将参考下述具体实施方案进行描述，其中使用下述缩写：

Fmoc＝芴甲氧羰基

Boc＝叔丁氧羰基

Cbo＝苄氧羰基

OSu＝N-羟基琥珀酰亚胺

HPTF＝庚烷级分

JT＝套层温度

HPLC＝高效液相色谱法

THF＝四氢呋喃

TBME＝叔丁基甲基醚

DMF＝二甲基甲酰胺

实施例1

4-(二苯基-羟基-甲基)-苯甲酸的制备

将1，4-二溴苯(47.2g，0.2M)加入THF(240ml)中。该澄清溶液冷却至-65℃。在30分钟内加入丁基锂溶液(0.22M，94ml，为在CHX中的20％溶液)。

搅拌5分钟后，在30分钟内加入二苯酮(36.4g，0.2M，在180ml THF中)(放热)。将混合物于-65℃另外搅拌30分钟。然后在30分钟内将温度升至-10℃，并将该溶液于该温度下搅拌1小时。

然后将反应混合物重新冷却至-65℃。在30分钟内加入丁基锂溶液(0.22M，94ml，在环己烷中的20％溶液)。

将所得悬浮液用200ml THF稀释。然后于-65℃通入90分钟以上的二氧化碳气体。温度升至20℃，并将混合物搅拌过夜。然后将混合物冷却至0℃，并在30分钟内加入氯化铵水溶液(120ml 10％溶液)。在此阶段形成4-(二苯基-羟基-甲基)-苯甲酸。

将混合物于45℃真空浓缩。残余物用乙酸调节pH为4，并与400mlH₂O混合。用2×150ml乙酸乙酯进行萃取。有机相再次用100ml水萃取。所合并的EST-相与10％氢氧化钾水溶液(2×120ml)一起振摇。所合并的水相于20℃用盐酸调节pH为1-2，然后用2×150ml TBME萃取。所合并的TBME相与50ml水及50ml饱和Na₂SO₄溶液混合，经硫酸镁干燥，于45℃真空浓缩，得到粗品。

将38.3g粗品于40℃溶于TBME(300ml)中。将所得澄清黄色溶液真空浓缩为60ml(蒸馏出240ml TBME)。将混合物于40℃搅拌1小时(结晶)。加入50ml HPTF，混合物冷却至0℃，并于0℃搅拌1小时。蒸馏并用2×15ml庚烷级分洗涤，于45℃真空干燥过夜，得到白色晶体。

4-(二苯基-羟基-甲基)-苯甲酸与固相的连接

将15g 4-(二苯基-羟基-甲基)-苯甲酸和7.54g羟基苯并三唑通过搅拌15分钟溶于140ml DMF中。加入15.3ml二异丙基碳二亚胺，溶液于室温下放置30分钟。然后将溶液在氨甲基化的聚苯乙烯的存在下于室温下搅拌过夜。在用DMF、甲醇和THF洗涤后，将连接剂衍生的载体真空干燥。

实施例2

4-(二苯基-羟基-甲基)-苯甲酸的制备(可选择的方法)

在孔干燥的100升Hastelloy-反应器中，在20分钟内向12升TBME中加入3.0kg正丁基锂(20％，在环己烷中；9.37mol)，温度保持为-5℃(澄清溶液)。在30分钟内，加入溶于16升TBME中的2.00kg 1，4-二溴苯(8.48mol)，保持温度为-5℃至0℃。添加容器用3升TBME冲洗。

于-5℃搅拌30分钟后，在20分钟内加入1.55kg二苯酮(8.50mol)在8升TBME中的溶液，保持温度为-5℃至0℃。添加容器用3升TBME冲洗。形成极少量的白色固体。在于-5℃搅拌15分钟后，取过程控制样品(HPLC1)。反应混合物于-5℃再搅拌25分钟，温热至+25℃。

在25分钟内加入3.2kg正丁基锂(20％，在环己烷中；10.00mol)，保持温度为+25℃至27℃。该加入过程略微放热，颜色变为微绿色。形成一些沉淀和浮渣。在搅拌20分钟后取过程控制样品(HPLC2)。根据HPLC2的结果，在于+25℃搅拌35分钟后再加入0.3kg正丁基锂。在搅拌15分钟后，取过程控制样品(HPLC3)。用1.5升TBME冲洗正丁基锂加入的路线，并将反应混合物冷却至-10℃。

在20分钟内逐份加入1.99kg干冰(固态CO₂)，保持温度为-10℃至-5℃。该反应为放热反应，并且形成微黄色的沉淀。在于-10℃搅拌15分钟后，加入11升TBME，反应混合物温热至0℃。在15分钟内加入5升18％盐酸水溶液，保持温度为0℃至+5℃。该加入过程放热，并且沉淀溶解(pH≤1)。

将澄清溶液转移至分离池中，反应器用5升TBME冲洗。在分离水相后，有机相用20升水洗涤。在两层分离后，有机相用13升5％KOH水溶液萃取。分离出碱性的水相，有机层再次用13升5％KOH水溶液萃取。将所合并的碱性水层转移至100升Hastelloy-反应器中。在20分钟内加入22升TBME和6升18％盐酸水溶液，温度为0℃至+5℃。该加入过程放热，并且形成白色沉淀，但是沉淀在低pH-值(加入HCl后pH≤1)下再次溶解。将混合物搅拌10分钟，并转移至分离池中。层分离，水相再次用16升TBME萃取。在层分离后，所合并的有机相于500mbar/45℃JT下浓缩至4-5升(蒸馏出32升TBME)，并加入晶种。温度升至50℃，缓慢加入20升HPTF并良好搅拌。白色沉淀于50℃JT搅拌2小时。套层温度调节为0℃并持续搅拌过夜(16小时)，使悬浮液冷却至0℃。过滤白色悬浮液，反应器用5升母液冲洗5次。残余物于45℃ JT真空(≥10mbar)干燥至恒重(过夜)。

实施例3

以Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe为原料进行的Fmoc-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH的制备

1.将二甲氨基吡啶(30.5g，250mmol)和Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-Ome(34.9g，125mmol)溶于甲苯(870ml)中。在20分钟内，于0℃至5℃将4-硝基氯甲酸苯酯(31.5g，157mmol)在甲苯(206ml)中的溶液逐滴加入该溶液中，并另外搅拌2小时。之后加入Boc-1，2-乙二胺(80.1g，500mmol)在甲苯(205ml)中的溶液并于环境温度搅拌12小时。然后加入浓硫酸(43.7g，450mmol)在水(873ml)中的溶液，同时维持温度为20℃至25℃。将白色悬浮液抽滤，并用甲苯(30ml)洗涤。甲苯相依次用水(450ml)和碳酸钠(10％w/w，450ml)洗涤，并再用水洗涤三次(每次450ml)。甲苯相通过馏出300ml而共沸干燥，被馏出的300ml用无水甲苯(2×300ml)连续替换。于50℃在无水甲苯溶液中加入庚烷(130ml)，2小时内冷却至0℃。过滤所沉淀的产物，用甲苯/庚烷1∶2v/v(70ml)洗涤两次，于50℃真空干燥，得到白色固态的Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OMe。

2.将Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OMe(20.0g，43.0mmol)溶于四氢呋喃与甲醇的1∶1混合物(380ml)中。加入1M氢氧化钠溶液(51.6ml)，所得混合物于环境温度下搅拌4小时。混合物通过加入硫酸(50ml，1M)调节pH为3。于50℃和50mbar下馏出四氢呋喃和甲醇，直至不再有溶剂馏出。残余的乳状溶液用乙酸异丙酯(113ml)和水(57ml)稀释，相分离，乙酸异丙酯相用氯化钠溶液(10％，113ml)洗涤。馏出(50℃，50mbar)溶剂，得到泡沫状的Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH(19.8g)，其可不经纯化用于下一反应。

3.将披钯炭(10％，1.94g，0.042mmol)加入Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH(19.4g，43.0mmol)在异丙醇(350ml)和水(37ml)中的溶液中。将氢气通入该溶液达4小时，滤除催化剂，残余物用异丙醇(50ml)与水(50ml)的混合物洗涤。异丙醇/水相经馏出2/3体积共沸干燥，所馏出体积用甲苯/异丙醇混合物(1∶1v/v)连续替换。残余的干燥溶液真空浓缩(50℃，200mbar)至干，得到(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH，为褐色固体，其可不经进一步纯化即可使用。

4.于40℃将(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH(5.0g，15mmol)溶于水(25ml)与三乙胺(1.5g，15mmol)的混合物中。30分钟内将Fmoc-OSu(4.65g，14mmol)在乙腈(25ml)中的溶液加入该澄清溶液中，并搅拌2小时。然后将反应混合物用盐酸(1m，13ml)调节pH至3，另外搅拌1小时。馏出乙腈(40℃，80mbar)并用乙酸异丙酯替换，得到两相混合物。分离出下部水相，残余的有机层用水洗涤，并用乙酸异丙酯替换蒸馏两次，然后浓缩成褐色泡沫。将该泡沫溶于乙酸异丙酯(25ml)，并逐滴加入庚烷(200ml)中，由此沉淀出产物。过滤固体，用乙酸异丙酯/庚烷洗涤，于40℃真空干燥，得到Fmoc-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH。

实施例4

以Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl为原料进行的Fmoc-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH的制备

Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl的合成在T.Makoto，H.Guoxia和V.J.Hruby的J.Org.Chem.2001，66，1038-1042中有描述。重复实施例3的方法，但使用Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl替换Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe，并且仅进行步骤1、3和4(省略步骤2)。

实施例5

Fmoc-(2R，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH的制备

重复实施例3或4的方法，但使用Cbo-(2R，4R)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2R，4R)-Pro(4-OH)-OBzl替换Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl。

实施例6

Fmoc-(2S，4S)-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH的制备

重复实施例3或4的方法，但使用Cbo-(2S，4S)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2S，4S)-Pro(4-OH)-OBzl替换Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl。

Claims

1.制备式VIII化合物的方法，

其中R₁₂为芴甲氧羰基，R₁₃为可除去的保护基团且R₁₂和R₁₃不同；该方法包括使式IX化合物

与芴甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺反应。

2.权利要求1的方法，其中式IX化合物如下制备：

(i)使式X化合物水解，

其中R₁₃如权利要求1定义，

R₁₄为可除去的保护基团且R₁₄不同于R₁₂和R₁₃，以及

R₁₅为可通过水解或氢解除去的保护基团，

得到相应的羧酸，以及

(ii)除去所得羧酸中的保护基团R₁₄。

3.式XIV化合物

其中R₁₆为除芴甲氧羰基以外的可除去的保护基团，且不同于R₁₈；

R₁₇为氢或可通过水解或氢解除去的保护基团；以及

R₁₈为氢或除芴甲氧羰基以外的可除去的保护基团。

4.权利要求3的化合物，其中R₁₆为叔丁氧羰基。