JPH0352899A - カルシトニン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物学的活性を有する新規力ルシトニン置換類
似体に関するものである。

〔従来の技術〕

既知の天然カルシトニンは鰻、鮭、鶏、豚，ヒト，ウシ
、羊、ラット，が知られて釦シ，すべて３２個のアミノ
酸により構成されている。例えば鰻カルシトニンは次式
のべプテド構造を有している： また，％開昭６３−２７７６９８．特開昭６３−２８４
１９８，！％開昭６３−２８７８００、Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｖｏｌ　　１５９　　Ｐ１２５（１９８６）−Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　．１　１　７　．
Ｐ８０（１　９８７　）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｖｏｌ
．１　６２　．Ｐろ９９（　１　９８７　）　　には，
天然カルシトニン置換類似体が開示されている。

〔発明の解決しようとする課題〕

本発明は従来知られていなかったカルシトニンの置換類
似体を新規に提供することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は公知のカルシトニ／と同一の種類の生物学的活
性を有し，５１個のアミノ酸配列によって構成される〔
１．７−ジーアラニン，デス−２２−ｆ口シン〕カルシ
トニンを提供するものである。

本発明のカル／トニン置換類似体と，公知の天然力ルン
トニ／との構造上の相違点は、（１）１及び７の位置の
７ステインがアラニンで置換されてお，ｊ）１２１２２
の位置のチロシンが欠失していることである。これらの
新規ペプテドはペプチドの合戒修飾についてのＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＰ命名法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．．（　１９８
４）Ｖｏ１．２１９，３４５−３７７）に従って、〔１
，７−ジーアラニン、デス−２２−チロシン〕カルシト
ニンと命名される。この新規なペプチドはカルシトニ／
の合成に通常必要とされるアミノ酸の逐次的付加と〔１
，Ｚーシーアラニン，テスー２２−チロシン〕カルシト
ニンを構或するために必要な１番目と７番目の位置での
アラニンの導入、訃よび２２番目のテロシ／の欠失によ
って製造される。

基本となるカルシトニンとしては，前記種々の天然カル
シトニンであってよいが、好豊しくは、鰻カルシトニン
、鮭カルシトニン、釦よび鶏カルシトニンである。天然
の鰻カルシトニンに対する本発明のカルシトニン置換類
似体は下記式（１）で表わされるペプテド構造を有して
いる。

Ａｌ　ａ−Ｓｓ　ｒ−Ａａｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　１　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　
−Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌ　ｕ　一Ｌｅｕ　
−Ｈｉ　ｓ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｅ　ｕ　−Ｇｌ　ｎ　−
Ｔｈｒ−Ｐｒ　ｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　
１　−Ｇｌ　ｙ−Ａｌ　ａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ　−Ｐｒｏ
−ＮＨ！＠　＠　１１　・［１１また，天然の鮭カルシ
トニンに対応する本発明？カルシトニン置換類似体は下
記式（２）で表わされるペブチド構造を有している。

Ａｌ　ａ−Ｓｅ　ｒ　−Ａｓ　ｎ−Ｌｅ　ｕ−Ｓｓ　ｒ
　−Ｔｈｒ　−Ａｌ　ａ−Ｖａ　１　−Ｌｅ　ｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙ　ｓ　−Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ　−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌ
　ｕ−Ｌｅｕ　−Ｈｉ　ｓ　｛ｙ　ｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌ
　ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒ　ｏ　−Ａｒｇ−Ｔｈｒ　−Ａｓ　
ｎ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ　−Ｓｓ　ｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ
　−Ｐｒｏ−　ＮＨ，　　　　　　　　　　ｅ　＠　・
ｓ　（２１さらに、天然鶏カルシトニンに対応する本発
明のカルシトニ／置換類似体は下記式（３）で表わされ
るペプチド構造を有している。

Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ−Ｓｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ　−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌ　ｕ−Ｉｊｕ−
Ｈｔ　ｓ　一Ｌｙｅ　−　Ｌｅｕ　−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈｒ
　−Ｐｒ　ｏ−Ａｒｇ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ
　−Ｇｌｙ−Ａｌ　ａ−Ｇｌｙ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ−　
ＮＨｚ　　　　　　　　　　＠　ｅ　＊　＊　（３１本
ペプチドを合或するに当ってはボリマー樹脂を利用した
固相合或法や一般的な有機合成法である液相合成法が利
用できる。固相合成に用いる樹脂にはクロロメチル樹脂
，オキシメチル樹脂、４−（オキシメチル）フヱニルア
セタミドメチル樹脂，ペンズヒドリルア■冫樹脂、ポリ
アクリルアミド樹脂などが利用できる。１ｆｃ用いられ
るアミノ酸はすべて光学的にＬ体であり、必要に応じて
官能基を保護した保護アミノ酸が用いられる。

ぬ−アミン保護基としてはカルボベンゾキシ基（Ｚ），
第３プチルオキシ力ルボニル基（Ｂｏａ）．　　９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ホ
ルミル基（ＨＣＯ），アセチル基（Ａｃ）などがある。

乙一カルボキシ保護基としてはベンジル基（Ｂｚｌ）、
第５プテル基（Ｂｕ’），メチル基（Ｍｅ）、　エチル
基（，Ｅｔ）、フエナシル基（Ｐａｃ）などが利用でき
る。１たアミノ酸側鎖の官能基の保護基としては，ベン
ジル基（　Ｂｚｌ　），Ｐ　一トルエンスルホニル基（
Ｔｏｓ）、ｐ−ニトロフェノール基（Ｎｏｔ　）、ペン
ズヒドリル基（Ｂｚｈ）、アセタミドメチル基（Ａｃｍ
）、第３プチル基（Ｂｕｔ），第５プチルオキシ力ルボ
ニル基（Ｂｏａ）．シクロヘキシル（ＣＨｅＸ）、４−
メトキシ−２．３，６２、｝リメチルベンゼンスルホニ
ル基（Ｍｔｒ）などが利用できる。これらの保護基は目
的に応じて１つまたはそれ以上を任意に選択して利用で
きる。

？ミノ酸の逐次付加反応はカルボジイミドを用いた脱水
縮合や、活性エステルを利用する方法などが利用できる
。カルポジイ■ドとしては，ジシクロへキンルカルポジ
イミド，１−エチル−６（３−ジメチルアミノプロビル
）カルボジイミドなどが利用でき、活性エステルとして
はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（−０Ｓｕ）
、ペンタフルオロフェノールエステル（−０Ｐｆｐ）、
ジヒドロキソベンズトリアジンエステル（−０Ｄｈｂｔ
）などが利用できる。

反応触媒としてはＤＭＦ，ＴＨＦ．ジクロロメタン，ク
ロロホルム，酢酸エチル，ジオキサン，ＤＭＳＯ−　Ｎ
−メチルピロリドン、ピリジン、水などが利用できる。

保護基の脱離剤としては、保護基の種類、目的に応じて
、フッ化水素、トリ７ルオロ酢酸，トリフルオロメタン
スルホン酸，アンモニア／メタノール、臭化水素／酢酸
，水素／パラジウム炭素，酢酸／亜鉛粉末，アルカリ／
水一メタノールなどが利用できる。

合成途中または合成後の精製法としては逆相、純相、イ
オン交換、ゲル済過などの各種クロマトグラ７イーや再
結晶などが利用できる。

〔実　施　例〕

く実施例１〉 （１）べ／ズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂へのプロリ
ンの導入 ＢＨＡ＠脂５　？　（　−ＮＨ，　：　０．５關ｏ　ｌ
．／Ｓ’　）・をＤＭＦ５０ｍｌに懸濁し，時々攪拌し
ながら膨潤させた。上澄をデカンテーションにて除去し
、更に５０ｍｌのＤＭＦを加え洗浄した後、グラスフィ
ルターで枦過した。これを２００ｍｌのナスフラスコに
入れ，ＤＭＦ　５０ｍｌを加えた後，　Ｂｏｃｌ？ｒｏ
１０ｗｏｌ（２．１５ＳＦ）を加え５分間攪拌した。さ
らにＤＣＣ　１　２ｍｏｌ　（　２．５　ｆ　）、ＨＯ
ＢＴ１　：２ｍｏｌ（１．６２ｆ）加え、終夜室温で攪
拌した。グラスフィルターで炉過した後、ＤＭＦ、塩化
メチレン、メタノール、塩化メテレン、メタノールの順
で洗浄し、最後に塩化メチレンで洗浄した後，自然乾燥
した。得られた樹脂１■を加水分解してアミン酸分析装
置にてＢｏｃＰｒｏ　ｆｆの導入量を定量したところ口
．３９聰ｏｆ／Ｓ’　　であった。

（２）　　残余アミ７基のブロックと脱保護（１１で得
られた樹脂０．６１に塩化メテレン１００ｍＢを加え，
充分膨潤させたのち、グラスフィルターで炉過し、１０
Ｖ／Ｖ％無水酢酸の塩化メテレン溶液１００ｍＡ’を加
え１時間攪拌した。ごく少量を取り出しニンヒドリン試
薬で陰性であることを確認した後，Ｐ過し，塩化メチレ
ンで充分洗浄した。これをＩＷ／Ｖ％のインドールを３
む５０Ｖ／Ｖ％トリフルオ口酢酸（ＴＦＡ）の塩化メチ
レン溶液５０ｍｌに懸濁し、室温で３０分間反応させた
後、グラスフィルターで炉過し、塩化メチレン、メタノ
ール、塩化メチレン、メタノール、塩化メチレンの順で
洗浄した。

次に１０Ｖ／Ｖ　　％　ト！Ｊエテルアミンの塩化メチ
レン溶液５０ｍｌを加え５分間攪拌して中和し、グラス
フィルターでｐ過した後、上記と同様の方法で洗浄し、
ＤＭＦ　１　０ｍｌ　Ｋ懸濁した。

（３）　　アミノ酸の逐次付加反応 （２）で得た樹脂のＤＭＦ’懸濁液を内径１０閣のカラ
ムに充填し、以下のステップでＦｍｏｃ−アミノ酸活性
エステルを順次付加した。

の付加 力２ムにＤＭＦを５　ｒｎｌ　／分で１５分間流し、洗
浄した後，　Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（　Ｂｕ　ｔ）　Ｏ
Ｄｈｂｔ　Ｏ．８■ｏｌ（０．４５ｆ）ｔハイドロキシ
ペンゾドリアゾールのＤＭＦ溶液（０．３３Ｍ）に溶か
し、５　ｍｌ　／分の流速で循環させながら室温にて３
０分間反応させた。反応後ＤＭＦを５ｍ６７分で１０分
間流し、カラムを洗浄した。

第２ステｙ　７　：　Ｆ’ｍｏ　ｃ　−　Ｇｌ　’！　
−ＯＰｆ　ｐの付加第１ステップ終了後２０Ｖ／Ｖ　　
％ピペリジンのＤＭＦ溶液を５　ｍｌ　／分で１０分間
流しＦｍｏｃ一基を除去した後、ＤＭＦを５ｍｌ７分で
１０分間流し、洗浄した。第２ステップに用いるＦｍｏ
ｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ　Ｏ．８ｍ＋ｏｌ　　（０．３６
７．Ｓ’）をハイドロキシベンゾ｝　ＩＪアゾールのＤ
ＭＦ溶液（０．３３Ｍ）に溶かし、５　ｍｌ　／分の流
速で循環させながら室温にて３０分間反応させた。反応
後−ＤＭＦを５ｍｌ７分で１０分間流し、カラムを洗浄
した。

第３ステップから第２９ステップ 第３ステップから第２９ステップまでは第２ステップと
同一の方法条件を用い，表１に示すＦｍｏ　ｃ−　アミ
ノ酸活性エステルを順次付加した。

第３０ステップ：　Ｆｍｏｃ　−　Ｌ　−　Ａｌａ　−
ｏｐｔ’　ｐの付加第２９ステニソプ終了後＋　２０Ｖ
／Ｖ　　％ビベリジン（７）　Ｄ　Ｍ　Ｆ溶液を５ｍｌ
ｌ分で１０分間流し、Ｆｍｏｅ基を除去した後、ＤＭＦ
を５　ｍｌ　／分で１５分間流し，洗浄した。第３０ス
テップばに用いるＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＰｔｐ　　
Ｏ。８ｍｏｌ　（０．３７．８ｆ　）をノ１イドロキシ
ベンゾトリアゾールのＤＭＦｌｉ（０．３３Ｍ）　　に
溶かし、５　ｍｅ　／分の流速で循環させながら室温に
て３０分間反応させた。反応後ＤＭＦを５ｍｌｌ分で１
０分間流し、カラムを洗浄した。再び２　０　Ｖ／Ｖ　
％ビペリジンのＤＭＦ溶液を５　ｍｌ　／分で１０分間
流しＦｍｏ　ｃ基を除去した後、ＤＭＦ、塩化メチレン
の順で５　ｍｅ　／分で各１５分間洗浄した。

（４１　　側鎖保護基の脱保護とべブチドの切や出し第
３０ステップを終了した樹脂をカラムから取シ出し、グ
ラスフィルター上でｔ−アミルアルコールで充分洗浄し
たのち、エーテルで洗浄し、自然乾燥した（１．１４ｆ
）。

コレｔ　１．２　５Ｗ／Ｖ　　％　，ｙ　ｘ．　／　−
　ル．、１．２５Ｗ／Ｖ係エタンジチオール、４７．５
Ｖ／Ｖ　　憾ＴＦＡを含む塩化メテレン溶液に懸濁し、
１時間放置した後，炉過し、エーテルで洗浄して自然乾
燥した。

これをテフロン（商標）容器に入れ、エタンジチオール
０．　５扉ｌ＋アニソール０．５ｍｌ．トリクレゾール
０．　５　ｒｔｔｌを加え、１０分間放置した後ドライ
アイス一二タール（−６０℃）で冷却して密封，減圧下
、フフ化水素２０ｍｌを容器内に導入した。０℃で１時
間反応させ側鎖の保護基を脱離した後、減圧下でフフ化
水素を除去した。テフロ／容器の密封を解除し，エーテ
ル２００ｍ／！を加え３０分間攪拌した後、生じた沈澱
物と樹脂を済取し，エーテルで充分洗浄して自然乾燥し
た。

沈澱物をＩＯＶ／Ｖ　　％酢酸水溶液に溶解し、グラス
フィルターで炉過して樹脂を除去した。ｐ液を濃縮し、
凍結乾燥して粗ペブチド４００ｍ９を得た。

（５）粗ペプテドの精製 粗ペプテド３５０Ｉｎ９を［］．ＩＶ／Ｖ　　％ＴＦＡ
を含む水溶液に溶解し高速液体クロマトグラフイー（Ｈ
ＰＬＣ）（逆相ＯＤＳ′ｈ７ム）に添加し、Ａ液／Ｂ液
＝２０％、Ａｉ／Ｂ液＝３０％，Ａ液／Ｂ液＝４０係の
順で溶出し，３０優溶出の分画を集め凍結乾燥した。

凍結乾燥後同一の方法で再び精製を行い、精製ベブチド
４２ｍ９を得た。

（Ａ液：０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルＢ液：０
．１係ＴＦＡを含む水） （６）（１，７−ジーアラニン．デス−２２−チロシン
〕カルシトニンのアミノ酸分析 得られた精製ペプチドの一部を１％フェノールを含む６
ＮＨＣｌ　で加水分解し，そのアミノ酸組或を分析した
。（表１） （表　１） 理論値（ＭｏｌｃＬ）　　　分析値（Ｍｏ１％）　　　
　回収率（憾）ＡＳＸ　　　　６．４５２　　　　　　
６．６０３　　　　１０２．３ＴＨＲ　　　１２．９０
３　　　　　１２．３５９　　　　　９５．８ＳＥＲ　
　　　９．６７７　　　　　　ａ７３６　　　　　９０
．３ＧＬＸ　　　　９．６７７　　　　　１０．４９７
　　　　１０８．５ＧＬＹ　　　　９．６７７　　　　
　１０．２７５　　　　１０６．２ＡＬＡ　　　　９．
６７７　　　　　１０．２８９　　　　１０６．３ＶＡ
Ｌ　　　　６．４５２　　　　　　６．４６１　　　　
１００．１ＬＥＵ　　　１６．１２９　　　　　１５．
６３１　　　　　９６．９ＴＹＲ　　　　０　　　　　
　　　　０　　　　　　　　　０ＨＩＳ　　　　３．２
２６　　　　　　２．９８１　　　　　９２．４ＬＹＳ
　　　　６、４５２　　　　　　６．３４１　　　　　
９８．３ＡＲＧ　　　　３．２２６　　　　　　３．０
８９　　　　　９５．８ＰＲＯ　　　　６．４５２　　
　　　　６．７３２　　　　１０４．３（７）（１．７
−ジーアラニン，デス−２２−テロシ／〕カルシトニン
の生物学的アッセイ〔１，７−ジーア２ニン、デス−２
２−ｆ口シン〕カルシトニンの生物学的活性をラットの
血清中カルシウム低下作用を指標として測定した。

得られたカルントニン類似体精製物を０．　１％ＢＳＡ
を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）に
溶解した後，ＳＤ系ラット（４週齢雄）の尾静脈よシ投
与した。投与量は１匹当り０．５ｎｇ−　１．０ｎｇ．
　２．０ｎｇ、４．０ｎｇ−　８．Ｏｎｇ．　１６．０
ｎｇ、８０．０ｎｇ　　であった。

投与後１時間経過した後，抑清中のカルシウム濃度をＯ
ＣＰＣ法（和光純薬：カルシウムＣ−テストワコー）に
よる比色定量（５７０ｎｍ）によシ測定した。血清カル
シウム濃度を１０％低下させる量ｉ１０ｍＵとしてカル
シトニン１■あタシのＵ数を求めたところ、１３００Ｕ
／■　であった。

〔発明の効果〕

本発明は，天然型カルシトニンのシステインをアラ二ン
に置換することにより，環状構造を持たない安定な化合
物であるという特徴を有している。

特に合成にあたっては，環状化反応が不要であるので，
副反応物が少なく精製が極めて容易である。

また２２番目のチロシンを欠失させることにより，合成
が簡略化できるという効果も有している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、〔１，７−ジ−アラニン、デス−２２−チロシン〕
   カルシトニン ２、カルシトニンが鰻カルシトニン置換類似体、鮭カル
   シトニン置換類似体、又は鶏カルシトニン置換類似体で
   ある請求項第１項記載のカルシトニン。 ３、構造式： Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａ
   ｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
   ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
   −Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
   Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｎ
   Ｈ＿２、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔ
   ｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
   ｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇ１ｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ
   −Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−
   Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ１ｙ−Ｔｈｒ−Ｐ
   ｒｏ−ＮＨ＿２、又はＡｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ
   −Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
   Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈ
   ｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ
   ｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
   −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ＿２、である請求項第１項記載
   のカルシトニン。