具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法,所用试剂均可从商业途径获得。
以下实施例所使用的载体、菌种、试剂及其来源:
pBC1载体(Invitrogen),pCI-neo载体(Promega);
引物合成及序列测定由上海生工完成;
实验动物用昆明小白鼠,自北京实验动物中心;
Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均为Biolabs公司产品;
Northern杂交膜均购自于美国Amersham biosciences公司;
HRP标记的抗人Fab IgG二抗购自sigma公司;
酶切、连接、回收、转化、PCR扩增、细胞培养、细胞转染等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》;
甲肝病毒毒株及罗猴肾细胞系由中国疾病预防控制中心提供。
实施例1、表达人源单克隆抗体的转基因细胞
1)人源抗体乳腺表达载体构建
根据GenBank上的人免疫球蛋白G1轻链恒定区序列(GenBank号:AH002839S3),设计引物并分别在上游引物引入BglII位点,下游引物引入SalI位点(上游引物LCF:5’-CAGATCTAACTTAATTAAGGAATAGG-3’,下游引物LCR:5’-TGTCGACCTCTAACACTCTCCCCTGTT-3’),以人基因组为模板进行PCR扩增,对扩增产物测序验证正确后,用BglII和SalI酶切,回收酶切产物并连接到同样用BglII和SalI酶切的经改造的pGEM-5Zf载体(pGEM-5Zf载体的NdeI位点引入含BglII位点的接头,接头序列GTCATATGTTCCAGATCTCAGACATATGGT)上,构建成pGEM-LC载体。
根据GenBank上的人免疫球蛋白G1重链恒定区序列(GenBank号:HUMIGCC4)(这个序列是带有内含子的),设计引物并分别在上游引物引入SalI位点,下游引物引入XhoI(上游引物HCF:5’-CAGATCTAACTTAATTAAGGAATAGG-3’,下游引物HCR:5’-TGTCGACCTCTAACACTCTCCCCTGTT-3’),以人基因组为模板进行PCR扩增,对扩增产物测序验证正确后,用XhoI和SalI酶切,回收酶切产物并连接到同样用XhoI和SalI酶切的经改造的pGEM-7Zf载体(pGEM-7Zf载体的EcoRI位点引入含XhoI位点的接头,接头序列TGAATTCCTGTCTCGAGCCTGGAATTCT)上,构建成pGEM-HC载体。
按曹经瑗等(从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体,中华实验和临床病毒学杂志,2000,14(4):313-316)等文献的方法克隆出抗甲肝抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。为了提高重组单克隆抗体在动物乳腺中表达水平,在单克隆抗体可变区序列前引入引导肽序列(5’-ATG GGT GAC AAT GACATC CAC TTT GCC TTT CTC TCC ACA GGC GCG CAC TCC-3’),人工合成带引导肽序列的抗体可变区序列。将上述人工合成的序列连入pGEM-LC和pGEM-HC载体构建成重组载体pGEM-HAVG(L)、pGEM-HAVL(L)、pGEM-HAVG和pGEM-HAVL。
将上述载体用SalI或XhoI酶切后连入XhoI酶切处理的商业化乳腺表达骨架载体pBC1中,构建成pBC-HAVG(L)(抗人甲肝病毒抗体重链基因,含引导肽),pBC-HAVL(L)(抗人甲肝病毒抗体轻链基因,含引导肽),pBC-HAVG(抗人甲肝病毒抗体重链基因,不含引导肽),pBC-HAVL(抗人甲肝病毒抗体轻链基因,不含引导肽)等载体,结构如图1,pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)载体中的HAV可变区序列与恒定区序列之间,重链恒定区CH1、CH2和CH3之间均有内含子序列。
2)转基因小鼠模型制备
转基因小鼠制备过程参见《小鼠胚胎操作实验指南》(A.纳吉等著,2004,科学出版社)。将上述构建的四种表达载体经酶切回收,将pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L),或pBC-HAVG和pBC-HAVL等比例混合后,稀释至终浓度2.5ug/ml(即两种载体各1.25ug/ml),共注射到小鼠受精卵的雄原核,然后移植到同期发情的假孕母鼠输卵管中妊娠。小鼠出生2-3周剪取尾巴组织样,提取基因组DNA,以该基因组DNA为模板,利用pBC1上位于XhoI位点两侧的引物(pBC1-F:5’-GATTGACAAGTAATA CGCTGTTTCCTC-3’,pBC1-R:5’-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3’)在双链整合的阳性小鼠中可以同时扩增出含有重链基因片段和轻链基因片段;选择双链共整合的转基因小鼠进行繁殖配种,并留取转基因母鼠乳样,以用于重组抗体表达情况检测。
3)内含子对于重组抗体表达情况的影响分析
采集共整合pBC1-HuG1F(制备方法参考中国专利申请200610172293.7)和pBC1-HuK1F(制备方法参考中国专利申请200610172293.7),以及共整合pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)的转基因小鼠常乳,普通小鼠乳汁作为阴性对照。人的IgG纯品为阳性对照。将离心后去除乳脂和酪蛋白的乳清在10%的SDS-PAGE上进行还原和非还原电泳。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人Fab IgG进行Western Blot分析,检测重组人源抗体在转基因小鼠乳汁中的表达。
在还原条件下,IgG经变性电泳后解链为的50kDa的重链分子和25kDa的轻链分子。在非还原条件下,完整的IgG分子量为150kDa(图2),表明这些转基因小鼠乳腺中均表达有重组人源抗体。图2中“HC”代表甲肝抗体重链分子,“LC”代表甲肝抗体轻链分子。
用ELISA对重组人源抗体在转基因小鼠乳汁中的表达量进行分析。用抗人IgGFab抗体包被ELISA板,HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体进行检测。人的IgG纯品作为定量的标准。
ELISA结果见表1,表明共整合pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)基因的转基因小鼠重组抗体表达水平显著高于共整合pBC1-HuG1F和pBC1-HuK1F的阳性小鼠。由于pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)载体中的HAV可变区序列与恒定区序列之间,重链恒定区CH1、CH2和CH3之间均有内含子序列,而pBC1-HuG1F和pBC1-HuK1F载体中的HAV可变区序列与恒定区序列之间,重链恒定区CH1、CH2和CH3之间均不含内含子序列,重组抗体表达结果表明含有内含子序列的表达结构显著优于无内含子序列的表达结构。
表1.转基因小鼠重组抗体表达量统计表
4)引导肽对于重组抗体表达情况的影响分析
采集共整合pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)的转基因小鼠,以及共整合pBC-HAVG和pBC-HAVL的转基因小鼠常乳,普通小鼠乳汁作为阴性对照。用ELISA对重组抗体在转基因小鼠乳汁中的表达量进行分析。用抗人IgG Fab抗体包被ELISA板,HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体进行检测。人的IgG纯品作为定量的标准。
ELISA结果见表2,共整合pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)基因的转基因小鼠重组抗体表达水平显著高于共整合pBC-HAVG和pBC-HAVL的阳性小鼠。由于pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)与pBC-HAVG和pBC-HAVL的区别仅在于前者带有引导肽序列,重组抗体表达结果表明含有引导肽序列的表达结构显著优于无引导肽序列的表达结构。
表2.转基因小鼠重组抗体表达量统计表
实施例2、制备表达人源单克隆抗体的转基因家畜
1)制备表达人源单克隆抗体的转基因牛
转基因牛或羊制备方法可以采用显微注射法、体细胞克隆法、精子载体法等方法,本发明优选体细胞克隆法制备转基因牛,但不限于体细胞克隆法。
取牛耳组织接种培养出成纤维细胞(参见《细胞试验指南》),用SalI和NotI双酶切抗人甲肝病毒轻链乳腺表达载体pBC-HAVG(L)和抗人甲肝病毒轻链乳腺表达载体pBC-HAVL(L),去除约6kb的pBC1骨架载体上的原核表达部分,回收剩余表达框架(图1)。将上述回收片段与线性化的pCI-neo混合于TE溶液,将混合溶液用电穿孔转染法转入到牛的胎儿成纤维细胞中,经G418筛选及PCR鉴定,确定为转基因阳性细胞。
从屠宰厂收集成年牛的卵巢,取直径2-8毫米的卵泡,回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体,将卵丘-卵母细胞-复合体以50枚/孔放入含成熟液(含有10%(质量百分含量)FBS、0.01U/ml猪促卵泡激素+0.01U/ml猪生长激素+1μg/ml雌二醇的M199培养基)的四孔板,在38.5℃、5%CO2培养箱中成熟培养18-20h后,将成熟的卵母细胞放入0.1%透明质酸酶的管内振荡2-3min后,再用玻璃管轻轻吹打,使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离,选择形态完整,细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体。
将带有第一极体的卵母细胞移入含7.5μg/ml细胞松驰素B、10%(质量百分含量)FBS的M199培养基中,在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口,再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除,再放入含(质量百分含量)20%FBS的M199培养基中洗三遍后,置于培养箱中备用,获得转有抗体双链基因及标记载体的转基因细胞。
将血清饥饿2-4d的转有抗体双链基因及标记载体的转基因细胞用0.25%trypsin消化2-4min,选择直径为10-12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内,然后将其放入Zimmerman液中平衡3-5min后放入融合槽内,转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直,同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后,迅速将重构胚移入含20%(质量百分含量)FBS的M199培养液中。再将重构胚放入5μmol/L Ionomycin液中,4min后换到1.9mmol/L 6-DMAP液中,4h后再移入含5%(质量百分含量)FBS CR1aa液中,在38.5℃、5%CO2培养箱中培养2天。
将形态优良的第7d的克隆囊胚用非手术法移入已同期发情的受体母牛的子宫内,具体做法参考郭志勤等编著的《家畜胚胎工程》第89页。受体母牛选择的都是经产母牛,在移植后的第60d进行直肠检测,以确定妊娠。妊娠期满后对出生的克隆牛进行PCR检测,检测方法同实施例1的方法,获得共整合pBC-HAVG(L)和pBC-HAVL(L)的转基因奶牛,检测结果见图3。图3中,“M”代表1kb梯度DNA分子量标准,“N1”代表转基因奶牛,“N2”代表转基因奶牛,“NC”代表阴性对照,“PL”代表,抗体轻链扩增片段“PH”代表抗体重链扩增片段。
对转基因牛进行配种,产奶后收集乳样,采用Western blotting和ELISA法对重组抗体在转基因牛乳腺中的表达情况进行分析。方法同实施例1。重组抗体在转基因牛乳腺表达检测结果见表3。表明含有引导肽、内含子的抗人甲肝病毒抗体基因能在转基因奶牛乳腺中高效表达重组抗人甲肝病毒抗体基因。
表3.转基因奶牛重组抗体表达量统计表
用ELISA对转基因乳汁中的重组抗体进行抗体活性分析。用纯化的甲肝抗原包被ELISA板,用HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体进行特异性检测。将CHO细胞表达的可以识别甲肝病毒的HAIgG78抗体作为阳性对照。
ELISA结果见图4,转基因乳样具有结合HAV抗原的能力,并且结合能力与阳性对照相近。
2)重组抗体的体外中和试验
用100TCID50的HAV病毒量检测转基因奶样中的抗体阻止FRhk4细胞感染HAV的能力(即滴定使病毒感染力减少至50%时抗体的中和效价)。
将FRhk4细胞在小试管中培养成单层,奶样进行倍比稀释(1/20-1/640),然后与0.1ml的病毒混合,37℃孵育2小时,每个稀释度做4管,每管接种混合物0.2ml,33℃吸附1.5小时,然后每管加入1.0ml培养液。培养21天后收获细胞,每管加入0.2ml含0.05%Tween20的PBS,冻化3次后,ELISA检测HAV抗原。普通奶样作为阴性对照,CHO细胞表达的HAIgG78抗体作为阳性对照,同时设病毒滴度及细胞对照。计算半数致死量检测抗体对病毒的中和效价。
结果见图5表明检测的奶样都具有中和HAV病毒感染的能力,并且活性很高,达到50%中和效率的抗体最低浓度仅为0.3μg/ml。
序列表
<110>北京济普霖生物技术有限公司
<120>利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法
<160>1
<210>1
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>1
atgggtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gcgcgcactc c 51