CN1324865A - 利用转基因动物乳腺生产人乳铁蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用牛(bovine)的乳球蛋白(BLG)5'侧翼序列、部分外显子内含子序列及3'侧翼序列为乳腺特异表达的调控序列。以人乳铁蛋白(HLF)全长cDNA为编码序列,构建融合基因BLG－HLF,该融合基因可以在催乳山羊乳腺中瞬时表达。以该融合基因显微注射山羊受精卵原核,获得了人乳铁蛋白乳腺特异高效表达的转基因山羊。

Description

利用转基因动物乳腺生产人乳铁蛋白的方法

本发明涉及基因工程和转基因动物领域，具体地，本发明涉及一种调控外源基因(如人乳铁蛋白)在动物乳腺组织特异性表达的载体，以及在动物乳腺中特异性表达外源基因的方法。

动物乳腺组织具有较强的合成蛋白的功能，如能利用转基因技术将外源基因特别是有重要医疗价值的基因如人促红细胞生成素基因，人生长激素基因等转入动物体内，就有可能生产出大量的药用蛋白。人体内的许多蛋白的生理活性与翻译后修饰有关，通过原核表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具备生物活性。以真核细胞培养来表达这些蛋白需要较高的成本，以转基因动物来表达外源蛋白，其产物接近天然即具有较高的生物活性、表达量高而且成本底。

用显微注射的方法转入动物体内的基因，其在动物体内的基因组的整合及表达是随机的，如果外源基因产物具有较强的生物活性，外源基因的随机表达或异位表达就有可能造成转基因动物体的疾病甚至死亡。如促红细胞生成素的异位表达会引起高红细胞血症。

因此，本领域迫切需要在牛和羊等动物的乳腺组织中特异性表达外源基因的载体和技术。

本发明的目的就是提供一种具有乳腺组织特异性的且高效表达外源基因的载体。

本发明的另一目的是利用转基因动物乳腺生产人乳铁蛋白的方法，从而在动物乳腺中大量表达人乳铁蛋白。

在本发明的第一方面，提供了一种乳腺特异性表达融合基因BLG-HLF，该融合基因从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、人乳铁蛋白cDNA序列、牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列。较佳地，在牛乳球蛋白的5′侧翼序列和人乳铁蛋白cDNA序列之间还有一接头序列；和/或在人乳铁蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外显子1之间还有一接头序列。

在本发明的一个实施例中，在牛乳球蛋白的5′侧翼序列和人乳铁蛋白cDNA序列之间的接头序列是CTCGACGACTCTAGAGGATCCA；而在人乳铁蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外显子1之间的接头序列是ATCGTCGAGCTG。

更佳地，牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和/或人乳铁蛋白cDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或牛乳球蛋白外显子1、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和/或牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种生产人乳铁蛋白的方法，它包括步骤：

将上述的乳腺特异性表达融合基因，用原位注射入动物乳腺，从而在动物乳腺中的瞬时表达；

获得混合物形式的人乳铁蛋白或分离出表达的人乳铁蛋白。

较佳地，该方法还包括步骤：

用一对从mRNA水平检测人乳铁蛋白在山羊乳腺中表达的引物和一对从mRNA水平检测山羊乳腺内源性乳铁蛋白表达的引物，通过RT-PCR法检测乳铁蛋白在乳腺中的瞬时表达，

其中，人乳铁蛋白的特异性引物为：

引物A:5′-5GCGGCTTGAGCGTAAGGCAG-3′和

引物B:5′-AGAGTTCCAGGTAAGGCTAGTG-3′；

羊乳铁蛋白特异性引物为：

引物C:5′-AGAATTCCAAGTGAGCCCCTCA-3′和

引物D:5′-GCGAGCAGAGCGGCCAGAA-3′；

将经瞬时表达检验的融合基因BLG-HLF显微注射动物受精卵原核制备转基因动物。

本发明还提供了另一种生产人乳铁蛋白的方法，它包括步骤：

(1)将上述的乳腺特异性表达融合基因BLG-HLF，显微注射动物受精卵原核，制得基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；

(2)将步骤(1)中的基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵发育成转基因动物；

(3)从动物乳腺分泌的乳汁中获得混合物形式的人乳铁蛋白或分离纯化出表达的人乳铁蛋白。

本发明还提供了一种产生转基因动物的方法，该动物的基因组整合了所述的融合基因BLG-HLF并且在其乳腺中有人乳铁蛋白的特异表达，它包括步骤：

(1)将上述的乳腺特异性表达融合基因BLG-HLF，显微注射动物受精卵原核，制得基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；

(2)将步骤(1)中的基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵发育成转基因动物。

本发明还提供了一种调控外源基因在动物乳腺中特异性表达的载体，该载体从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、牛乳球蛋白外显子1、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列，

且在牛乳球蛋白的5′侧翼序列和牛乳球蛋白外显子1之间有多克隆位点，以便引入待表达的外源基因；

用于在细菌中复制的自我复制序列。

在附图中，

图1是BLG-HLF融合基因元件构成示意图。

图2是BLG-HLF融合基因构建流程图。

图3是BLG-HLF融合基因酶切图谱。

图4是牛BLG的5′侧翼序列和外显子1非编码序列。

图5是人乳铁蛋白全长编码序列。

图6是牛BLG外显子1至外显子3序列。

图7是牛BLG外显子6至3′侧翼序列。

图8,9是融合基因BLG-HLF羊乳腺瞬时表达的检测。

图10是融合基因BLG-HLF羊基因组的整合检测。

图11是转基因羊乳铁蛋白乳腺表达的检测。

乳铁蛋白是一种多功能的糖蛋白，具有抗菌和抗病毒等作用，是一种有重要价值的医用蛋白。在本发明的一个实施例中，选用人乳铁蛋白作为研究的外源基因。

本发明首先提供了一种调控外源基因在动物乳腺组织特异性表达的载体。为了使外源基因(人乳铁蛋白)在动物乳腺中特异表达，本发明利用牛乳蛋白基因的乳腺特异表达调控元件构建了乳腺特异表达的载体。该载体包括牛乳球蛋白基因的5′侧翼序列，部分外显子和内含子序列，3′侧翼序列。位于5′侧翼序列下游的供外源基因插入的多克隆位点，以及供载体连同插入其上的外源基因在大肠杆菌中复制的pSP72序列。

在本发明的一个实施例中，所构建的载体的具有如下序列元件：一、包括了牛乳球蛋白基因(BLG)的5′调控序列(-1216～+45bp)二、包含了牛乳球蛋白基因外显子1至外显子3(+48～+1878bp)、外显子6至外显子7(+4109～+4723)及3′侧翼序列(734bp)。

在本发明另一实施例中，还以该特异性表达载体为基础，构建了表达人乳铁蛋白的融合基因BLG-HLF，该融合基因的特点为：HLF全长编码序列cDNA 5′端以BamHⅠ连于BLG的5′调控序列及外显子1非编码序列的下游，3′端以XhoⅠ连于BLG外显子1编码序列至3′侧翼序列的上游。该融合基因的HLF cDNA位于转录起始位点的下游，紧邻BLG的5′-UTR，因而HLF能在BLG启动子作用下而转录，转录体为融合mRNA，其编码序列为HLF cDNA，而5′-UTR及3＇-UTR来源于BLG。因HLF cDNA提供了终止密码，因而只有HLF蛋白被编码，而BLG不被翻译。

本发明的载体/融合基因所包含的调控序列含有乳腺特异表达的元件，能保证外源基因在乳腺特异表达。但该调控序列只有数千碱基，外源基因的表达呈现位置效应即外源基因的表达水平与其在染色体的整合位置有关。

在本发明的另一实施例中，将以此载体构建能在乳腺特异表达人乳铁蛋白的融合基因BLG-HLF转入动物时，从而在动物乳腺中大量表达人乳铁蛋白。

适用于本发明的动物包括哺乳动物，较佳地该动物选自下组：羊、牛。

在本发明中，牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列具有本领域的常规的含义。此外，牛乳球蛋白的5′侧翼序列和牛乳球蛋白3′侧翼序列宜至少含150bp，较佳地至少200bp。

在本发明的一个实施例中，这些序列的具体核苷酸序列如SEQ ID NO:1、3、4所示。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 HLF乳腺表达载体的构建

该实施例的基因构建过程如图2所示，该基因构建物即为BLG-HLF融合基因，其中调控序列来源于牛BLG，编码序列来源于HLF。

pSP72-BLG-HLF的制备

1．各部分元件的来源

1)牛BLG5′侧翼序列和外显子1非编码序列部分

用常规方法构建牛基因组文库(lambda EMBL3 vector)，以牛BLG启动子区的DNA(PCR扩增产物)为探针筛选。挑选出含BLG启动子区域的阳性克隆。设计并合成如下引物：

5′-CACAGGAAAGGGAGGTCTG-3′和

5′-CCGCTCGAGGCTGCAGCTGGGGTCAC-3′，

用PCR法(94℃,5min；94℃,1min；60℃45s；72℃90s,30个循环)扩增BLG5′侧翼序列及外显子1非编码部分序列(SEQ ID NO:1，图4)。PCR产物以XhoⅠ和EagⅠ酶切并克隆于pBluescript-SK载体的相应位点，得质粒pBSK-BLG5′。

2)牛BLG外显子1-3及外显子6-7和3′侧翼序列

PCR扩增外显子1及其邻近序列，以PCR产物为探针进行文库筛选。挑选出阳性克隆，以阳性克隆噬菌体DNA为模板，用如下引物：

5′-CCGCTCGAGAAGTGCCTCCTGCTTGCC-3′；和

5′-AGCACTCACCATCGATCTTG-3′

通过PCR(94℃,5min；94℃,1min；58℃45s；72℃90s,30个循环)扩增出外显子1-3序列(SEQ ID NO:3，图6)并将PCR扩增产物以XhoⅠ和ClaⅠ酶切并克隆于pBluescript-SK载体的相应位点得质粒pBSK 1-3。

以阳性克隆噬菌体DNA为模板，设计并合成如下引物：

5′-CCATCGATGAGCAGTG CCACATCTAGG-3′和

5′-ATAAGAATGCGGCCGC GCATGCCAGGCCTT TCTG-3′

通过PCR(94℃,5min；94℃,60s；56℃60s；72℃90s,35个循环)扩增出BLG外显子6～7及3′侧翼序列(SEQ ID NO:4，图7)，并将PCR扩增产物以NotⅠ和ClaⅠ酶切并克隆于pBluescript-SK载体的相应位点得质粒pBSK 6-3′。

3)以人中性粒细胞总RNA为模板，采用如下引物：

5′-CGGGATCCAATGAAACTTGTCTTCCTGCTG-3′和

5′-CCATCGATTTACTTCCTGAGGAATTCACAG-3′

通过RT-PCR法获得HLF编码序列全长cDNA序列(SEQ ID NO:2，图5)，并将其克隆入pSP72载体，得质粒pSP72-HLF。

2．pSP72-BLG-HLF的构建

构建过程详见图2。按图2所述构建得到pSP72-BLG-HLF。

pSP72-BLG-HLF乳腺特异表达融合基因的酶切图谱，参见图3。

在pSP72-BLG-HLF中，HLF与BLG5′接头及其邻近序列如下：

HLF与BLG3′接头及邻近序列如下：

HLF编码序列    终止密码   接头序列   BLG外显子1-3→外显子6-3’侧翼序列

参见图1，在人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pSP72-BLG-HLF或融合基因BLG-HLF中，各元件的功能如下：

阴影框部分为BLG的5’侧翼序列，该部分是BLG启动子，负责驱动外源基因的表达，保证外源基因表达是乳腺特异性的。→表示BLG5’非翻译区(5’-UTR)，5’-UTR与外源基因mRNA的稳定性有关，为外源基因翻译编码形成蛋白提供核糖体结合位点。其详细序列参见附图4和SEQ ID NO:1。

空心框部分为外源基因HLF全长编码序列。包括翻译起始密码及终止密码子。序列详见图5和SEQ ID NO:2。

实心框部分为牛BLG外显子1至外显子3，外显子6～7和3’侧翼序列，其作用是提供转录终止信号及加PolyA信号。外显子部分向外源基因提供3’非翻译区，内含子部分及3’侧翼序列与乳腺特异性高效表达的调控有关，序列详见图6和SEQ ID NO:3，以及图7和SEQ ID NO:4。

实施例2．pSP72-BLG-HLF在奶山羊乳腺组织中的瞬时表达

本实验的检测融合基因pSP72-BLG-HLF在动物乳腺中的表达情况。

1．融合基因pSP72-BLG-HLF在山羊乳腺中的表达

1)奶山羊的人工诱乳：

选取健康成年奶山羊，每天肌肉注射苯甲酸雌二醇及黄体酮二次，每次剂量分别为2mg及20mg，共七天。然后分别于第8,10,12,14天肌肉注射利血平0.5mg。

2)融合基因pSP72-BLG-HLF DNA注射及乳腺组织手术切取：

在人工诱乳的第三天，将乳山羊在无菌条件下手术，分离乳腺动脉后，每侧乳腺经乳动脉注射pSP72-BLG-HLF质粒DNA100μg。人工诱乳第七天及第十四天分别在无菌条件下手术切取约10克乳腺组织，组织立即放入液氮冻存，供外源基因表达检测用。

2．融合基因pSP72-BLG-HLF山羊乳腺瞬时表达检测：

1)人及山羊乳铁蛋白mRNA特异性PCR检测引物

分析乳山羊(Capra hircus)乳铁蛋白基因mRNA及人乳铁蛋白基因(HLF2)mRNA的同源性，分别设计和合成两对引物，使之具有专一性。

人HLF2 mRNA特异性引物为：

引物A:5′-GCGGCTTGAGCGTAAGGCAG-3′

引物B:5′-AGAGTTCCAGGTAAGGCTAGTG-3′

羊mRNA特异性引物为：

引物C:5′-AGAATTCCAAGTGAGCCCCTCA-3′

引物D:5′-GCGAGCAGAGCGGCCAGAA-3′

2)检测方法

样品：未催乳山羊乳腺组织，待测山羊(催乳7天)乳腺组织，待测山羊(催乳14天)乳腺组织。

样品m RNA提取：取1克组织加入1ml TRIZOL Reagent，用匀浆器将组织彻底匀浆，室温静置5分钟，加入200μl氯仿，混匀高速离心(12000g)两分钟。将上层水相转移至离心管，加入500μl异丙醇，振荡混匀，室温放置5分钟。高速离心(12000g)5分钟，小心弃上清，室温静置约15分钟使RNA恰好干燥，加水溶解。

RT-PCR：取5μg样品m RNA加入反转录试剂37℃反应一小时，使mRNA反转录成cDNA,95℃5分钟灭活反转录酶，每次取2μl cDNA样品进行PCR反应。

3)检测结果

(A)先检测各检测反转录产物及反应体系是否良好。参见图8，

泳道(1)以待测样品(催乳7天)cDNA产物为模板进行G3PDH PCR扩增，检测反转录产物及反应体系是否良好。

泳道(2)以待测样品(催乳14天)cDNA产物为模板进行G3PDH PCR扩增，检测反转录产物及反应体系是否良好。

泳道(3)以待测样品(催乳7天)总RNA为模板进行HLF PCR扩增，以检测反应体系和样品mRNA是否污染

泳道(4)以待测样品(催乳14天)总RNA为模板进行HLF PCR扩增，以检测反应体系和样品mRNA是否污染

PCR结果表明：反应体系和样品mRNA(泳道3,4)均无污染(没有HLF扩增)，反转录产物及反应体系良好(泳道1,2)检测结果见附图8。

(B)待测样品PCR检测结果显示：参见图9，未催乳山羊人和羊的LF均无扩增现象(泳道2,5)；待测样品(催乳7天)人和羊的LF均有明显扩增现象(泳道1,4)；待测样品(催乳14天，)羊的LF扩增明显(泳道3)而人的LF扩增较弱(泳道6)。这些结果表明BLG-HLF能在催乳山羊乳腺组织中表达。

实施例3融合基因pSP72-BLG-HLF转基因山羊的制备

1．转基因用质粒DNA的制备

1)质粒pSP72-HLF转化大肠杆菌DH52，液体培养含pSP72-HLF质粒的DH52菌株，培养量根据需要可为100ml-1000ml，然后收集细菌，用快速抽提法或大规模抽提法制备pSP72-HLF(详细操作参考曼尼安蒂斯主编的分子克隆手册)。

提取的pSP72-HLF质粒用ScaⅠ+PvuⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳得到分子量分别为9.0Kb和100bp的两个片段，回收9.0Kb条带用Sephaglass Babndprep(pharmacia biotech)试剂盒纯化备用。

2)用显微注射DNA稀释液将纯化后DNA稀释至2ug/ml，离心(12000rpm,30min)，分装，即可作显微注射用。

2．制备转基因动物

将融合基因BLG-HLF通过显微注射的方法导入到奶山羊受精卵雄原核内，然后再移植到同步发情的受体山羊输卵管内，待其妊娠产仔。

实施例4．融合基因pSP72-BLG-HLF转基因山羊基因组整合的检测

1．样品处理

未转基因山羊(图10，泳道1)和待测转基因山羊(图10，泳道3,4,5,6)，按常规操作取羊耳(长度小于1厘米)，-20℃保存备用。

2．检测方法

1)基因组DNA的快速抽提：将羊耳置于1.5ml离心管中，加0.5ml的LysisBuffer(4M Urea power,10mM EDTA(pH8.0),0.5％Sarkosyl(Sigma L5125),0.1MTris-Cl(pH8.0),0.2M NaCl),50μl的蛋白酶K(10mg/ml)置于55℃的杂交炉中振摇过夜。离心(14000rpm)5min，转移上清至一个干净的离心管中，加入1ml无水乙醇轻轻混合后强烈振摇，用Tip头轻轻挑起絮状DNA沉淀，用250-300μl的0.1×TE或双蒸水重悬DNA，吹打混匀，4℃保存。

2)酶切及电泳：取基因组DNA约10微克采用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅤ在37℃酶切12小时以上。酶切产物以1％琼脂糖凝胶电泳，1-2V/cm电压，电泳12小时以上。

变性及中和：加入变性液(1.5M NaCl 0.5M NaOH)使胶变性45分钟(轻摇)，加入中和液(1.5M NaCl 0.5M Tris-Hcl(PH8.0)轻摇中和45分钟(轻摇)

3)转膜：将尼龙膜均匀铺在胶上，上面铺3MM Waterman吸水纸3张，再铺纸塔(5-10厘米)，压上重物，转膜18小时；用5×SSC冲洗膜以去除膜表面的凝胶碎片；在室温下晾干，80℃固定2小时。

4)探针制备：用SacⅠ酶切质粒pBLG-HLF，回收1773bp条带，产量应在500ng-1000ng间，采用随机引物标记试剂盒标记探针。

5)预杂交及杂交：转印膜在预杂交液(5×SSPE,5×Denhardt′s Solution,0.1％SDS,100μg/ml nonhomologous Salmon sperm blocking DNA,50％Formamide)中42℃预杂交4小时。将探针加入到预杂交液中，42℃杂交16小时。

6)洗膜压片洗片：采用Wash Solution(1×SSC,0.1％SDS)65℃洗涤1小时，重复此步骤，直到本底降到10以下。把洗后的膜用保险膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存两天。暗室中取出X光片，显影5分钟，定影15分钟，检查光片上所显示的结果，

2．检测结果

结果见附图10，泳道1为阳性对照：人乳铁蛋白转基因用DNA；泳道2为阴性对照：未转基因山羊基因组DNA；泳道3,4,5,6,7为待测转基因山羊基因组DNA。结果显示：转基因山羊(泳道3,5,6,7)的基因组DNA中有BLG-HLF的整合。

实施例5．转基因山羊乳汁中人乳铁蛋白的检测

1．样品处理

收集羊奶，脱脂处理(4000rpm,4℃,20min)，加入等体积的TBS缓冲液(0.1mol/L Tris-碱，0.3mol/L NaCl,0.2mol/L EDTA,PH6.5)，过0.22um滤膜除菌，样品中加入1×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃煮沸3分钟，使蛋白变性。

2．检测方法

1)蛋白电泳：经处理样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，积层胶：4％胶浓度，50V；分离胶：7.5％胶浓度，100V。

2)蛋白转印：电泳后在80mA电流下进行蛋白转印2小时，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以丽春红染色检测转印效果。转印膜用Tris-NaCl溶液(0.05mol/LTris-碱，0.15mol/L NaCl,pH7.5)洗去结合在蛋白上的丽春红染料后用于杂交抗体。

3)抗体杂交：将转印膜放入平皿，加入适量封闭液(10％脱脂奶粉)，以1∶3000的浓度加入第一抗体(鼠抗人乳铁蛋白抗体)，于平缓摇动的摇床上室温杂交四小时；杂交结束，用Tris-NaCl溶液漂洗滤膜3次，每次10分钟；以1∶2000的浓度加入酶联二级抗体，室温杂交二小时；杂交结束，用Tris-NaCl溶液漂洗膜3次，每次10分钟，然后进行显色反应。

4)显色：在膜上加入适量底物(碱性磷酸酶用BCIP/NBT)，暗反应约20分钟，就能看到蛋白条带。

3．检测结果

结果见附图11，图中泳道N为阴性对照：未转基因山羊乳蛋白；泳道P为阳性对照：人乳蛋白；泳道3,5,6,7为待测转基因山羊乳蛋白。

结果显示：转基因山羊(泳道3,7)的乳汁中有人乳铁蛋白的特异性条带显示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1．一种乳腺特异性表达融合基因，其特征在于，该融合基因从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、人乳铁蛋白cDNA序列、牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列。

2、如权利要求1所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′侧翼序列和人乳铁蛋白cDNA序列之间还有一接头序列；和/或在人乳铁蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外显子1之间还有一接头序列。

3、如权利要求1所述的融合基因，其特征在于，牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

人乳铁蛋白cDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

牛乳球蛋白外显子1、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

4、如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′侧翼序列和人乳铁蛋白cDNA序列之间的接头序列是CTCGACGACTCTAGAGGATCCA；

在人乳铁蛋白cDNA序列和牛乳球蛋白外显子1之间的接头序列是ATCGTCGAGCTG。

5、一种生产人乳铁蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：

将权利要求1所述的乳腺特异性表达融合基因，用原位注射入动物乳腺，从而在动物乳腺中的瞬时表达；

获得混合物形式的人乳铁蛋白或分离出表达的人乳铁蛋白。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤：

用一对从mRNA水平检测人乳铁蛋白在山羊乳腺中表达的引物和一对从mRNA水平检测山羊乳腺内源性乳铁蛋白表达的引物，通过RT-PCR法检测乳铁蛋白在乳腺中的瞬时表达，

其中，人乳铁蛋白的特异性引物为：

引物A:5′-5GCGGCTTGAGCGTAAGGCAG-3＇和

引物B:5′-AGAGTTCCAGGTAAGGCTA GTG-3′；

羊乳铁蛋白特异性引物为：

引物C:5′-AGAATTCCAAGTGAGCCCCTCA-3′和

引物D:5′-GCGAGCAGAGCGGCCAGAA-3′；

将经瞬时表达检验的融合基因BLG-HLF显微注射动物受精卵原核制备转基因动物。

7、一种生产人乳铁蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)将权利要求1所述的乳腺特异性表达融合基因BLG-HLF，显微注射动物受精卵原核，制得基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；

(2)将步骤(1)中的基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵发育成转基因动物；

(3)从动物乳腺分泌的乳汁中获得混合物形式的人乳铁蛋白或分离纯化出表达的人乳铁蛋白。

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，该动物选自下组：羊、牛。

9、一种产生转基因动物的方法，该动物的基因组整合了所述的融合基因BLG-HLF并且在其乳腺中有人乳铁蛋白的特异表达，其特征在于，它包括步骤：

(1)将权利要求1所述的乳腺特异性表达融合基因BLG-HLF，显微注射动物受精卵原核，制得基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵；

(2)将步骤(1)中的基因组中整合有融合基因BLG-HLF的受精卵发育成转基因动物；

10、一种调控外源基因在动物乳腺中特异性表达的载体，其特征在于，该载体从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、牛乳球蛋白外显子1、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列，

且在牛乳球蛋白的5′侧翼序列和牛乳球蛋白外显子1之间有多克隆位点，以便引入待表达的外源基因；

用于在细菌中复制的自我复制序列。

Images