CN1323347A

CN1323347A - 调节植物气孔特性的工具和方法

Info

Publication number: CN1323347A
Application number: CN99812013A
Authority: CN
Inventors: D·伯格; T·奥尔特曼
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Planttec Biotechnologie GmbH Forschung and Entwicklung
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1998-10-12
Filing date: 1999-10-12
Publication date: 2001-11-21
Also published as: JP2002527070A; AU1035000A; WO2000022144A3; BR9914424A; WO2000022144A2; AR020775A1; CA2346259A1; EP1121447A2

Abstract

本发明描述了编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸分子的用途和调节相应基因以生产具有改变的气孔特性的转基因植物。本发明提供了含有这些核酸分子及其互补物的重组DNA分子;其中所述核酸分子可操作地连接到允许所述核酸分子在植物中表达的调节元件上。本发明还提供了含有所述重组DNA分子的载体以及由此转化的植物细胞、植物组织和植物。此外,本发明描述了前述核酸分子、重组DNA分子和载体在植物细胞和组织培养、植物育种和/或农业,特别是在生产具有改善的表型的植物中的用途。

Description

调节植物气孔特性的工具和方法

本发明涉及重组DNA分子，它含有编码调节植物气孔密度中所涉及的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸分子；其中所述核酸分子能够可操作地连接到调节元件上，从而在植物中表达所述核酸分子。本发明还提供了含有所述重组DNA分子的载体以及由其转化的植物细胞、植物组织和植物。本发明还涉及前述重组DNA分子和载体在植物细胞和组织培养、植物育种和/或农业中，特别是生产具有改善的性状的植物中的用途。

在本说明书正文中引证了几篇文献。因此将本文中所引证的每篇文献(包括任何厂商的说明书、规程等)并入本文作为参考；但是，不应认为所引证的任何文献都是本发明的现有技术。

在所有高级陆生植物的表皮中，气孔复体(气孔)是特化的结构，它们介导和控制植物内部组织和大气之间的气体交换。它们由两个侧翼于中心孔的保卫细胞组成。在许多植物种中，这些中心保卫细胞被形态不同的表皮细胞(副卫细胞)所围绕。通常，叶和大气之间90％以上的气体交换(叶吸入二氧化碳并释放水蒸汽)都是通过气孔进行的。气孔的主要功能是在足够二氧化碳吸入和有限水分损失之间建立一最佳平衡。为了实现这一点，通过保卫细胞的膨胀驱动的运动打开和关闭气孔来对气孔导度施加短期控制(几分钟至几小时)(参见Zeiger、Farquhar和Cowan(编辑)，“气孔功能”，斯坦福大学出版社，斯坦福1987；Willmer和Fricker(编辑)，“功能生物学总论”2，气孔，第二版，Chapman and HallLtd.,London,New York,1996)。除了这些快速且短暂的变化之外，进行气孔特性的长期调节主要包括形态方面如在叶上表皮和/或下表皮中存在或者不存在气孔、在叶表皮中的气孔密度或者气孔的大小。这些特征是由内因(遗传)和外因(环境)一起决定的。通过观察相同属的不同种之间、相同种的变种或品种之间或者F1杂种中气孔密度的各种变化，获得对遗传控制的暗示。遗传分析证实了多基因、寡基因或单基因控制以及例如气孔密度或大小特征的高度遗传性(参见Jones的″气孔功能″，E.Zeiger,G.D.Farquhar和I.R.Cowan编辑，第431-443页，斯坦福大学出版社，斯坦福1987)。除了该内源控制之外，还通过环境影响调节气孔特性。因此，发现空气湿度(例如，Schurmann,1959，“植物志”147,417-520)、光强度(例如Gay和Hurd,1975，“新植物学”75,37-46；Schoch等人，1980,J.Exp.Bot.31,1211-1216；Rahim和Fordham,1991,Ann.Bot.67,167-171)和CO₂浓度(例如Woodward,1987，″自然″327,617-618；Woodward和Bazzaz,1988,J.Exp.Bot.39,1771-1781；Goodfellow等人，1997，″树生理学″17,291-299)影响气孔密度。在几项研究中，发现气孔密度与植物产量有关(例如，Walton,1974,Can J.Plant Sci.54,749-754)。通过在高辐照度和人工灌溉条件下生长选择的高产量皮马棉变种显示出气孔密度的增加与气孔导度的增加和叶温降低有关(Cornish等人，1991，″植物生理学″，97,484-489；Lu和Zeiger,1994，“生理植物”92,273-278；Lu等人，1994，“生理植物”92,266-272；Srivastava等人，1995，“植物科学”19,125-131)。对一系列面包小麦变种的观察发现气孔导度与产量之间存在相似的关系(Lu等人，1998,J.Exp.Bot.49,453-460)。根据这些数据，调节气孔特性对农作物优良品种的改良是很重要的。在农业和林业领域，主要目的是连续提高农作物的高产量，从而向日益增长的地球人口提供足够的食物并确保可再生资源的供应。传统上，试图通过育种获得较高产量的变种，对每个相关植物种分别进行加工花费大量人力和时间。通过对植物实施遗传工程已经获得一些进展，即，在植物中引入并表达重组核酸分子。由于通常可以将这些方法应用到许多不同植物种中，因此它们是有利的。例如，在EP-A-0511979中，描述了原核生物天冬酰胺合成酶用于在植物细胞中表达的用途，在其它变化中，使得生物量产量增加。WO 96/21737描述了通过提高光合速率表达去调节或非调节的果糖-1,6-二磷酸酶来使植物的产量增加。在WO 96/17069中，描述了通过表达来自大肠杆菌的多磷酸激酶来提高转基因植物中的生物量产量。然而，与这些情况相反，由于完全缺乏有关控制这些气孔特性中所涉及的基因的知识，因此至今还不能获得通过遗传工程直接操纵植物中气孔密度或分布的工具。最近，已在化学诱变之后分离出拟南芥突变体R-858，它显示了所有气生植物器官，特别是叶中的气孔密度增加2-4倍，并且出现约10％的群集气孔，即直接与至少一个其它气孔接触的气孔(D.Berger,1997,PhDThesis Freie Universitat Berlin)。除了蒂长的较小变化之外，在突变植物中看不到其它形态变化。叶的形状和大小以及叶肉结构(在栅状和海绵状薄壁组织中的细胞层数量、叶肉细胞的形状和大小)和细胞间体系(包括气孔下腔)没有改变。气孔密度增加导致蒸腾提高(失水)并伴随叶中干物质含量增加，野生型中为约3％，突变体中为约7％。与野生型比较，还显示出，在R-558突变体中气孔密度增加伴随叶鲜重(+15％)和干重(+30％)增加，叶中葡萄糖(+70％)、果糖(+65％)和蛋白质(+50％)含量增加，以及蒸腾提高和二氧化碳同化作用提高(D.Berger,1997,PhD Thesis,FreieUniversitat Berlin)。已相对一组以约0.59cM间隔位于拟南芥染色体1上臂的(分子)遗传标记将引起气孔密度增加的突变作图(D.Berger,1997,PhD Thesis,Freie Universitat Berlin)。但是，仍然未完全弄清楚植物中气孔密度和分布的调节，并且至今还不能获得可用于操纵气孔特性如可应用于农业几个方面的密度和分布的工具。

因此，本发明的技术问题基础在于满足调节植物中气孔密度的工具和方法的需要。通过提供具有权利要求书中特征的实施方案来解决该技术问题。

因此，本发明涉及一种重组DNA分子，含有：

(ⅰ)编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶或编码这种蛋白质的生物活性片段的核酸分子，选自：

(a)含有编码含SEQ ID NO:2、8、10或12所给出的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的核酸分子；

(b)含有SEQ ID NO:1、7、9或11所给出的核苷酸序列的核酸分子；

(c)编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质含有通过(a)或(b)的核酸分子编码的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的至少D区、H区、底物结合部位和/或S区；或

(d)与(a)-(c)任一定义的核酸分子的互补链杂交的核酸分子；

(e)编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质中的氨基酸序列与(a)-(c)任一核酸分子编码的氨基酸序列有至少65％的相同性；

(f)核酸分子，其中的核苷酸序列是所述遗传密码与(a)-(e)任一定义的核酸分子的核苷酸序列简并的结果；或者

(ⅱ)核酸分子，其编码(ⅰ)的核酸分子所编码的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的突变非活性或超活性形式或者抗该蛋白酶的抗体；或者

(ⅲ)核酸分子，其特异地与(ⅰ)的核酸分子或其互补链杂交。

本发明基于对一类新型基因的鉴定，所述基因由来自具有共同结构基元的拟南芥的SDD1所示，参见下文。一方面，这些基因优选参与对气孔密度和/或分布的控制。所述SDD1基因在拟南芥突变体R-558中发生突变，参见实施例1-3。通过该基因编码的蛋白质的氨基酸序列的计算机辅助分析证实了，它属于枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶家族；参见实施例4。而且这类新型基因的代表已由马铃薯克隆；参见实施例6。

术语“枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶”和“枯草杆菌蛋白酶”在本文中可互换使用，并且意思是一特定类的丝氨酸蛋白酶，称为枯草杆菌蛋白酶或二元加工内切蛋白酶。在枯草杆菌蛋白酶中，四个区域形成催化三联体和底物结合部位，并且在枯草杆菌蛋白酶中为最高度保守的；还参见实施例4和图7。在本发明的上下文中，枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶还意味着这些蛋白质与SEQ ID NO:2、8、10或12所示序列显示出至少65％的同源性。在本发明的上下文中，术语“枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶”优选应理解为意思是含有一个或几个SEQ ID NOS:13-37中所示特征基元的蛋白质；参见下文。所述底物结合部位优选含有基元VICAA(SEQ ID NO:38)，更优选含有基元CAAGN(SEQ ID NO:39)，特别是基元AAGNN(SEQ ID NO:40)，最优选氨基酸基元VICAAGNNG(SEQ IDNO:41)。

在另一优选实施方案中，本发明的核酸分子编码具有一个或多个以下氨基酸序列基元的上述蛋白质：SYHSA(SEQ ID NO:49)、GLSPT(SEQ IDNO:50)、WLKSG(SEQ ID NO:51)、FNSSS(SEQ ID NO:52)、ASTAG(SEQ IDNO:53)、AAMDV(SEQ ID NO:54)、WIATI(SEQ ID NO:55)、GPSGL(SEQ IDNO:56)、IAALLH(SEQ ID NO:57)、KPIMD(SEQ ID NO:58)、VSCHD(SEQ IDNO:59)、YPSIS(SEQ ID NO:60)、SLSYR(SEQ ID NO:61)。

在另一优选实施方案中，本发明枯草杆菌蛋白酶的D、H和/或S区含有一个或几个以下特征基元：

D区：

IIGVL(SEQ ID NO:42)或GYLDT(SEQ ID NO:43)

H区：

THTAST(SEQ ID NO:44)或S-RDS(SEQ ID NO:45)或RDS-G(SEQ ID NO:46)

S区：

HVSGI(SEQ ID NO:47)或FTV-SGT(SEQ ID NO:48)

尽管这些蛋白质在调节植物中气孔密度的功能至今未知，但是本发明第一次提供了所述核酸分子编码控制植物中气孔密度和分布中所涉及的蛋白质的证据；参见实施例3和7。而且，表明缺少或超量表达这些蛋白质的植物显示出农艺学非常重要的形态和生理特征的改变。

因此，本发明第一次清楚地确立了可以通过应用遗传工程技术特异地调节例如密度和分布的气孔特性并提供极有用的工具，例如以便：

(ⅰ)产生气孔密度增加的植物，并因此提高二氧化碳同化、降低叶温、提高如叶的器官鲜重和干重、以及提高如叶的器官中糖和蛋白质的含量；

(ⅱ)产生气孔密度增加的植物，并因此减少水分损失由此降低水分消耗；

(ⅲ)抵抗环境的变化，例如引起气孔密度向最佳水平之下或之上变化的大气二氧化碳水平、温度和辐照度的升高；

通常，编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸分子可以得自任何物源，例如得自任何生物体，优选拥有这些分子的植物，优选得自单子叶植物或双子叶植物，特别是得自农业、园艺或树木栽培上感兴趣的任何植物，如农作物，即早熟禾科的那些，任何产淀粉植物如马铃薯、木薯、水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦，豆科植物，产油植物如油籽油菜、大豆、向日葵、亚麻籽等，使用多肽作为贮藏物的植物如大豆，使用蔗糖作贮藏物的植物如甜菜或甘蔗，树，观赏植物等，或者属于禾本科的植物。

而且，根据本发明，可以使用核酸分子杂交到上述核酸分子中并编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶。这些核酸分子可以从例如cDNA或基因组库的文库中通过本领域中众所周知的技术分离。例如，可以使用上述核酸分子或其片段或其互补物作为探针，按照标准技术通过与所述分子杂交筛选文库，从而鉴定和分离杂交核酸分子。还可以使用得自上述核酸分子的低聚核苷酸作为引物，通过聚合酶链反应(PCR)将这些核酸分子分离。与任何前述核酸分子杂交的核酸分子还包括编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶或其生物活性片段的上述核酸分子的片段、衍生物和等位变体。片段应理解为长度足够编码所述蛋白质或其具有如上所述定义的生物活性的片段的部分核酸分子。优选地，所述片段包括如上面(ⅰ)(c)部分中所定义的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的至少一个区域。

术语“衍生物”在本文中意思是这些核酸分子的核苷酸序列在一个或多个核苷酸位置上与上述核酸分子的序列不同并与所述核酸分子高度同源。同源性应理解为序列至少50％相同，优选65％相同，特别是至少70％或75％相同，优选80％以上并且更优选90％以上或95％相同。由上述核酸分子的序列衍生例如可以是核苷酸单独或组合取代、缺失、添加、插入和/或重组的结果，它们可以天然存在或者经过本领域中众所周知的重组DNA技术产生；参见例如Sambrook的“分子克隆实验室手册”，纽约冷泉港实验室(1989)和Ausubel的“分子生物学当前方案”Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中所述的技术。同源性还意味着核酸分子或编码蛋白质各自在功能和/或结构上等价。与上述核酸分子同源并为所述核酸分子的衍生物的核酸分子例如为所述核酸分子的变异，呈现出具有相同生物功能的修饰，特别是编码具有本文中定义的相同或基本上相同生物活性的蛋白质。它们可以为天然存在的变异，例如分别来自其它原核生物和真核生物的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶编码序列，或突变。这些突变可以天然存在或者可以通过诱变技术获得；参见上文。所述等位变异可以为天然存在的等位变体以及合成产生或遗传工程的变体。参见上文。例如，植物枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列与细菌、酵母和哺乳动物的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶具有显著相似性；参见实施例4。此外，根据本发明，可以使用编码上述枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的同源物或类似物，但是在其它方面与那些蛋白质不相关的核酸分子。与普通枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶不呈现显著同源性的这些蛋白质可以由本领域技术人员使用本领域众所周知的技术鉴定出，例如，在例如相应突变植物中通过突变基因的互补；参见实施例3。

在另一实施方案中，术语衍生物包括编码得自SEQ ID NOS.2、8、10或12任一的蛋白质的核苷酸序列，它具有同源度，即与SEQ ID NOS.2、8、10或12所示的蛋白质至少60％相同，特别至少70％同源，优选80％以上并且更优选90％和特别优选95％以上同源，并且具有至少一个、更优选至少3个，甚至更优选至少5个，特别优选至少10和特别优选至少20个肽基元选自以下：

a)QTYIV,(SEQ ID NO:13),

b)IVQLH,(SEQ ID NO:14),

c)SSRLL,(SEQ ID NO:15),

d)QTTYS,(SEQ ID NO:16),

e)SSSGN,(SEQ ID NO:17),

f)VLGNG,(SEQ ID NO:18),

g)GAHIA,(SEQ ID NO:19),

h)FRAME,(SEQ ID NO:20),

i)VICAA,(SEQ ID NO:21),

j)AAGNN,(SEQ ID NO:22),

k)SSVAN,(SEQ ID NO:23),

l)YGESL,(SEQ ID NO:24),

m)GSEFC,(SEQ ID NO:25),

n)CLRGS,(SEQ ID NO:26),

o)RGVNG,(SEQ ID NO:27),

p)PATLIG,(SEQ ID NO:28),

q)IFGGT,(SEQ ID NO:29),

r)PQNLG,(SEQ ID NO:30),

s)VNFTV,(SEQ ID NO:31),

t)HVSGI,(SEQ ID NO:32),

u)GFSLN,(SEQ ID NO:33),

v)RRYTN,(SEQ ID NO:34),

w)PNSIY,(SEQ ID NO:35),

x)LSYRV,(SEQ ID NO:36)，和

y)SPISV.(SEQ ID NO:37)

由上述核酸分子的不同衍生物、变体、同源物或类似物编码的蛋白质可以具有特定的共同特性，如分子量、免疫反应性、构象等，以及物理性能，如电泳迁移率、色谱性能、沉降系数、pH最佳值、温度最佳值、稳定性、溶解性、光谱性能等。根据本发明，所有这些核酸分子和衍生物都能使用，只要编码蛋白质的生物活性保持在种类上基本不受影响，即所述蛋白质能调节植物中的气孔密度。任一上述核酸分子，特别是代表枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的超活性突变体形式的那些特别适宜在转基因植物中超量表达。例如因突变，这些转基因植物或者可以具有内源功能性枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶或者它们可以缺少相应的基因。

在(ⅱ)和(ⅲ)部分中所述的核酸分子特别适宜用于抑制在植物中的编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的基因。因此，在一个实施方案中，所述核酸分子优选有至少50个核苷酸长与上述核酸分子或其互补链特异地杂交。特异杂交优选在严格条件下发生，并且暗示不或者几乎不与编码并非不同或基本上不同的蛋白质的核苷酸序列交叉杂交。特别是严格条件意思是例如使用1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄ pH7.2、7％SDS的水溶液并在65℃下温育。优选地，严格杂交是在以下条件下获得的：

杂交缓冲液：

2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；250μg/ml鲱鱼精子DNA；50μg/ml tRNA；或者

0.25M磷酸钠缓冲液pH7.2；1mM EDTA；7％SDS

杂交温度：T=65-68℃

洗涤缓冲液：0.2×SSC；0.1％SDS

洗涤温度：T=68℃

这些核酸分子可以用作探针和/或用于控制基因表达。核酸探针技术对本领域技术人员来说是众所周知的，他们会容易地认识到这些探针在长度上可以有所变化。优选长度为50个核苷酸或更多的核酸探针。当然，也可以适当使用长达100个和更多核苷酸的核酸。本发明的核酸探针对于各种应用都是有用的。一方面，它们可以用作根据本发明用于扩增核酸序列的PCR引物。另一应用是作为杂交探针的用途，用于通过同源性筛选基因组DNA或cDNA文库来鉴定与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。例如由于反义或三联螺旋效应，与上述核酸分子互补的本发明该优选实施方案中的核酸分子可用于抑制枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶编码基因的表达或用于构建适宜核酶(例如参见EP-0291533-A1、Ep-0321201-A1、EP-0360257-A2)，它们特异地切割含有本发明核酸分子或其部分的基因的(前)-RNA。可以选择适宜的靶位点和相应核酶，例如在Steinecke的“核酶，细胞生物学方法50”,Galbraith等人编辑，学术出版公司(1995)，449-460中所述。而且，本领域技术人员熟知还可以用适宜标记物标记这种核酸探针，从而用于特定用途，例如用于检测本发明核酸分子存在于来自生物体，特别是植物的样品中。

上述核酸分子或者可以是DNA或RNA或其杂种。而且，所述核酸分子可以含有例如硫酯键和/或核苷酸类似物，它们通常用于低聚核苷酸反义研究。所述修饰可用于稳定所述核酸分子抗细胞中的内切和/或外切核酸酶。

而且，编码特异地识别枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶或这种蛋白质的部分，即特定片段或表位的抗体的核酸分子可用于抑制植物中这种蛋白质的活性。这些抗体可以为单克隆抗体，多克隆抗体或合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等。可以通过例如最初在Kohler和Milstein的“自然”256(1975),495和Galfre的“酶学方法”73(1981),3中所述的技术制备单克隆抗体，该技术包括将小鼠骨髓瘤细胞融合到来自免疫哺乳动物的脾细胞中。而且，可以使用例如在Harlow和Lane的“抗体，实验室手册”，冷泉港CSH出版社，1988中所述的方法获得前述肽的抗体或其片段。这些抗体可用于例如，如在重组生物体中免疫沉淀和免疫定位本发明蛋白质以及检测这些蛋白质的合成，和鉴定与本发明蛋白质相互作用的化合物。例如，在BIAcore系统中使用的表面胞质基因共振可用于增加噬菌体抗体选择的效率，使结合到本发明蛋白质表位上的单文库噬菌体抗体产生高增量的亲和力(Schier，“人抗体杂交瘤”7(1996),97-105；Malmborg，“免疫方法杂志”183(1995),7-13)。可以通过本领域中熟知的方法实现抗体或抗体样分子的表达，例如，全大小抗体(During，“植物分子生物学”15(1990),281-293；Hiatt，“自然”342(1989),469-470；Voss，“分子育种”1(1995),39-50)、Fab片段(De Neve，“转基因研究”2(1993),227-237)、scFvs(Owen，“生物/技术”10(1992),790-794；Zimmermann，“分子育种”4(1998),369-379；Tavladoraki，“自然”366(1993),469-472)和dAbs(Benvenuto,“植物分子生物学”17(1991),865-874)已成功地在烟草、马铃薯(Schouten,FEBS Lett.415(1997),235-241)或拟南芥属中表达，达到高至总蛋白的6.8％的表达水平(Fiedler，“免疫技术”3(1997),205-216)。

此外，编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶突变体形式的核酸分子可用于干扰野生型蛋白质的活性。这些突变体形式优选已丧失其如上所述的生物活性，并且可以通过在蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加氨基酸由相应枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶得到。如上所述，枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶的突变体形式还包括这些蛋白质的超活性突变体形式，它们呈现出例如增加的底物亲和力和/或更高的底物转换。而且，因在细胞环境中稳定蛋白质的氨基酸的掺入，这些超活性形式在细胞中可以更稳定。这些突变体形式可以天然存在或者为遗传工程的突变体；同样参见上文。

本发明的重组DNA分子优选含有使所述核酸分子在植物中表达的调节序列。优选地，所述调节元件含有在植物细胞中有活性的启动子。表达包括将所述核酸分子优选转录成可翻译的mRNA。确保在植物细胞中表达的调节元件对本领域技术人员来说为众所周知。

这些调节元件可与待表达的核酸分子和/或待转化的植物种同源或优选异源。例如，可以按照本发明使用的优选调节元件为SEQ ID NO:5中所示的SDD1启动子区或其部分。

优选地，使用含有SEQ ID NO:6的SDD1基因的启动子区，它相应于SEQID NO:5在839位开始的核苷酸序列。GUS表达研究显示，拟南芥的SDD1的启动子在具有有丝分裂活性的组织中显示出高活性。例如，在发育的气孔和原基中可以发现非常强的GUS表达，但是在侧根中还可以发现较弱的表达。通过计算机辅助研究，可以鉴定可能与该启动子表达模式有关的不同结构域。一方面，鉴定允许在根中表达的结构域，另一方面鉴定被称之为Dof-基元的几个特征基元(例如参见Yanagisawa和Schmidt的“植物杂志”17(1999),209-214)，并且在这种情况下可能允许在保卫细胞中表达。这些基元例如已描述在德国专利申请DE 19904754.5中。假设，缺失该结构域，可能介导在根中表达并定位于SEQ ID NO:6的开始400bp中，有利地改变该启动子的特异性。为此，本发明的优选实施方案使用在5’-区含有至少400-450bp或450-600bp或最多900bp缺失的启动子片段。

本领域技术人员可以借助本发明的编码和调节序列分离来自其它种如马铃薯、西红柿、大麦、小麦、燕麦、黑麦、水稻、玉米、大豆等的相应基因。这可以通过本领域中已知的常规技术进行，例如通过使用SEQ IDNO:6中所示的调节序列作为杂交探针或者通过设计适宜PCR引物。然后可以通过常规技术分离相应启动子区并测定它的表达模式。为此，例如可以将所述启动子融合到报道基因，如GUS、荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)中，并评价所述报道基因在转基因植物中的表达。

例如来自实施例6中所述马铃薯的两个SDD1同源物的启动子可以通过常规方式分离。可以扩增基因组克隆，例如使用上游定位的SDD1特异性引物和λ左或右壁序列的引物经过长模板PCR的片段(例如使用EXPAND试剂盒，Boehringer Mannheim)。该扩增片段经引物步行测序直到已到达离转录开始点几个kb上游，如果存在于克隆上，那么优选大于3kb。在克隆的基因组序列中，通过本领域技术人员熟知的标准程序如5’-RACE、引物延伸或S1作图确定转录开始位点。为了定义转录开始位点上游的顺式调节元件(即在推定启动子区中)，将各自区域融合到如编码GUS或GFP的基因的标记基因中，并产生这些构建体的5’缺失衍生物。将它们转化到适宜的植物中，并测定根据剩余上游序列(推定启动子)的标记基因的表达。这些技术对本领域技术人员为熟知。

这样鉴定的调节序列可以在一个或多个位置与上述调节序列不同，但仍然具有相同的特异性，即它们含有与上述表达模式有关的相同或相似的序列基元，优选长度为6-10个核苷酸。优选这些调节序列杂交到上述调节序列之一上，更优选在严格条件下。特别优选与上述调节序列之一具有至少85％、更优选90-95％并最优选96-99％的序列相同性并具有相同或基本上相同特异性的调节序列。特别优选含有允许在保卫细胞中表达的上述基元的调节序列。这些调节序列还含有例如通过本领域中已知的核苷酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或任何其它修饰单独或组合改变的那些。在本发明调节序列的核苷酸序列中导入这些修饰的方法对本领域技术人员来说为公知。对本领域技术人员来说还显而易见的是，可以向本发明的调节序列中加入其它调节元件。例如，可以使用转录增强子和/或允许本发明调节序列诱导表达的序列。

存在这种可能性，即通过例如不影响调节序列的整体结构或结合基元的核苷酸替换修饰上述的调节序列或其序列基元，以便其能够赋予如上所述的基因表达模式。尽管其它植物也可以是这些调节序列的适宜源，但是这些调节序列可以得自马铃薯的枯草杆菌蛋白酶基因。而且，可以使用本领域中已知的适宜计算机程序如BLAST(代表基础局部对比检索工具(Altschul,1997；Altschul,J.Mol.Evol.36(1993),290-390；Altschul,J.Mol.Biol.215(1990)；403-410)，比较这些核苷酸序列，从而检索局部序列对比。BLAST可以对比核苷酸序列，从而测定序列相似性。由于对比的局部性质，BLAST在确定精确匹配或鉴定同源物中特别有用。

一般来说，本发明中所用的调节元件包括在植物细胞中有活性的启动子。为了获得在转基因植物的所有组织中表达，优选使用组成型启动子，例如CaMV的35S启动子(Odell，“自然”313(1985),810-812)或玉米多泛素基因启动子(Christensen，“植物分子生物学”18(1982),675-689)。为了实现在转基因植物的特定组织中表达，可以使用组织特异性启动子(例如参见Stockhaus,EMBO杂志，8(1989),2245-2251)。还已知在马铃薯块茎或不同植物种如玉米、豌豆、小麦、大麦等的种子中具有特异活性的启动子。为了能精确控制表达，可以使用诱导型启动子。诱导型启动子的例子为编码热激蛋白的基因的启动子。其它有用的启动子在现有技术中有描述，例如参见：

a)诱导型启动子：

描述在WO 93/21334(=alcA/alcR系统)、WO 90/08826、WO 96/37609中，

b)在光合活性组织中有活性的启动子：

ST-LS1启动子(Stockhaus等人，美国国家科学院院报84(1987),7943-7947；Stockhaus等人，EMBO杂志8(1989),2445-2451)、Ca/b启动子(例如参见US5656496A；US5639952A；Bansal等人，美国国家科学院院报89(1992),3654-3658))和Rubisco SSU启动子(例如参见US5034322A；US4962028A)以及STL1启动子(Eckes等人，Mol.Gen.Genet.205(1986),14-22)

c)介导在保卫细胞中表达的启动子和顺式活性元件：

-DE 19904754.5

-DE 4207358

-截短的AGP酶启动子(Muller-Rober等人，“植物细胞”6(1994),601-612)

-Rhal启动子(Terryn等人，“植物细胞”5(1993),1761-1769)

d)介导在分生组织中表达的启动子：

-小麦组蛋白H4启动子(Bilgin等人，“植物科学”143(1999),35-44)

-水稻PCNA启动子(Kosugi等人，“植物杂志”7(1995),877-886)

-小麦组蛋白H2B启动子(Yang等人，“植物分子生物学”28(1994),155-172)

-cyc07-启动子(Ito等人，“植物分子生物学”24(1994),863-878).

同样已描述了微孔特异性调节元件及其用途(WO96/16182)。而且，可以使用可化学诱导的Tet-系统(Gatz,Mol.Gen.Genet.227(1991)；229-237)。其它适宜的启动子对本领域技术人员来说为已知并描述在例如Ward(“植物分子生物学”22(1993),361-366)中。这些调节元件还可以含有在植物细胞中起作用的转录和/或翻译增强子。经常使用的植物翻译增强子为例如CaMVω序列和/或内含子内含物(例如来自玉米Shrunken基因的内含子-1)，它们已显示出增加表达水平高至100倍(Maiti，“转基因研究”6(1997),143-156；Ni，“植物杂志”7(1995),661-676)。而且，这些调节元件可以包括如聚腺苷酸化信号的转录终止信号，所述聚腺苷酸化信号使得将聚腺苷酸尾添加到可以提高其稳定性的转录物上。经常使用的这些终止信号来自胭脂碱合成酶基因或CaMV 35SRNA基因。

在本发明重组DNA分子的优选实施方案中，枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶来自植物。优选地，所述植物为如本文前面提到的单子叶植物或双子叶植物。特别优选的植物为拟南芥属。

本发明还涉及载体，特别是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和常用于遗传工程且含有至少一个本发明重组DNA分子的其它载体。可以使用本领域技术人员公知的方法构建各种质粒和载体；例如参见Sambrook在“分子克隆实验室手册”纽约冷泉港实验室(1989)中和Ausubel在“分子生物学的当前方案”Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中所述的技术。或者，可以将本发明的重组DNA分子和载体重组到用于递送到靶细胞中的脂质体中。

有利地，本发明的上述载体包括选择性和/或评价性标记。用于选择转化植物细胞、愈伤组织、植物组织和植物的选择性标记基因对本领域技术人员来说为公知并包含例如，作为选择dhfr的基础的抗代谢物抗性，它赋予氨甲蝶呤抗性(Reiss，“植物生理”(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149)；作为选择npt的基础的抗代谢物抗性，它赋予氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素抗性(Herrera-Estrella,“EMBO杂志”2(1983),987-995)；以及作为选择hpt的基础的抗代谢物抗性，它赋予潮霉素抗性(Marsh，“基因”32(1984),481-485)。已描述了其它选择性基因，即trpB，它使细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，它使细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman，美国国家科学院院报85(1988),8047)；使细胞利用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶(WO 94/20627)和赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，即DFMO抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue,1987，于：“分子生物学的当前通讯”，冷泉港实验室编辑)或赋予杀稻瘟菌素S抗性的来自土曲霉的脱氨基酶(Tamura“生物科学、生物技术、生物化学”59(1995),2336-2338)。有用的评价性标记对本领域技术人员来说也为已知并可商购获得。有利地，所述标记为编码荧光素酶的基因(Giacomin,PI.Sci.116(1996),59-72；Scikantha,J.Bact.178(1996),121)、编码绿色荧光蛋白的基因(Gerdes,FEBS Lett.389(1996),44-47)或编码β-葡萄糖醛酸酶的基因(Jefferson,“EMBO杂志”6(1987),3901-3907)。该实施方案对简单快速地筛选含有本发明载体的细胞、组织和生物体特别有用。如上所述，按照本发明可以使用各种选择性标记。有利地，可以使用适宜直接选择转化植物的选择性标记，例如膦丝菌素-N-乙酰基转移酶基因——使除草剂L-膦丝菌素解毒的基因产物(glufosinate或BASTA)；参见例如DeBlock,“EMBO杂志”6(1987),2513-2518和Droge“植物”187(1992),142-151。

本发明还涉及含有本发明重组DNA分子或载体的宿主细胞。宿主细胞分别包括原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌和酵母。

本发明的重组DNA分子在遗传操作植物细胞、植物组织和植物中特别有用，以便获得具有修饰，优选具有如上所述改善或有用表型的植物。因此，本发明涉及一种与野生型植物相比具有改变的气孔特性的转基因植物的生产方法，包括将本发明的重组DNA分子引入植物、植物细胞或植物组织的基因组中。

将外来DNA引入植物以及由植物细胞和植物组织选择并再生转基因植物的方法在本领域中也为公知。这些方法包括，例如，使用根癌农杆菌或毛根农杆菌转化具有T-DNA的植物细胞、植物组织或植物，融合原生质体、直接基因转移(参见例如EP164575A)、注射、电穿孔、生物分解(biolistic)法如粒子轰击以及本领域中已知的其它方法。本发明方法中所用的载体可以含有其它功能性元件，例如农杆菌T-DNA的“左边缘”-和“右边缘”-序列，它们能稳定整合到植物基因组中。而且，方法和载体对本领域技术人员来说为已知，它们允许产生转基因植物中没有的标记，即选择性或评价性标记基因在植物发育或植物育种的某一阶段丢失了。这可以通过例如共转化(Lyznik，“植物分子生物学”13(1989),151-161；Peng，“植物分子生物学”27(1995),91-104)和/或使用能在植物中促进同源重组的酶的系统(例如参见WO97/08331；Bayley“植物分子生物学”18(1992),353-361；Lloyd,Mol.Gen.Genet.242(1994),653-657；Maeser,Mol.Gen.Genet.230(1991),170-176；Onouchi，“核酸研究”19(1991),6373-6378)来实现。例如Sambrook描述了制备适宜载体的方法(分子克隆；实验室手册，第二版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。适宜的根癌农杆菌菌株和载体以及农杆菌的转化和适宜生长和培养基的选择对本领域技术人员来说为公知并描述在现有技术(GV3101(pMK90RK),Koncz,Mol.Gen.Genet.204(1986),383-396；C58C1(pGV 3850kan),Deblaere，“核酸研究”13(1985),4777；Bevan，“核酸研究”12(1984),8711；Koncz，美国国家科学院院报86(1989),8467-8471；Koncz，“植物分子生物学”20(1992),963-976；Koncz，用于遗传标记和表达研究的特化载体，于：“植物分子生物学手册第2卷，Gelvin和Schilperoort(编辑)，Dordrecht，荷兰：Kluwer Academic Publ.(1994),1-22；EP-120516-A；Hoekema：“二元植物载体系统”，Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985)，第5章，Fraley,Crit.Rev.Plant.Sci.,4,1-46；An,“EMBO杂志”4(1985),277-287)中。尽管在本发明方法中优选根癌农杆菌，但是例如如果希望通过所述菌株赋予表型，则可以使用其它农杆菌属菌株，例如毛根农杆菌。

使用生物分解法的转化方法对本领域技术人员来说为公知，例如参见Wan的“植物生理”104(1994),37-48；Vasil的“生物/技术”11(1993),1553-1558和Christou(1996)“植物科学的趋势”1,423-431。可以如Potrykus和Spangenberg(编辑)的“向植物中的基因转移”SpringerVerlag,Berlin,NY(1995)中所述的进行微量注射。可以用上述的方法进行大多数双子叶植物的转化。但是对单子叶植物的转化也开发了几种成功的转化技术。这些技术包括使用如上所述的生物分解法的转化，以及原生质体转化、部分渗透细胞的电穿孔，使用玻璃纤维引入DNA等。可以通过本领域中公知的方法再生转基因植物组织和植物。在特异地处理玉米转化的相关文献中有许多参考资料(例如参见WO95/06128、EP0513849、EP 0465875)。在EP 292435中描述了一种方法，由此可以从无粘液、易碎的颗粒状玉米愈伤组织开始获得能育植物。在本文中，Shillito等人(“生物/技术”7(1989),581)进一步观察到，再生能育植物必需从愈伤组织悬浮培养液开始，由此可以生产分裂原生质体的培养液，它能再生成植物。在体外栽培7-8个月之后，Shillito等人获得了具有能生存的代的植物，但是，它呈现出形态学和繁殖力方面的异常。

Prioli和Sondahl在“生物/技术”7(1989),589中描述了如何由Cateto玉米近交Cat 100-1的玉米原生质体再生并获得能育植物。作者假设原生质体再生成能育植物取决于许多不同因素如基因型、供体细胞的生理状态和栽培条件。就水稻而言可以应用各种转化方法，例如通过农杆菌介导基因转移的转化(Hiei等人“植物杂志”6(1994),271-282；Hiei等人，“植物分子生物学”35(1997),205-218；Park等人“植物生物学杂志”38(1995),365-371)、原生质体转化(Datta于“向植物中的基因转移”I.Potrykus,G.Spangenberg(编辑)，Springer-Verlag BerlinHeidelberg(1995)，第66-75页；Datta等人“植物分子生物学”20(1992),619-629；Sadasivam等人，“植物细胞繁殖”13(1994),394-396)、生物分解研究(Li等人“植物细胞繁殖”12(1993),250-255；Cao等人“植物细胞繁殖”11(1992),586-591；Christou，“植物分子生物学”(1997),197-203)和电穿孔(Xu等人，于“向植物中的基因转移”I.Potrykus,G.Spangenberg(编辑)，Springer-Verlag Berlin Heidelberg(1995)，第201-208页)。

一旦引入的DNA整合到植物细胞的基因组中，它通常继续保持稳定并保留在原始转化细胞的后代中。它通常含有将抗杀生物剂或抗抗生素如卡那霉素、G 418、博莱霉素、潮霉素或膦丝菌素等的抗性赋予转化植物细胞的选择性标记。因此单独选择的标记应允许选择转化细胞，而淘汰缺少引入的DNA的细胞。

转化细胞以通常的方式在植物中生长(还参见McCormick等人的“植物细胞繁殖”5(1986),81-84)。所得植物可以常规方式栽培并与具有相同转化遗传继承物或另一种遗传继承物的植物杂交育种。所得杂种个体具有相应的表型性状。

为了保证表型特征是否稳定地保留以及是否转移，应培养两个或多个世代。而且，为了确保保留相应表型或其它性状，应收获种子。

一般来说，能用本发明的重组DNA分子或载体修饰的植物、植物细胞和植物组织可以来自任何所需植物种。它们可以为单子叶植物或双子叶植物，优选它们属于农业、树木培养或园艺中感兴趣的植物种，如农作物(例如玉米、水稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦等)，如西红柿、芒果、香蕉、菊苣、生菜、卷心菜或马铃薯的蔬菜植物、烟草、苜蓿、红花草、产油植物(例如油菜、向日葵、花生、大豆等)、棉花、甜菜、亚麻籽、亚麻、小米、大麻、甘蔗、豆科植物(例如黄豆、豌豆等)、产木植物，优选树等。

因此，本发明还涉及含有上面定义的核酸分子或本发明的重组DNA分子或载体的转基因植物细胞，其中所述核酸分子相对转基因植物细胞为外来的。

“外来”意思是所述核酸分子或者相对植物细胞为异源，这意思是得自具有不同基因组背景的细胞或生物体，或者相对植物细胞为同源但位于与所述核酸分子的天然存在对应物不同的基因组环境中。这意味着，如果所述核酸分子相对植物细胞同源，那么当稳定整合到基因组中时，它不位于所述植物细胞基因组中的天然位置，具体地说它被不同基因围绕。在这种情况下，所述核酸分子可以在其自身启动子控制下，或者可以在异源启动子的控制下。存在于植物细胞中的本发明核酸分子、载体或重组DNA分子或者可以被整合到植物细胞的基因组中，或者可以在染色体外保持一定形状。

一方面，本发明涉及转基因植物细胞，它含有稳定地整合到基因组中的本发明的重组DNA分子或载体，或者可以根据本发明的方法获得的，其中与野生型植物相比，所述核酸分子的表达使得枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在转基因植物中的表达或活性增加。

在本发明上下文中的术语“活性增加”应理解为意思是编码本发明蛋白质的外源基因的表达增加和/或细胞中本发明蛋白质的量增加。

表达增加例如可以通过测定编码本发明蛋白质的转录物的量来确定，例如通过Northern-印迹分析，优选通过更灵敏的NASBA法(如Leone等人在“病毒学方法杂志”66(1997),19-27；Leone等人在“核酸研究”26(1998),2150-2155；Nakahara等人在“核酸研究”26(1998),1854-1856中所述的)或者通过RT-PCR。优选地，本文中的增加意思是与至少5％、更优选至少20％、特别是至少50％并最优选至少400％未被遗传地修饰的相应细胞相比，编码枯草杆菌蛋白酶的转录物的量增加。

优选地，枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在转基因植物中的表达或活性增加导致气孔密度增加，例如参见实施例7。本发明蛋白质的量增加例如可以通过Western-印迹分析测定。优选地，本文中的增加意思是与至少5％、更优选至少20％、特别是至少50％并最优选至少400％未被遗传地修饰的相应细胞相比，本发明蛋白质的量增加。

或者，具有编码存在于其基因组中的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸分子的植物细胞可以经使用并修饰，以便所述植物细胞在异源启动子和/或增强子元件的控制下表达相应于该核酸分子的外源基因。可以按照标准方法使用例如基因导向载体引入天然不控制编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸分子表达的异源启动子及所述元件，参见上文，和例如Hayashi的“科学”258(1992),1350-1353；Fritze和Walden的通过T-DNA标记的基因活化(“分子生物学方法”44(Gartland,K.M.A.和Davey,M.R.编辑)，Totowa：人类出版社(1995),281-294)或者转座子标记技术(Chandlee,″Physiologia Plantarum″78(1990),105-115)。适宜的启动子和如增强子的其它调节元件包括本文前面所提到的那些。

而且，本发明涉及含有本发明植物细胞或通过如上所述方法获得的植物细胞的转基因植物或植物组织。优选地，与野生型植物相比，本发明的转基因植物降低了气孔密度、降低了气孔导度和/或水分消耗降低。

气孔密度、叶导度和水分消耗的测定方法如下：

-气孔密度的测定方法：使用Sachs等人在“植物学年报”71(1993),237-243中所述的澄清指甲油取得拷贝。

-导度测定方法：如Muschak等人在“光合作用”33(1997),455-465中所述。

-水分消耗的测定方法：对本领域技术人员来说为已知。

优选地，本发明的转基因植物显示一种或多种以下表型，与相应野生型植物相比：

a)气孔密度：降低至少2％，优选至少5％，更优选至少10％，最优选至少30％；

b)导度：降低至少2％，优选至少5％，更优选至少10％，最优选至少25％；

c)水分消耗：降低至少1％，优选至少3％，更优选至少5％，最优选至少10％。

另一方面，本发明涉及含有稳定地整合到基因组中的本发明重组DNA分子或其部分、本发明的载体或根据本发明方法获得的转基因植物细胞，其中与野生型植物相比，所述核酸分子或其部分的存在、转录和/或表达使得枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在转基因植物中的合成或活性降低。

通常活性降低至少10％，优选至少30％，更优选至少70％，最优选至少100％。测定活性降低的方法以及术语“活性”的定义已在上面提到过。由于显而易见，表达量甚至较少的改变能够对植物表型产生一定的影响，因此使用例如比Northern印迹分析灵敏得多的NASBA分析和RT-PCR的方法分析转基因植物。

优选地，通过反义、有义、核酶、共抑制体内诱变和/或显性突变效应实现所述降低。因此，编码与本发明DNA分子的转录物互补的反义RNA的DNA分子以及这些反义分子也是本发明的主题。因此，互补性并不意味着编码RNA必须100％互补。低度的互补性就足够了，只要它足够高至抑制因在植物细胞中表达的本发明蛋白质的表达。转录RNA优选至少90％，最优选至少95％与本发明的核酸分子的转录物互补。为了在植物细胞中的转录过程中引起反义效应，这些DNA分子的长度至少为15 bp，优选100 bp以上，最优选500 bp以上，但是，经常低于5000 bp，优选短于2500 bp。

本发明还涉及DNA分子，在植物细胞中表达过程中它导致合成RNA,在植物细胞中所述RNA因共抑制效应而降低了编码所述蛋白质的本发明核酸分子的表达。本发明还涉及由此编码的RNA分子。共抑制的原理以及相应DNA序列的生产明确描述在例如WO90/12084,Jorgensen的“生物技术趋势”8(1990),340-344；Niebel等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),91-103；Flavell等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),43-36；Palaqui和Vaucheret，“植物分子生物学”29(1995),149-159；Vaucheret等人，Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317；de Borne等人，Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621和其它资料中。

这些DNA分子优选编码具有高度同源性的RNA，从而转录本发明的核酸分子。然而，并非绝对必要将编码RNA翻译成蛋白质。

在另一个实施方案中，本发明涉及编码具有核酶活性的RNA分子的DNA分子，它特异地切割本发明的DNA分子的转录物以及这些编码的RNA分子。

核酶为具有催化活性的RNA分子，它能切割RNA分子和特定的靶序列。通过重组DNA技术，可以改变核酶的特异性。存在各种核酶。对于以特异地切割某种基因的转录物为目的的实际应用来说，优选使用两组不同核酶的代表。第一组由属于组1内含子核酶类型的核酶组成。第二组由具有所谓“锤头”基元的特征结构特性的核酶组成。可以通过改变侧翼于该基元的序列来修饰靶RNA分子的特异性识别。通过与靶分子中的序列碱基配对，这些序列测定催化反应和因此发生靶分子切割的位置。由于有效切割的序列要求低，因此原则上可以开发出针对每个实际所需RNA分子的特异性核酶。

为了生产编码特异地切割本发明DNA分子的转录物的核酶的DNA分子，例如编码核酶催化结构域的DNA序列在两侧与编码靶蛋白的序列同源的DNA序列相连。编码该催化结构域的序列例如可以为SCMo病毒的卫星DNA的催化结构域(Davies等人，“病毒学”177(1990),216-224和Steinecke等人“EMBO杂志”11(1992),1525-1530)或者TobR病毒的卫星DNA的催化结构域(Haseloff和Gerlach，“自然”334(1988),585-591)。在催化结构域两侧的DNA序列优选来自本发明的上述DNA分子。为了降低细胞中某些蛋白质的活性而表达核酶对本领域技术人员来说也为已知，并且例如描述在EP-0321201-A1中。核酶在植物细胞中的表达例如也描述在Feyter等人(Mol.Gen.Genet.250(1996),329-338)中。

在一优选实施方案中，通过反义效应实现这种降低。为此将本发明的DNA分子或其部分以反义取向与确保在植物细胞中转录的启动子连接，并且可以与确保转录终止以及转录物聚腺苷酸化的终止信号相连。为了确保植物细胞中有效的反义效应，合成的反义RNA应具有的最小长度为15个核苷酸，优选至少100个核苷酸，并且最优选至少500个核苷酸。而且，编码该反义RNA的DNA序列应与待转化的植物种同源。但是，也可以使用与以内源形式存在于细胞中的DNA序列高度同源的DNA序列，优选同源性大于95％。为了抑制本发明的核酸分子的基因表达，优选使用与SEQ ID NO:1、7、9或11的核苷酸序列同源的DNA分子，即与SEQ ID NO:1、7、9或11的核苷酸序列至少90％，更优选至少93％，特别是至少95％，最优选至少98％相同。

在另一实施方案中，通过核酶效应使本发明的DNA分子编码的蛋白质的量降低。核酶的基本效应以及编码这些RNA分子的DNA分子的构建已在上面有描述。为了在转基因细胞中表达具有核酶活性的RNA，将编码核酶的上述DNA分子与确保在植物细胞中转录的DNA元件相连，特别是与启动子和终止信号相连。在植物细胞中合成的核酶使编码上述枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的mRNA切割。

而且，枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在本发明植物细胞中的活性还可以通过所谓的“体内诱变”(也称为“嵌合体形成”)降低，为此通过转化细胞将杂种RNA-DNA低聚核苷酸(“嵌合体”)引入细胞中(Zhu等人，美国国家科学院院报96(1999),8768-8773,Kipp等人，第5届国际植物分子生物学大会海报，1997年9月21-27日，新加坡；Dixon和Arntzen,关于“转基因植物的代谢工程”的会议报告，Keystone Symposia,CopperMountain,CO,USA,TIBTECH 15(1997),441-447；WO95/15972；Kren等人，“肝脏学”25(1997),1462-1468；Cole-Strauss等人，“科学”273(1996),1386-1389)。

尽管一部分所述RNA-DNA低聚核苷酸的DNA组分与内源枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸序列同源，但是，与内源枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的核酸序列相比，它呈现出突变或含有被同源区包围的异源区。通过RNA-DNA低聚核苷酸的同源区和内源核酸分子的同源区的碱基配对，随后进行同源重组可以将RNA-DNA低聚核苷酸的DNA组分中所含的突变或异源区转移到植物细胞的基因组中。这使得活性降低。

此外，本发明涉及含有本发明的上述植物细胞的转基因植物或植物组织。

在一优选实施方案中，与野生型植物相比，所述转基因植物在植物叶或其它组织或器官中具有增加的气孔密度，较高的气孔导度和/或较高的糖含量和蛋白质含量。气孔密度增加应理解为是指在所有气生植物器官，优选在本发明的植物叶中气孔含量与相应未转化野生型植物相比增加至少约10％，这已对植物活力提供了有益效果，例如干物质增加。有利地，气孔密度增加至少约50％，优选大于约75％，特别优选至少约100％以上，更优选约200％以上。就因本发明的枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在本发明的转基因植物中的表达或活性增加导致的气孔密度降低而言，气孔密度降低至少2％，优选大于5％，特别优选至少约10％以上，更优选约30％以上。优选地，本发明的转基因植物的产量增加，优选就植物可收获部分而言。

本文中的术语“产量增加”应理解为意思是优选成分，特别是可溶性糖和/或蛋白质和/生物量的产量增加，特别是如果以单位植物的鲜重或干重计时。本文中蛋白质和/或糖含量增加意思是与未经修饰的野生型植物的植物细胞相比，本发明的植物细胞中蛋白质含量增加至少5％，优选至少20％，特别是至少50％，最优选至少75％，和/或与未经修饰的野生型植物的植物细胞相比糖含量增加至少5％，优选至少25％，特别是至少50％，最优选至少75％。

糖含量和蛋白质含量的测定方法对本领域技术人员来说为已知。

术语“产量增加”意思是干重增加至少3％，优选至少10％，特别是至少20％，最优选至少30％，和/或鲜重增加至少2％，优选至少5％，特别是至少10％，最优选至少20％。

另一方面，本发明还涉及本发明转基因植物的可收获部分和繁殖材料，含有上述转基因植物细胞，即至少一个本发明和/或来自上述植物的重组DNA分子或载体。可收获部分原则上可以为植物的任何有用部分，例如叶、茎、花、果实、种子、根等。繁殖材料包括例如种子、果实、插条、幼苗、块茎、根茎等。

此外，本发明涉及含有本发明的重组DNA分子或载体的试剂盒。本发明的试剂盒可以含有其它成分，如选择性标记基因和适宜产生转基因植物细胞、植物组织或植物的选择性培养基组分。本发明的试剂盒可以有利地用于实施本发明的方法，并且尤其可用于各种应用中，例如用于诊断领域中或作为研究工具。本发明试剂盒中的各部分可以单独包装在小瓶中或者与容器或多容器单元一起。优选按照标准程序生产试剂盒，这些程序对本领域技术人员来说为已知。本发明的试剂盒或其成分可用于植物细胞和植物组织培养，如农业中。预期本发明的试剂盒和其成分在例如具有如本文中所述的改善性状的植物的新品种育种中特别有用。

因此，本发明还涉及与野生型植物相比产量增加和/或气孔密度增加的转基因植物的生产方法，其中

(a)通过引入外来核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，该核酸分子的存在或表达使得枯草杆菌蛋白酶的活性降低；

(b)由按照步骤(a)制备的细胞再生植物；和

(c)如果有的话，由按照步骤(b)制备的植物产生其它植物。

同样，本发明涉及与野生型植物相比具有降低的水分消耗和/或降低的气孔密度的转基因植物的生产方法，其中

(a)通过引入外来核酸分子对植物细胞进行遗传修饰，该核酸分子的存在或表达使得枯草杆菌蛋白酶的活性增加；

(b)由按照步骤(a)制备的细胞再生植物；和

(c)如果有的话，由按照步骤(b)制备的植物产生其它植物。

而且，本发明涉及编码和/或调节枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶表达的至少一种核酸分子、与这种核酸分子杂交的核酸分子、编码干扰枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在植物中的表达或活性的产物的核酸分子、或者本发明的重组DNA分子或载体在生产产量增加、和/或气孔密度增加、和/或叶鲜重和/或干重增加、和/或叶干物质含量增加、和/或叶中糖含量增加、和/和叶中蛋白质含量增加、和/或二氧化碳同化作用增加、和/或在高辐照度条件下(参见实施例1)持续光合作用(防止光抑制)、和/或就气孔密度而言通过抑制或刺激枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶编码基因对抗改变环境条件的结果的转基因植物中的用途。优选这些核酸分子来自编码枯草杆菌蛋白酶的植物基因。调节这些基因的活性使得一些形态学和生理学的改变对用于农业、树木培养或园艺的改良植物的改造有用。而且，上述核酸分子以及本发明的重组DNA分子和载体可用于改变或修饰植物/病原体相互作用。术语“病原体”包括例如，细菌、病毒和真菌以及原生动物。本发明的植物、植物组织和植物细胞以及这些植物的可收获部分和繁殖材料可用于制备饲料和食品或其添加剂。保藏

在本发明范围内生产和使用的一种质粒按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的要求保藏在位于德国Braunschweig的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心)(DSMZ)，它是被承认的国际保藏处。于1999年10月4日将以下质粒pAH 14/58保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，保藏号：DSM 13076。

通过本发明的描述和实施例公开并包含这些和其它实施方案。有关将根据本发明使用的任一种方法用途和化合物的其它文献例如可以使用电子设备从公共库中检索到。例如可以利用在因特网上可以获得的公共数据库“Medline”，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html下。其它数据库和地址，如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,http://www.infobiogen.fr/,http://www.fmi.ch/biology/research tools.html,http://www.tigr.org/，对本领域技术人员来说为已知，并且还可以使用例如http://www.lycos.com获得。关于生物技术的专利信息的概述以及对于追溯检索和最新情报通报有用的相关专利信息源的调查列于Berks,TIBTECH 12(1994),352-364。

附图显示：

图1：上面：在300μE(μmol m^-2s^-1)和1200μE(μmol m^-2s^-1)白光辐照度下用红外线气体分析仪测定的从野生型(wt)和R-558突变体(R-558)的叶中的水蒸汽释放(蒸腾)。

下面：在300μE(μmol m^-2s^-1)和1200μE(μmol m^-2s^-1)白光辐照度下用红外线气体分析仪测定的向野生型和R-558突变体(R-558)叶中的二氧化碳净摄取(同化)。

图2：图示了标明接近推定的前序列和序列原的氨基酸位置和在所有已知枯草杆菌蛋白酶中发现的四个不变氨基酸(D、H、N、S)位置的SDD1蛋白质。而且，显示出存在于R-558突变体中的突变结果是将氨基酸位置492的R密码子转变成终止密码子，这使得形成的C-末端截取的蛋白质在位置552上缺少必要的丝氨酸残基(S552)。

图3：图示了质粒pG-SDD1

片段A：BAC IGF20D22的7067 bp Sall-EcoRⅤ亚片段，包括SDD1的

2328 bp编码区以及2kb上游DNA(启动子)和2.8kb下游DNA，

将其插入载体pBIB-Hyg的Sall和Smal位点。

载体：pBIB-Hyg(Becker,1990，“核酸研究”18,203)。

图4：图示质粒p35S-SDD1

片段A：花椰菜花叶病毒的35S启动子；

(Gardner等人，1981，“核酸研究”9,2871-2888)

片段B：SDD1基因的2328个核苷酸的编码区(SEQ ID No.1)

片段C：来自Ti-质粒pTi ACH 5的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信

号(Gielen等人，1984,“EMBO杂志”3,835-846)

载体：pBIB-Hyg(Becker,1990，“核酸研究”18,203)。

图5：在枯草杆菌蛋白酶BPN’(Wells等人，1983，“核酸研究”11,7911-7925)、酵母KEX2(Wizuno等人，1988，“生物化学生物物理研究通讯”156,246-254)、人FURIN/PACE(Wise等人，1990，“美国国家科学院院报”87,9378-9382)、人PC1/PC3(Seidah等人，1991，“分子内分泌学”5,111-122；Smeekens等人，1991，“美国国家科学院院报”88,340-344)、来自甜瓜的CUCUMISIN(Yamagata等人，1994，“生物化学杂志”269,32725-32731)、来自番茄的LeP69(Tornero等人，1996，“美国国家科学院院报”93,6332-6337)、来自粘性赤杨的AG12(Ribeiro等人，1995，“植物细胞”7,785-794)和SDD1中的四个高度保守的结构域——D区、H区、底物结合部位和S区的序列对比。不变氨基酸的位置用*标记。存在于不同枯草杆菌蛋白酶的相应位置上的相同氨基酸用黑盒突出显示。

图6：图示质粒p35S-αSDD1

片段A：花椰菜花叶病毒的35S启动子；

(Gardner等人，1981，“核酸研究”9,2871-2888)

片段B：以反义取向插入到35S启动子中的SDD1基因的2079 bp片段

(相应于SEQ ID No.1中所示序列的位置74-2153)

片段C：来自Ti-质粒pTi ACH 5的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信

号(Gielen等人，1984,“EMBO杂志”3,835-846)

载体：pBIB-Hyg(Becker,1990，“核酸研究”18,203)。

图7：三种不同枯草杆菌蛋白酶的氨基酸比较；

at_subp 1=来自拟南芥的枯草杆菌蛋白酶，参见SEQ ID No.2,

st_subp 1=来自马铃薯的枯草杆菌蛋白酶，参见SEQ ID No.8；

st_subp 2=来自马铃薯的枯草杆菌蛋白酶，参见SEQ ID NO.12。

下面的实施例描述本发明：

实施例1：特别是在高辐照度的条件下在拟南芥R-558突变体中水蒸腾和二氧化碳同化增加

在标准培养条件下在风土驯化生长室中使拟南芥R-558突变体植物和相应野生型植物(wt)在16小时光周期(180μmol m^-2s^-1荧光；灯类型：TLD36W/840和TLD36W/830，Philips,Hamburg,Germany)(日夜温度和相对湿度分别为20℃,60％和16℃,75％)下在土壤(Einheitserde Typ P/Einheitserde Typ T/沙子：2/1/1)中生长直到抽苔。将单片叶(n=10)夹入红外线气体分析仪(Walz,Effeltrich,Germany)的气体交换测定室中，同时根据Muschak等人(“光合作用”33,455-465,1997)所述的程序测定叶的水分释放和二氧化碳摄取。如图1所示，突变体植物的叶显示出在测定期间应用低光照(300μmol m^-2s^-1)和高光照(1200μmol m^-2s^-1)条件下水分蒸腾增加并且二氧化碳同化(净摄取)增加。二氧化碳同化的提高，在R-558突变体中的几乎为野生型中的一倍，在高光照条件下更显著，这是由于与低光照条件相比，高光照条件抑制了野生型中的二氧化碳同化(光抑制)造成的。

实施例2：通过基于作图的基因克隆法分离SDD1基因

已预先将受R-558突变体中突变影响的遗传基因座作图到拟南芥染色体1的上臂上以分子标记IGF-20G19LE和IGF-25I3RE为边界间隔约0.59cM(D.Berger,1997,PhD Thesis Freie Universitat Berlin)。拟南芥基因组IGF-BAC文库的两个克隆(Mozo等人，1998,Mol.Gen.Genet.258,562-570),IGF20D22和IGF21M11，完全包含了该区域，通过作为一部分拟南芥属基因组发端的SPP聚生体(参见http://sequence-www.stanford.edu/ara/SPP.html)测序(Bevan等人，1997，“植物细胞”9,476-478；http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)。因此经鉴定该0.59cM区域包含了113kb基因组DNA序列。为了鉴定相应于突变体基因座的SDD1基因，通过应用限制性SSCP-(单链构象多形性)技术(Dean和Gerrard,1991，“生物技术”10,332-333；Iwahana等人，1992，“生物技术”12,64-66)扫描该区域中的突变，为此使该技术适合于在植物中的应用。该方法新颖，并且以前从未应用于在植物中的突变扫描。因此，将各2-kb的57个DNA片段分别由野生型和R-558植物的总DNA扩增，并在用AluⅠ和/或HinfⅠ消化之后通过如Dean和Gerrard，1991(生物技术10,332-333)和Iwahana等人，1992(生物技术12,64-66)所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析它们。在两个基因型之间辨别并通过测序相应DNA片段检测单个SSCP，显示出是由C/G→T/A单突变(Seq.ID No.1；Seq.ID No.3)引起的。该突变将早期终止密码子引入跨越编码775个氨基酸的推定多肽的2328 bp的预测基因的ORF中(图2；Seq.ID No.2；Seq.ID No.4；基因库登记号AC002411；http://pgec-genome.pw.usda.gov/F20D22.anno.htm1#anchor12)。

实施例3：通过根癌农杆菌-介导的DNA-转移遗传互补R-558突变体

为了证实作为在R-558突变体中有缺陷的SDD1基因的蛋白质编码区的2328 bp DNA序列(Seq.ID No.1；)的相同性，通过根癌农杆菌-介导的遗传转化将野生型DNA-拷贝引入R-558突变体中来进行遗传互补实验。

为此产生两个质粒：

质粒pG-SSD1’(图3)携带有BAC IGF20D22的7067 bp Sall-EcoRⅤ亚片段，包括SDD1的2328bp编码区以及2kb上游DNA(启动子)和2.8kb下游DNA，将其插入T-DNA载体pBIB-Hyg的Sall和Smal位点(Becker,1990，“核酸研究”18,203)。

第二个质粒，p35S-SDD1(图4)，包含三个片段，A、B、C，它们插入pBIB-Hyg载体(Becker,1990，“核酸研究”18,203)中。片段A，插在pBIB-Hyg的多接头中的EcoRⅠ和SacⅠ限制位点之间，包括花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV)，如Gardner等人(“核酸研究”9,2871-2888,1981)所述含有核苷酸7146-7464。片段C含有来自Ti-质粒pTi ACH 5的T-DNA的基因3的聚腺苷酸化信号(Gielen等人，“EMBO杂志”3,835-846,1984)、作为PvuⅡ-HindⅢ片段从质粒pAGV 40分离(Herrera-Estrella等人，“自然”303,209-213,1983)并将SphⅠ接头加到PvuⅡ限制位点之后插入pBIB-Hyg的SphⅠ和HindⅢ限制位点的核苷酸11749-11939。所得间插质粒称为pBIN-AR-Hyg。片段B包含SDD1基因的2328个核苷酸的编码区(SEQ ID No.1)，通过PCR从BACIGF20D22将其扩增并提供Asp718和Xbal接头序列，其被插入pBIN-AR-Hyg的Asp718和Xbal限制位点。

按照Hofgen和Willmitzer所述的程序(“核酸研究”16,9877,1988)分别将两个质粒都引入根癌农杆菌中，并按照Bechtold等人(Compt.Rend.Acad.Sci.316,1194-1199,1993)所述的方法以植物转化通过根癌农杆菌将相应T-DNA稳定地引入R-558突变体中。选择具有抗生素(潮霉素)抗性的转化幼苗生长至成熟，通过显微镜检查用80％乙醇固定的莲座叶来检验突变体或野生型表型的表达。

表1：在野生型(wt)、突变体(R-558)和转基因突变体(R-558/G-SDD1；R-558/35S-SDD1)的子叶和叶的远轴表皮中的气孔密度和分布的分析

植物	子叶			初生叶			密度[数目/mm²]
	子叶			初生叶				单个气孔^a	群集气孔^b	n^c	单个气孔^a	群集气孔^b	n^c
	wt#1wt#2wt#3wt#4wt#5R-558#1R-558#2R-558#3R-558#4R-558#5R-558/G-SDD1#1R-558/G-SDD1#2R-558/G-SDD1#3R-558/G-SDD1#4R-558/G-SDD1#5R-558/G-SDD1#6R-558/G-SDD1#7R-558/G-SDD1#8R-558/G-SDD1#9R-5588/G-SDD1#10R-558/35S-SDD1#1R-558/35S-SDD1#2R-558/35S-SDD1#3R-558/35S-SDD1#4R-558/35S-SDD1#5R-558/35S-SDD1#6R-558/35S-SDD1#7R-558/35S-SDD1#8R-558/35S-SDD1#9R-558/35S-SDD1#10	100％100％100％100％100％61％56％54％58％60％100％100％100％96.4％100％100％100％96.8％100％96.7％82％100％93％74％100％80％53％91％80％94％	0％0％0％0％0％39％44％46％42％40％0％0％0％3.6％0％0％0％3.2％0％3.3％18％0％7％26％0％20％47％9％20％6％	5840514958136621371098547535255535553623760663455804570131689065	100％100％98.9％100％100％86％90.1％89.6％93.9％91.6％100％83.4％100％100％100％100％100％100％100％100％100％100％100％100％100％100％98％100％95.1％100％	0％0％1.1％0％0％14％9.9％10.4％6.1％8.4％0％16.6％0％0％0％0％0％0％0％0％0％0％0％0％0％0％2％0％4.9％0％		单个气孔^a	群集气孔^b	n^c	单个气孔^a	群集气孔^b	n^c	16317417616016649242139540940327918113919518016916328598199167123168136122195200123123108	97.0124.3125.7114.3118.6351.4300.7282.1292.1287.9199.3161.699.3139.3128.6120.7116.4203.670.0142.1119.387.912097.187.1139.3142.987.987.977.1

^a通过至少一个表皮细胞与其它气孔分开的气孔。^b直接与至少一个其它气孔接触气孔。^c抽样的气孔数。

如表1所示，就存在/没有群集气孔而言，10个包含pG-SDD1或p35S-SDD1质粒的T-DNA的转化体中分别有7个和2个在子叶上显示出野生型表型。携带有p35S-SDD1的T-DNA的7个转化体因转基因在子叶中的不适当表达而在该器官中显示出一中间表型。在初生叶中，与R-558突变体相比，包含pG-SDD1的T-DNA的所有10个转化体和携带有p35S-SDD1的T-DNA的所有10个转化体都显示出气孔密度和/或群集气孔部分大大降低。这些数据明确地证实了作为SDD1基因编码区的2325 bp DNA片段的相同性。

实施例4：SDD1核苷酸序列和SDD1氨基酸序列的分析

使用GCG 8.1和BLAST 2.0计算机程序进行SDD1核苷酸和推知的氨基酸序列的分析(参见：Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8,1994年9月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711；Altschul等人，1997，“核酸研究”25,3389-3402)。

SDD1的推知的氨基酸序列显示出与特定类别的丝氨酸蛋白酶类(称为枯草杆菌蛋白酶或二元加工内切蛋白酶)的已知成员显著相同/相似。在枯草杆菌蛋白酶中，4个区域形成催化三联体和底物结合部位并在枯草杆菌蛋白酶、其主要代表为细菌SUBTILISIN BPN’中(Wells等人，1983，“核酸研究”11,7911-7925)、酵母的KEX2(Mizuno等人，1988，“生物化学生物物理研究通讯”156,246-254)、人弗林蛋白酶/PAGE(基因库，登记号X17094)和PC1/PC3(Seidah等人，1991，“分子内分泌学”5,11-122；Smeekens等人，1991，“美国国家科学院院报”88,340-344)中最高度保守。已从编码枯草杆菌蛋白酶的植物中分离出几个基因，例如从甜瓜中分离出的CUCUMISIN(Yamagata等人，1994，“生物化学杂志”，269,32725-32731)从番茄分离出的P69(Tornero等人，1996，“美国国家科学院院报”93,6332-6337)，或者从粘性赤杨分离出的AG12(Ribeiro等人，1995，“植物细胞”7,785-794)。但是，这些植物酶的体内功能至今还不清楚。在这4个保守区域中，SDD1显示出与上面所列的枯草杆菌蛋白酶最高的序列相似性，并含有存在于至今已知的所有枯草杆菌蛋白酶中的4个特征不变氨基酸(图5)。这清楚地证实了SDD1属于这一类内切蛋白酶。然而，在底物结合部位内的氨基酸序列基元VICAAGNNG是独特的，且与所有其它已知枯草杆菌蛋白酶的SDD1不同。存在于R-558突变体中的突变使得早期终止密码子形成C-端截取的蛋白质，该蛋白质缺少含催化活性丝氨酸残基的必要S-结构域(图2)。

实施例5：通过遗传工程调节SDD1表达来调节植物中的气孔密度通过分析其它转基因植物来说明通过调节SDD1基因表达的程度使得植物中气孔密度具有各种不同水平增加或降低的SDD1基因的有用性。携带有前述(实施例4)p35S-SDD1的T-DNA的转基因植物10个中有4个并且携带有前述(实施例4)pG-SDD1的T-DNA的转基因植物10个中有1个显示出气孔密度比平行分析的相应野生型植物的低(表1)。

而且，进行了SDD1反义抑制研究：结果，产生了含有称为“35S-αSDD1”的反义基因构建体的质粒p35S-αSDD1(图6)。SDD1基因的2079 bp-片段(相应于Seq ID 1中所示的序列的位置74-2153)经PCR-扩增并亚克隆到pCR2.1-载体(Invitrogen,Leek The Netherlands)中。使用侧翼Asp718(3′)和Xbal(5′)限制位点，将2 kb SDD1-片段从pCR2.1-载体切下并插入pBIN-AR-Hyg载体(参见实施例3)的Asp718和Xbal部位，这样将其以反义取向放置到CaMV 35S-启动子中。

按照Hofgen和Willmitzer(“核酸研究”16,9887,1988)将质粒p35S-αSDD1引入根癌农杆菌中，并通过应用Schmidt和Willmitzer所述的程序(“植物细胞繁殖”7,583-586,1988)将其用于产生转基因拟南芥植物。在由此产生的携带有p35S-αSDD1的T-DNA的转基因植物中，获得气孔密度增加的个体。

因此证明，通过应用遗传工程技术，可以使用编码枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的基因产生通过调节所述基因表达引起的气孔密度具有各种不同水平降低或增加的植物。

实施例6：由马铃薯克隆两个SDD1同源物

将代表来自拟南芥属的完整SDD1编码区的2328 bp片段由拟南芥基因组IGF-BAC文库(Mozo等人，1998,Mol.Gen.Genet.258,562-570)的克隆IGF20D22经PCR扩增，并将其用作筛选步骤中的放射性标记探针(随机引导DNA标记试剂盒，Boehringer Mannheim)。

使用Hybond N滤器(Amersham)在来自马铃薯L.系AM80/5793的1.6×10⁶ pfus基因组库上进行噬斑提升(Liu等人，1991，“植物分子生物学”17,1139-1154)。

在42℃下在缓冲液A(5×SSC,0.5％BSA,5×Denhardt,1％SDS,40 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2,100 mg/1鲱鱼精子DNA,25％甲酰胺)中预杂交4小时后，将滤器杂交到放射性标记探针(参见上面)上。杂交8小时之后，在50℃下在含有3×SSC和0.5％SDS的缓冲液中将滤器冲洗3次持续20分钟。通常将X-射线胶片进行曝光14小时。

将10个牢固杂交噬菌体噬斑再筛选并纯化至均质。根据Patterson和Dean 1987(NAR Vol.15(15),6298)所述方法制备噬菌体DNA。

根据其限制图谱和Southern分析，使用放射性标记的SDD1 PCR片段作为探针，将噬菌体分成两个不同类别。在类别Ⅰ中，将一3864 bp杂交EcoRⅠ/Sall片段亚克隆至pMCS5(EcoRⅠ/Sall)(“分子生物技术”，Gottingen)，获得质粒pAH10/58。在类别Ⅱ中，将一约4.5kb杂交Scal-片段亚克隆至pMCS5(“分子生物技术”，Gottingen)，获得质粒pAH14/58。对这两个质粒都进行DNA-测序分析并且它们含有核苷酸序列，该序列编码：来自马铃薯的SDD1同源物Plgen(SEQ ID NO:7)、P1-相应于Plgen但没有内含子-(SEQ ID NO:9)和P2(SEQ ID NO:11)。类别Ⅰ中片段的特征是有内含子，类别Ⅱ中片段的特征是没有内含子。被P1和P2编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOS:8、10和12中，并与图7中的SDD1的比较。

实施例7：在烟草中超量表达枯草杆菌蛋白酶

由拟南芥变种C24的基因组，和Asp 718/XbaⅠ(含有这些序列的引物)将2.3 kb基因组片段通过PCR扩增，并克隆到载体pBinAR Hyg(Hofgen和Willmitzer(1990)，“植物科学”66：221-230)中。

通过热激将农杆菌GV2260(Deblaere(1985)，“核酸研究”13:4777-4788)转化，将烟草植物用可改变的SNN感染并再生(Rosahl等人，(1987)“EMBO杂志”6：1155-1159)。

检测总共24株植物的RNA表达。为此，根据Logemann等人((1987)“分析生物化学”163:16-20)以组织培养(22℃,50％大气湿度，2000 Lux,16h/8h光周期)制备来自叶子植物的RNA。将约10μg RNA加样到变性凝胶(Lehrach等人，(1977)“生物化学”16:4743-4751)上，并由此经毛细管转移将其转移到带正电膜Hybond N⁺(Amersham Buchler,Braunschweig)上。之后，通过热固定(2h/80℃)将该RNA固定在该膜上，在2×SSC中冲洗一段短时间(2-3分钟)，在65℃下预杂交至少1小时(0.25M磷酸钠缓冲液，pH7.2,1％BSA,7％SDS和10mM EDTA)，并在65℃下与放射活性标记的探针(Feinberg和Vogelstein，(1983)“分析生物化学”132:6-13)杂交一夜。在65℃下用2×SSC冲洗2次，每次持续30分钟，之后，在-80℃下将滤器在X-射线胶片上曝光一夜。

通过“Northern技术”分析总共24株植物，其中12株可以分类为阳性表达物，9株可以分类为强表达物，3株可以分为弱表达物。使用澄清指甲油由这些植物以及野生型制备拷贝，分析来自不同野生型植物的5片叶。为此，对每5个区域计数，并以气孔数/mm²确定气孔密度。当这样做的时候，出人意料地发现近轴叶表面上的气孔密度约为远轴表面上的2倍；参见表2。

表2气孔密度的显微镜分析WT/近轴的

WT/远轴的

ARsubt./近轴的

ARsubt./远轴的

WT AR

Subt近轴的 56 19远轴的 112 63

STD=标准偏差

MV=平均值

WT=野生型

AR=转基因植物

显微镜分析通过使用澄清指甲油取得的转基因植物拷贝之后，可以检测到叶两面的气孔密度降低约50％。但是，在转基因植物中还发现了气孔下生的表型；参见表2。

在强和弱“表达物”之间未能发现差异；因此甚至SDD1活性的较少增加似乎足以导致表型。

序列表<110>Max-Planck-Gesellschaft zur Fderung der Wissenschaften e.V.<120>调节植物气孔特征的工具和方法<130>C1748PCT<140><141><160>61<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2328<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(1)..(2325)<400>1atg gaa ccc aaa cct ttc ttt ctc tgc att atc ttt ctt cta ttt tgt 48Met Glu Pro Lys Pro Phe Phe Leu Cys Ile Ile Phe Leu Leu Phe Cys1 5 10 15tct tct tcg tca gag atc ctg cag aag cag act tac att gtt cag ctt 96Ser Ser Ser Ser Glu Ile Leu Gln Lys Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu

20 25 30cat cct aat agc gaa acc gct aaa acc ttt gcc tca aag ttt gat tgg 144His Pro Asn Ser Glu Thr Ala Lys Thr Phe Ala Ser Lys Phe Asp Trp

35 40 45cat ctt tct ttt ctc caa gaa gcg gtt tta ggt gtt gaa gaa gaa gag 192His Leu Ser Phe Leu Gln Glu Ala Val Leu Gly Val Glu Glu Glu Glu

50 55 60gaa gag cct tct tct cga ctt ctc tac tcc tat ggc tct gcg att gaa 240Glu Glu Pro Ser Ser Arg Leu Leu Tyr Ser Tyr Gly Ser Ala Ile Glu65 70 75 80gga ttt gct gct cag ttg act gaa tca gaa gcc gag ata ctg aga tat 288Gly Phe Ala Ala Gln Leu Thr Glu Ser Glu Ala Glu Ile Leu Arg Tyr

85 90 95tca cct gaa gtt gtt gca gtg aga cct gac cat gtt ctt cag gtt caa 336Ser Pro Glu Val Val Ala Val Arg Pro Asp His Val Leu Gln Val Gln

100 105 110acc act tac tct tac aag ttc ttg gga ctc gac ggt ttt gga aac tcc 384Thr Thr Tyr Ser Tyr Lys Phe Leu Gly Leu Asp Gly Phe Gly Asn Ser

115 120 125ggt gta tgg tct aaa tct cgg ttt ggt caa ggc aca att atc ggc gtg 432Gly Val Trp Ser Lys Ser Arg Phe Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val

130 135 140ctt gat act gga gtt tgg cct gaa agt cct agc ttt gac gat acc gga 480Leu Asp Thr Gly Val Trp Pro Glu Ser Pro Ser Phe Asp Asp Thr Gly145 150 155 160atg cct tcg att cca cgg aaa tgg aaa ggg att tgc caa gaa gga gaa 528Met Pro Ser Ile Pro Arg Lys Trp Lys Gly Ile Cys Gln Glu Gly Glu

165 170 175agt ttc agt tct tcg agc tgt aac cgg aag cta atc ggt gct aga ttc 576Ser Phe Ser Ser Ser Ser Cys Asn Arg Lys Leu Ile Gly Ala Arg Phe

180 185 190ttc atc aga gga cac cgt gtc gct aat tca cca gag gaa tca cca aac 624Phe Ile Arg Gly His Arg Val Ala Asn Ser Pro Glu Glu Ser Pro Asn

195 200 205atg cct cgt gaa tac att tcc gca aga gat tca acg gga cac ggg act 672Met Pro Arg Glu Tyr Ile Ser Ala Arg Asp Ser Thr Gly His Gly Thr

210 215 220cac acc gcc tca aca gtt ggt gga tcc tct gtt tcg atg gcg aat gtt 720His Thr Ala Ser Thr Val Gly Gly Ser Ser Val Ser Met Ala Asn Val225 230 235 240ctt ggc aat gga gct ggt gtg gct cgt ggg atg gct cct gga gct cac 768Leu Gly Asn Gly Ala Gly Val Ala Arg Gly Met Ala Pro Gly Ala His

245 250 255att gca gtc tat aaa gtc tgt tgg ttc aat ggt tgt tac agc tct gac 816Ile Ala Val Tyr Lys Val Cys Trp Phe Asn Gly Cys Tyr Ser Ser Asp

260 265 270att cta gca gct ata gat gta gcg att caa gat aaa gtc gat gtt ctt 864Ile Leu Ala Ala Ile Asp Val Ala Ile Gln Asp Lys Val Asp Val Leu

275 280 285tcg ctt tcc ctt ggc ggt ttc cct att cct ttg tat gat gac aca atc 912Ser Leu Ser Leu Gly Gly Phe Pro Ile Pro Leu Tyr Asp Asp Thr Ile

290 295 300gcc att gga aca ttc cga gcc atg gaa cgc ggt ata tct gta atc tgt 960Ala Ile Gly Thr Phe Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile Ser Val Ile Cys305 310 315 320gca gct ggt aac aac ggt cca atc gaa agc tct gtt gca aac aca gct 1008Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Glu Ser Ser Val Ala Asn Thr Ala

325 330 335cct tgg gtc tca acc att ggc gca ggc acg ctt gat cga aga ttt ccc 1056Pro Trp Val Ser Thr Ile Gly Ala Gly Thr Leu Asp Arg Arg Phe Pro

340 345 350gct gtg gtc aga tta gcc aac gga aag ctt ctc tat gga gag tca ttg 1104Ala Val Val Arg Leu Ala Asn Gly Lys Leu Leu Tyr Gly Glu Ser Leu

355 360 365tat ccg gga aaa ggt ata aag aat gcc ggg aga gag gtt gag gtg att 1152Tyr Pro Gly Lys Gly Ile Lys Asn Ala Gly Arg Glu Val Glu Val Ile

370 375 380tac gtc aca gga gga gat aaa gga agt gag ttc tgt ttg aga ggg tca 1200Tyr Val Thr Gly Gly Asp Lys Gly Ser Glu Phe Cys Leu Arg Gly Ser385 390 395 400ctt cca aga gaa gaa atc cga ggc aaa atg gtg att tgt gat cgc gga 1248Leu Pro Arg Glu Glu Ile Arg Gly Lys Met Val Ile Cys Asp Arg Gly

405 410 415gtc aat gga aga tcg gag aaa gga gaa gcg gtt aaa gaa gct gga gga 1296Val Asn Gly Arg Ser Glu Lys Gly Glu Ala Val Lys Glu Ala Gly Gly

420 425 430gtt gca atg atc tta gcc aat aca gag atc aac caa gaa gaa gat tct 1344Val Ala Met Ile Leu Ala Asn Thr Glu Ile Asn Gln Glu Glu Asp Ser

435 440 445att gac gtt cat ctc tta cca gct aca ttg att ggt tac act gag tca 1392Ile Asp Val His Leu Leu Pro Ala Thr Leu Ile Gly Tyr Thr Glu Ser

450 455 460gtc ctt ctg aag gct tat gtt aat gcc acg gtg aaa cca aag gcg cgg 1440Val Leu Leu Lys Ala Tyr Val Asn Ala Thr Val Lys Pro Lys Ala Arg465 470 475 480ata att ttt ggt ggt acg gtg att ggg agg tca cga gca ccg gag gtg 1488Ile Ile Phe Gly Gly Thr Val Ile Gly Arg Ser Arg Ala Pro Glu Val

485 490 495gct cag ttt tca gct cga gga ccg agt tta gcc aat cct tcg ata cta 1536Ala Gln Phe Ser Ala Arg Gly Pro Ser Leu Ala Asn Pro Ser Ile Leu

500 505 510aaa ccg gat atg att gct ccg gga gtc aat atc att gcg gct tgg cct 1584Lys Pro Asp Met Ile Ala Pro Gly Val Asn Ile Ile Ala Ala Trp Pro

515 520 525caa aat cta gga cca acc gga ctt cct tat gat tca aga aga gtt aac 1632Gln Asn Leu Gly Pro Thr Gly Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Arg Val Asn

530 535 540ttc act gta atg tca gga act tca atg tct tgt cca cat gtt agc gga 1680Phe Thr Val Met Ser Gly Thr Ser Met Ser Cys Pro His Val Ser Gly545 550 555 560atc act gct ctt atc cgg tct gca tac ccg aac tgg tct cca gct gca 1728Ile Thr Ala Leu Ile Arg Ser Ala Tyr Pro Asn Trp Ser Pro Ala Ala

565 570 575atc aaa tcc gca ttg atg aca aca gcg gat ttg tac gat cgt caa ggg 1776Ile Lys Ser Ala Leu Met Thr Thr Ala Asp Leu Tyr Asp Arg Gln Gly

580 585 590aaa gcg ata aag gat ggt aac aaa cca gcc ggt gtg ttt gcg att gga 1824Lys Ala Ile Lys Asp Gly Asn Lys Pro Ala Gly Val Phe Ala Ile Gly

595 600 605gca ggg cat gtg aat ccg caa aag gcg ata aac ccg gga ttg gtt tac 1872Ala Gly His Val Asn Pro Gln Lys Ala Ile Asn Pro Gly Leu Val Tyr

610 615 620aac att caa cca gtg gat tac ata act tac ctc tgc act ctt gga ttc 1920Asn Ile Gln Pro Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Leu Cys Thr Leu Gly Phe625 630 635 640aca aga tca gat att tta gca atc act cat aag aac gtg agc tgc aat 1968Thr Arg Ser Asp Ile Leu Ala Ile Thr His Lys Asn Val Ser Cys Asn

645 650 655gga ata ttg cgg aaa aac ccg ggt ttt agt ctc aat tac ccg tcg ata 2016Gly Ile Leu Arg Lys Asn Pro Gly Phe Ser Leu Asn Tyr Pro Ser Ile

660 665 670gcc gtg att ttc aaa cgt ggc aag act acg gag atg atc aca agg cgt 2064Ala Val Ile Phe Lys Arg Gly Lys Thr Thr Glu Met Ile Thr Arg Arg

675 680 685gtc act aac gtt ggg agt cct aac tcg ata tac tca gtg aat gtc aag 2112Val Thr Asn Val Gly Ser Pro Asn Ser Ile Tyr Ser Val Asn Val Lys

690 695 700gct cca gag ggg atc aaa gtt att gtc aat cct aag aga ctt gtg ttc 2160Ala Pro Glu Gly Ile Lys Val Ile Val Asn Pro Lys Arg Leu Val Phe705 710 715 720aaa cac gtg gat cag acg ctg agc tat aga gta tgg ttt gta ttg aag 2208Lys His Val Asp Gln Thr Leu Ser Tyr Arg Val Trp Phe Val Leu Lys

725 730 735aag aaa aac aga gga ggg aag gtg gct agc ttt gca caa ggg cag ttg 2256Lys Lys Asn Arg Gly Gly Lys Val Ala Ser Phe Ala Gln Gly Gln Leu

740 745 750act tgg gtc aac tct cat aat ctg atg cag cga gtt aga agt cca atc 2304Thr Trp Val Asn Ser His Asn Leu Met Gln Arg Val Arg Ser Pro Ile

755 760 765tct gta acc ttg aag act aac tga 2328Ser Val Thr Leu Lys Thr Asn

770 775<210>2<211>775<212>PRT<213>拟南芥<400>2Met Glu Pro Lys Pro Phe Phe Leu Cys lle Ile Phe Leu Leu Phe Cys1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Glu Ile Leu Gln Lys Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu

20 25 30His Pro Asn Ser Glu Thr Ala Lys Thr Phe Ala Ser Lys Phe Asp Trp

35 40 45His Leu Ser Phe Leu Gln Glu Ala Val Leu Gly Val Glu Glu Glu Glu

50 55 60Glu Glu Pro Ser Ser Arg Leu Leu Tyr Ser Tyr Gly Ser Ala Ile Glu65 70 75 80Gly Phe Ala Ala Gln Leu Thr Glu Ser Glu Ala Glu Ile Leu Arg Tyr

85 90 95Ser Pro Glu Val Val Ala Val Arg Pro Asp His Val Leu Gln Val Gln

100 105 110Thr Thr Tyr Ser Tyr Lys Phe Leu Gly Leu Asp Gly Phe Gly Asn Ser

115 120 125Gly Val Trp Ser Lys Ser Arg Phe Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val

130 135 140Leu Asp Thr Gly Val Trp Pro Glu Ser Pro Ser Phe Asp Asp Thr Gly145 150 155 160Met Pro Ser Ile Pro Arg Lys Trp Lys Gly Ile Cys Gln Glu Gly Glu

165 170 175Ser Phe Ser Ser Ser Ser Cys Asn Arg Lys Leu Ile Gly Ala Arg Phe

180 185 190Phe Ile Arg Gly His Arg Val Ala Asn Ser Pro Glu Glu Ser Pro Asn

195 200 205Met Pro Arg Glu Tyr Ile Ser Ala Arg Asp Ser Thr Gly His Gly Thr

210 215 220His Thr Ala Ser Thr Val Gly Gly Ser Ser Val Ser Met Ala Asn Val225 230 235 240Leu Gly Asn Gly Ala Gly Val Ala Arg Gly Met Ala Pro Gly Ala His

245 250 255Ile Ala Val Tyr Lys Val Cys Trp Phe Asn Gly Cys Tyr Ser Ser Asp

260 265 270Ile Leu Ala Ala Ile Asp Val Ala Ile Gln Asp Lys Val Asp Val Leu

275 280 285Ser Leu Ser Leu Gly Gly Phe Pro Ile Pro Leu Tyr Asp Asp Thr Ile

290 295 300Ala Ile Gly Thr Phe Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile Ser Val lle Cys305 310 315 320Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Glu Ser Ser Val Ala Asn Thr Ala

325 330 335Pro Trp Val Ser Thr Ile Gly Ala Gly Thr Leu Asp Arg Arg Phe Pro

340 345 350Ala Val Val Arg Leu Ala Asn Gly Lys Leu Leu Tyr Gly Glu Ser Leu

355 360 365Tyr Pro Gly Lys Gly Ile Lys Asn Ala Gly Arg Glu Val Glu Val Ile

370 375 380Tyr Val ThrGly Gly Asp Lys Gly Ser Glu Phe Cys Leu Arg Gly Ser385 390 395 400Leu Pro Arg Glu Glu Ile Arg Gly Lys Met Val Ile Cys Asp Arg Gly

405 410 415Val Asn Gly Arg Ser Glu Lys Gly Glu Ala Val Lys Glu Ala Gly Gly

420 425 430Val Ala Met Ile Leu Ala Asn Thr Glu Ile Asn Gln Glu Glu Asp Ser

435 440 445Ile Asp Val His Leu Leu Pro Ala Thr Leu Ile Gly Tyr Thr Glu Ser

450 455 460Val Leu Leu Lys Ala Tyr Val Asn Ala Thr Val Lys Pro Lys Ala Arg465 470 475 480Ile Ile Phe Gly Gly Thr Val Ile Gly Arg Ser Arg Ala Pro Glu Val

485 490 495Ala Gln Phe Ser Ala Arg Gly Pro Ser Leu Ala Asn Pro Ser Ile Leu

500 505 510Lys Pro Asp Met Ile Ala Pro Gly Val Asn Ile Ile Ala Ala Trp Pro

515 520 525Gln Asn Leu Gly Pro Thr Gly Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Arg Val Asn

530 535 540Phe Thr Val Met Ser Gly Thr Ser Met Ser Cys Pro His Val Ser Gly545 550 555 560Ile Thr Ala Leu Ile Arg Ser Ala Tyr Pro Asn Trp Ser Pro Ala Ala

565 570 575Ile Lys Ser Ala Leu Met Thr Thr Ala Asp Leu Tyr Asp Arg Gln Gly

580 585 590Lys Ala Ile Lys Asp Gly Asn Lys Pro Ala Gly Val Phe Ala Ile Gly

595 600 605Ala Gly His Val Asn Pro Gln Lys Ala Ile Asn Pro Gly Leu Val Tyr

610 615 620Asn Ile Gln Pro Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Leu Cys Thr Leu Gly Phe625 630 635 640Thr Arg Ser Asp Ile Leu Ala Ile Thr His Lys Asn Val Ser Cys Asn

645 650 655Gly Ile Leu Arg Lys Asn Pro Gly Phe Ser Leu Asn Tyr Pro Ser Ile

660 665 670Ala Val Ile Phe Lys Arg Gly Lys Thr Thr Glu Met Ile Thr Arg Arg

675 680 685Val Thr Asn Val Gly Ser Pro Asn Ser Ile Tyr Ser Val Asn Val Lys

690 695 700Ala Pro Glu Gly Ile Lys Val Ile Val Asn Pro Lys Arg Leu Val Phe705 710 715 720Lys His Val Asp Gln Thr Leu Ser Tyr Arg Val Trp Phe Val Leu Lys

725 730 735Lys Lys Asn Arg Gly Gly Lys Val Ala Ser Phe Ala Gln Gly Gln Leu

740 745 750Thr Trp Val Asn Ser His Asn Leu Met Gln Arg Val Arg Ser Pro Ile

755 760 765Ser Val Thr Leu Lys Thr Asn

770 775<210>3<21l>2328<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(1)..(1473)<400>3atg gaa ccc aaa cct ttc ttt ctc tgc att atc ttt ctt cta ttt tgt 48Met Glu Pro Lys Pro Phe Phe Leu Cys Ile Ile Phe Leu Leu Phe Cys1 5 10 15tct tct tcg tca gag atc ctg cag aag cag act tac att gtt cag ctt 96Ser Ser Ser Ser Glu Ile Leu Gln Lys Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu

450 455 460gtc ctt ctg aag gct tat gtt aat gcc acg gtg aaa cca aag gcg cgg 1440Val Leu Leu Lys Ala Tyr Val Asn Ala Thr Val Lys Pro Lys Ala Arg465 470 475 480ata att ttt ggt ggt acg gtg att ggg agg tca tgagcaccgg aggtggctca 1493Ile Ile Phe Gly Gly Thr Val Ile Gly Arg Ser

485 490gttttcagct cgaggaccga gtttagccaa tccttcgata ctaaaaccgg atatgattgc 1553tccgggagtc aatatcattg cggcttggcc tcaaaatcta ggaccaaccg gacttcctta 1613tgattcaaga agagttaact tcactgtaat gtcaggaact tcaatgtctt gtccacatgt 1673tagcggaatc actgctctta tccggtctgc atacccgaac tggtctccag ctgcaatcaa 1733atccgcattg atgacaacag cggatttgta cgatcgtcaa gggaaagcga taaaggatgg 1793taacaaacca gccggtgtgt ttgcgattgg agcagggcat gtgaatccgc aaaaggcgat 1853aaacccggga ttggtttaca acattcaacc agtggattac ataacttacc tctgcactct 1913tggattcaca agatcagata ttttagcaat cactcataag aacgtgagct gcaatggaat 1973attgcggaaa aacccgggtt ttagtctcaa ttacccgtcg atagccgtga ttttcaaacg 2033tggcaagact acggagatga tcacaaggcg tgtcactaac gttgggagtc ctaactcgat 2093atactcagtg aatgtcaagg ctccagaggg gatcaaagtt attgtcaatc ctaagagact 2153tgtgttcaaa cacgtggatc agacgctgag ctatagagta tggtttgtat tgaagaagaa 2213aaacagagga gggaaggtgg ctagctttgc acaagggcag ttgacttggg tcaactctca 2273taatctgatg cagcgagtta gaagtccaat ctctgtaacc ttgaagacta actga 2328<210>4<211>491<212>PRT<213>拟南芥<400>4Met Glu Pro Lys Pro Phe Phe Leu Cys Ile Ile Phe Leu Leu Phe Cys1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Glu Ile Leu Gln Lys Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu

20 25 30His Pro Asn Ser Glu Thr Ala Lys Thr Phe Ala Ser Lys Phe Asp Trp

35 40 45His Leu Ser Phe Leu Gln Glu Ala Val Leu Gly Val Glu Glu Glu Glu

85 90 95Ser Pro Glu Val Val Ala Val Arg Pro Asp His Val Leu Gln Val Gln

100 105 110Thr Thr Tyr Ser Tyr Lys Phe Leu Gly Leu Asp Gly Phe Gly Asn Ser

115 120 125Gly Val Trp Ser Lys Ser Arg Phe Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val

165 170 175Ser Phe Ser Ser Ser Ser Cys Asn Arg Lys Leu Ile Gly Ala Arg Phe

180 185 190Phe Ile Arg Gly His Arg Val Ala Asn Ser Pro Glu Glu Ser Pro Asn

195 200 205Met Pro Arg Glu Tyr Ile Ser Ala Arg Asp Ser Thr Gly His Gly Thr

245 250 255Ile Ala Val Tyr Lys Val Cys Trp Phe Asn Gly Cys Tyr Ser Ser Asp

260 265 270Ile Leu Ala Ala Ile Asp Val Ala Ile Gln Asp Lys Val Asp Val Leu

275 280 285Ser Leu Ser Leu Gly Gly Phe Pro Ile Pro Leu Tyr Asp Asp Thr Ile

290 295 300Ala Ile Gly Thr Phe Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile Ser Val Ile Cys305 310 315 320Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Glu Ser Ser Val Ala Asn Thr Ala

325 330 335Pro Trp Val Ser Thr Ile Gly Ala Gly Thr Leu Asp Arg Arg Phe Pro

340 345 350Ala Val Val Arg Leu Ala Asn Gly Lys Leu Leu Tyr Gly Glu Ser Leu

355 360 365Tyr Pro Gly Lys Gly Ile Lys Asn Ala Gly Arg Glu Val Glu Val Ile

370 375 380Tyr Val Thr Gly Gly Asp Lys Gly Ser Glu Phe Cys Leu Arg Gly Ser385 390 395 400Leu Pro Arg Glu Glu Ile Arg Gly Lys Met Val Ile Cys Asp Arg Gly

405 410 415Val Asn Gly Arg Ser Glu Lys Gly Glu Ala Val Lys Glu Ala Gly Gly

420 425 430Val Ala Met Ile Leu Ala Asn Thr Glu Ile Asn Gln Glu Glu Asp Ser

435 440 445Ile Asp Val His Leu Leu Pro Ala Thr Leu Ile Gly Tyr Thr Glu Ser

450 455 460Val Leu Leu Lys Ala Tyr Val Asn Ala Thr Val Lys Pro Lys Ala Arg465 470 475 480Ile Ile Phe Gly Gly Thr Val Ile Gly Arg Ser

485 490<210>5<211>1970<212>DNA<213>拟南芥<400>5gtcgactttg attcaagctt tgtttcgatt gattgagcca actgctggaa aaattactat 60tgacaacatt gacatttctc aaattggtct tcatgatctt cgtagtcgcc ttgggattat 120acctcaagat cctacattat ttgaaggaac aatccgagca aatcttgacc cacttgaaga 180acattcagat gataaaatct gggaggtatc tataaatatg ttgtttgata ctcttatctt 240gtttatgttt tagacactaa actctgagat ttggagtttg attctagaga tttacccaac 300tttgctgaca ggcgcttgat aaatcccagc ttggagacgt tgttagagga aaagacctaa 360aacttgactc tccaggtaac tatttacatc aaaagtcctc tctttttccc gggtcttttt 420cgcttctttc tactgatttt tttggctcaa aaccgagtag tactggaaaa tggagataac 480tggagtgtag ggcagagaca gcttgtgtca cttggacgag cattactgaa acaagccaaa 540atacttgttc ttgatgaagc aacagcatcg gttgacacag caacagacaa tctgatccag 600aagataatca gaacagagtt tgaagactgc acggtctgca ccattgctca ccggatacca 660actgttatag acagtgacct agttttggtt ctcagcgacg gttagtctca tacaaattaa 720aaacatggat ctttcttcat attactcgtc gtcttttggg agaattcaat gtttatgttt 780atggtttgtt gcaggtagag tagcagagtt tgatactcct gcacggctat tagaagacaa 840atcatcgatg ttcttgaaat tggtaacaga atactcctca agatctactg gaatccctga 900attatgatcc tccatgttaa aaattcagtt tagggggttt cttttctcaa gaggatataa 960aagaactgat atgtgacaaa agcttaaggt ctaaagtaag agagagtttt ccacagggtt 1020taagaaaaga aaaagcatga aaggatgcca aaatctccgc gcttaaaaaa ctttgggttt 1080aaatctcttc tgtcgaacat tgggagaaac tttttttgta tggaacagtt agtttctttg 1140gttttcatgt ttatcaataa actgcaaaaa caaacaaaga ttagagtaga aactactaat 1200cattcgtcat catccctcaa gtgtgatctg tattgggctt attataagtg taatcagtac 1260tgggcttata agttgtacag agcccaatat aacaatatct gtacgacgtc gttttgttgt 1320gacgtagtac ccgatgacaa aacgaggcgt gttgagcgtg cgtgtataaa tgcacgtagt 1380gaacgaacac taaccacgct gctgcattta attcctttct caacggtcgt attttcctat 1440tcaaggcttt aactaagttt aatagtatgt ttttaaaaaa atacatatat ttggccaatg 1500gttgattatt aagttattgt taaatgaatt ttctttggct tggtaaaact tcaatggaaa 1560ccaaataaat ttcaaaatct tttgttgctg aaaaaggcta cacaaactac tatacgcaat 1620aaaacctaac cataacatct cgtgaacaag gaaaaaaaaa ggaaaaacag agacacagag 1680acaaggcaga caaaaaagcc ttacaagtga aaaaccttaa acagcttcag ttaatatagt 1740tcatgtctta gaaaaaaata aaagagaaga agctcctacc tctgcaacat acaaaggata 1800ctcgtgaggc agagctctta ctcttcacga gcttcatcat cttcttcctt agactccaaa 1860tcccaggttt tgaattctct tcattcttct ttaaataccc tattcttctt cttctctaaa 1920accatgcact tcaactacac taaaccaact ccttttttta actctctcca 1970<210>6<211>1140<212>DNA<213>拟南芥<400>6aaatcatcga tgttcttgaa attggtaaca gaatactcct caagatctac tggaatccct 60gaattatgat cctccatgtt aaaaattcag tttagggggt ttcttttctc aagaggatat 120aaaagaactg atatgtgaca aaagcttaag gtctaaagta agagagagtt ttccacaggg 180tttaagaaaa gaaaaagcat gaaaggatgc caaaatctcc gcgcttaaaa aactttgggt 240ttaaatctct tctgtcgaac attgggagaa actttttttg tatggaacag ttagtttctt 300tggttttcat gtttatcaat aaactgcaaa aacaaacaaa gattagagta gaaactacta 360atcattcgtc atcatccctc aagtgtgatc tgtattgggc ttattataag tgtaatcagt 420actgggctta taagttgtac agagcccaat ataacaatat ctgtacgacg tcgttttgtt 480gtgacgtagt acccgatgac aaaacgaggc gtgttgagcg tgcgtgtata aatgcacgta 540gtgaacgaac actaaccacg ctgctgcatt taattccttt ctcaacggtc gtattttcct 600attcaaggct ttaactaagt ttaatagtat gtttttaaaa aaatacatat atttggccaa 660tggttgatta ttaagttatt gttaaatgaa ttttctttgg cttggtaaaa cttcaatgga 720aaccaaataa atttcaaaat cttttgttgc tgaaaaaggc tacacaaact actatacgca 780ataaaaccta accataacat ctcgtgaaca aggaaaaaaa aaggaaaaac agagacacag 840agacaaggca gacaaaaaag ccttacaagt gaaaaacctt aaacagcttc agttaatata 900gttcatgtct tagaaaaaaa taaaagagaa gaagctccta cctctgcaac atacaaagga 960tactcgtgag gcagagctct tactcttcac gagcttcatc atcttcttcc ttagactcca 1020aatcccaggt tttgaattct cttcattctt ctttaaatac cctattcttc ttcttctcta 1080aaaccatgca cttcaactac actaaaccaa ctcctttttt taactctctc caatggaacc 1140<210>7<21l>3865<212>DNA<213>马铃薯<220><221>外显子<222>(3)..(551)<220><22l>内含子<222>(552)..(966)<220><221>外显子<222>(967)..(1653)<220><221>内含子<222>(1655)..(1737)<220><221>外显子<222>(1738)..(2220)<220><221>内含子<222>(2223)..(2485)<220><221>外显子<222>(2486)..(3250)<220><22l>CDS<222>(3)..(551)<220><221>CDS<222>(967)..(1653)<220><221>CDS<222>(1737)..(2222)<220><221>CDS<222>(2486).. (3253)<400>7ga att ctg ttc aac ccc ttt aaa tac ccc cat caa att ata tca aca 47Ile Leu Phe Asn Pro Phe Lys Tyr Pro His G1n Ile Ile Ser Thr

1 5 10 15aac att cca tta ttc aac ttc aaa tat aat tca atg gaa ctc aat ttc 95Asn Ile Pro Leu Phe Asn Phe Lys Tyr Asn Ser Met Glu Leu Asn Phe

20 25 30caa ttc tat ttt ctc tgt ttt cta ctc tgt ttt att ccc ctg cta caa 143Gln Phe Tyr Phe Leu Cys Phe Leu Leu Cys Phe Ile Pro Leu Leu Gln

35 40 45gct caa aat ttg caa act tat ata gta caa tta cat cca caa cat gca 191Ala Gln Asn Leu Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu His Pro Gln His Ala

50 55 60tca aca aga acc cct ttt agt tct aaa ttt cag tgg cac ctt tca ttt 239Ser Thr Arg Thr Pro Phe Ser Ser Lys Phe Gln Trp His Leu Ser Phe

65 70 75ctt gaa aat ttc aca aac att cca tta ttc aac ttc aaa tat att caa 287Leu Glu Asn Phe Thr Asn Ile Pro Leu Phe Asn Phe Lys Tyr Ile Gln80 85 90 95tgg aac tca att cca att cta ttt ctc tgt ttc tac tct gtt tat tcc 335Trp Asn Ser Ile Pro Ile Leu Phe Leu Cys Phe Tyr Ser Val Tyr Ser

100 105 110cct gct aca agc att tcc tca ggt gaa aac tcg agt tct cgc ctt ttg 383Pro Ala Thr Ser Ile Ser Ser Gly Glu Asn Ser Ser Ser Arg Leu Leu

115 120 125tac tct tac cat tct gca ttt gaa ggt ttt gca gca ctt cta tct gaa 431Tyr Ser Tyr His Ser Ala Phe Glu Gly Phe Ala Ala Leu Leu Ser Glu

130 135 140aat gag cta aag gca ctg aag aaa tcg aat aat gtg tta tca ata tat 479Asn Glu Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ser Asn Asn Val Leu Ser Ile Tyr

145 150 155ccg gag agg aag ctt gag gtt caa aca act tat tct tac aag ttc tta 527Pro Glu Arg Lys Leu Glu Val Gln Thr Thr Tyr Ser Tyr Lys Phe Leu160 165 170 175gga ctt agt cct aca aag gaa ggt atgttacata gtttgtaata tatataaagt 581Gly Leu Ser Pro Thr Lys Glu Gly

180tgaggaaaca atgagtcata aggctttatt tattaaatga ctagtctgga ctagagtgtc 641acacgtagga tttaaacttg tgaattaagg aaaattctta aacccccttt acaactgctc 701tggagtcatt tcttatgtca atgtgattca acagttcata tataacaaaa aggatttgtc 761tttaccttgt tttcgaagta aaaatatttc aacgaagggg attcaaccga accccattgg 821ttcccttcaa ctctgctaat agatattttc tatgtatttc atttaagact tgaattttta 881agctttaaat tttctatgtt ccctcggagc ctttcntctn acttactttt atactgtctt 941tgtatctttt tttttctaat aaggt act tgg tta aag tct gga ttt ggt cga 993

Thr Trp Leu Lys Ser Gly Phe Gly Arg

185 190ggc gcg atc att gga gtt ctt gat act gga att tgg cca gaa agt cca 1041Gly Ala Ile Ile GIy Val Leu Asp Thr Gly Ile Trp Pro Glu Ser Pro

195 200 205agt ttt gtt gat cat gga atg tct cct att cca aag aaa tgg aaa ggt 1089Ser Phe Val Asp His Gly Met Ser Pro Ile Pro Lys Lys Trp Lys Gly

210 215 220ntc tgc caa gaa gga aaa aac ttc aat tct tca agt tgc aat cgc aag 1137Xaa Cys Gln Glu Gly Lys Asn Phe Asn Ser Ser Ser Cys Asn Arg Lys225 230 235 240ctt att ggt gca agg ttt ttc cag ata gga cac atg atg gca tca aag 1185Leu Ile Gly Ala Arg Phe Phe Gln Ile Gly His Met Met Ala Ser Lys

245 250 255aca tca aaa tca ata gat ttt atg gag gat tat gta tca cct cga gat 1233Thr Ser Lys Ser Ile Asp Phe Met Glu Asp Tyr Val Ser Pro Arg Asp

260 265 270tct caa ggc cat ggt aca cat aca gca tct act gca ggg gga gct ccc 1281Ser Gln Gly His Gly Thr His Thr Ala Ser Thr Ala Gly Gly Ala Pro

275 280 285gtt cca atg gcg agt gtg ctt gga aat gga gca gga gag gct cga ggg 1329Val Pro Met Ala Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Gly Glu Ala Arg Gly

290 295 300atg gcc cct ggt gct cat atc gcg ata tac aaa gtt tgt tgg tct agt 1377Met Ala Pro Gly Ala His Ile Ala Ile Tyr Lys Val Cys Trp Ser Ser305 310 315 320ggt tgt tat agt tct gat ata ctt gca gca atg gat gta gct att aga 1425Gly Cys Tyr Ser Ser Asp Ile Leu Ala Ala Met Asp Val Ala Ile Arg

325 330 335gat gga gta gac ata ttg tct ctt tca att ggt ggt ttc cct gtt cca 1473Asp Gly Val Asp Ile Leu Ser Leu Ser Ile Gly Gly Phe Pro Val Pro

340 345 350ctt tat gag gat act att gct att ggc agt ttt cga gct atg gaa cgt 1521Leu Tyr Glu Asp Thr Ile Ala Ile Gly Ser Phe Arg Ala Met Glu Arg

355 360 365gga att tca gtt ata tgt gct gca gga aat aat ggt cca att cta agt 1569Gly Ile Ser Val Ile Cys Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Leu Ser

370 375 380tca gta gca aat gag gct cct tgg att gcc act att ggt gct agc aca 1617Ser Val Ala Asn Glu Ala Pro Trp Ile Ala Thr Ile Gly Ala Ser Thr385 390 395 400ctt gac agg aaa ttt cca gca ata att cag cta ggt atgtcacatt 1663Leu Asp Arg Lys Phe Pro Ala Ile Ile Gln Leu Gly

405 410ttgtttctta aaatgatatt tcgcgtgttt ccagcctaaa ttatgtgtcc ctcattcata 1723ttttccaaca ggt aat ggc aag tat gtg tat gga gaa tcc ttg tac ccg 1772

Asn Gly Lys Tyr Val Tyr Gly Glu Ser Leu Tyr Pro

415 420ggc aaa caa gtt cat aat tct cag aaa gtt ctt gag att gtt tat ctc 1820Gly Lys Gln Val His Asn Ser Gln Lys Val Leu Glu Ile Val Tyr Leu425 430 435 440aat gac ggt gat aat gga agt gaa ttt tgc tta aga ggg tct ctg cca 1868Asn Asp Gly Asp Asn Gly Ser Glu Phe Cys Leu Arg Gly Ser Leu Pro

445 450 455aga gct aaa gtc cat gga aaa atc gtt gta tgt gat cgt gga gtt aat 1916Arg Ala Lys Val His Gly Lys Ile Val Val Cys Asp Arg Gly Val Asn

460 465 470gga aga gca gag aaa ggt caa gtt gtt aaa gaa tca ggt ggt gtt gcc 1964Gly Arg Ala Glu Lys Gly Gln Val Val Lys Glu Ser Gly Gly Val Ala

475 480 485atg atc cta gca aat aca gca gta aat atg gag gaa gat tct gtg gac 2012Met Ile Leu Ala Asn Thr Ala Val Asn Met Glu Glu Asp Ser Val Asp

490 495 500gta cat gtc cta cct gca aca ttg att ggt ttt gac gaa tca att cag 2060Val His Val Leu Pro Ala Thr Leu Ile Gly Phe Asp Glu Ser Ile Gln505 510 515 520ttg caa agc tat atg aac tca acg cga aaa cca aca gct cga atc ata 2108Leu Gln Ser Tyr Met Asn Ser Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Ile Ile

525 530 535ttt gga gga aca gtt ata gga aaa tct agt gca cct gct gta gca caa 2156Phe Gly Gly Thr Val Ile Gly Lys Ser Ser Ala Pro Ala Val Ala Gln

540 545 550ttt tct tca agg ggt cca agt ttt act gat cct tca att ctc aaa cct 2204Phe Ser Ser Arg Gly Pro Ser Phe Thr Asp Pro Ser Ile Leu Lys Pro

555 560 565gat gtg att gct cca ggt cagtttttat tgaacccaca attatttatt 2252Asp Val Ile Ala Pro Gly

570tagatcatag atagcaatgt gaccaacagg ttagggattc gagccgtgga atctatcatt 2312gatgcttgaa tcagggtaga ctgcttacat cacacccttc accagaccat gcatgaaaac 2372gggatgctct ttttatatgc atgtgaaaaa aactttaata aatagtgtaa tgttatgttt 2432tgaacctata tcttcgtata actcagaatc ttgaatccgc ctctgctcca ggt gtc 2488

Val

575aac ata att gct gct tgg ccg caa aat cta ggt cct agt ggc ctg gct 2536Asn Ile Ile Ala Ala Trp Pro Gln Asn Leu Gly Pro Ser Gly Leu Ala

580 585 590gag gat tca aga aga gta aac ttc act gtc tta tca gga act tca atg 2584Glu Asp Ser Arg Arg Val Asn Phe Thr Val Leu Ser Gly Thr Ser Met

595 600 605gct tgt cct cat gtt agt ggc att gct gca cta ctc cat tca att cat 2632Ala Cys Pro His Val Ser Gly Ile Ala Ala Leu Leu His Ser Ile His

610 615 620cct aaa tgg tca cca gct gca atc aaa tcc gcg cta atg aca act gca 2680Pro Lys Trp Ser Pro Ala Ala Ile Lys Ser Ala Leu Met Thr Thr Ala

625 630 635gac aca aca aac cac caa gga aaa cca atc atg gat ggt gac aca cga 2728Asp Thr Thr Asn His Gln Gly Lys Pro Ile Met Asp Gly Asp Thr Arg640 645 650 655gct gga ctt ttc gcc ata gga gct gga cat gta aat cct gga aga tcc 2776Ala Gly Leu Phe Ala Ile Gly Ala Gly His Val Asn Pro Gly Arg Ser

660 665 670gat gat ccc gga ttg ata tat gac att aat gca aat gac tat atc act 2824Asp Asp Pro Gly Leu Ile Tyr Asp Ile Asn Ala Asn Asp Tyr Ile Thr

675 680 685cac ctt tgc act att ggt tac aaa aac tct gaa atc ctc agc att act 2872His Leu Cys Thr Ile Gly Tyr Lys Asn Ser Glu Ile Leu Ser Ile Thr

690 695 700cac aag aat gtt agc tgc cac gac gtt tta cag aaa aac agg ggt ttt 2920His Lys Asn Val Ser Cys His Asp Val Leu Gln Lys Asn Arg Gly Phe

705 710 715agt ctc aat tac ccc tct att tcc gta atc ttt aag gca gga aaa acg 2968Ser Leu Asn Tyr Pro Ser Ile Ser Val Ile Phe Lys Ala Gly Lys Thr720 725 730 735aga aaa atg atc aca agg aga gtg aca aat gtg ggg agt cct aat tca 3016Arg Lys Met Ile Thr Arg Arg Val Thr Asn Val Gly Ser Pro Asn Ser

740 745 750atc tac tca gtt gaa att gtg gca cca gaa gga gtt aaa gtg aga gtt 3064Ile Tyr Ser Val Glu Ile Val Ala Pro Glu Gly Val Lys Val Arg Val

755 760 765aaa ccg cga cgt ctg gta ttt aaa cat gtt aat caa agt tta agt tac 3112Lys Pro Arg Arg Leu Val Phe Lys His Val Asn Gln Ser Leu Ser Tyr

770 775 780aga gtt tgg ttt ata tca agg aag aga att ggg act caa agg aga agc 3160Arg Val Trp Phe Ile Ser Arg Lys Arg Ile Gly Thr Gln Arg Arg Ser

785 790 795ttt gca gaa gga caa ttg atg tgg atc aac tcc aga gat aaa tac cag 3208Phe Ala Glu Gly Gln Leu Met Trp Ile Asn Ser Arg Asp Lys Tyr Gln800 805 810 815aaa gtt aga agt cct att tca gtt gca tgg gca tca aag aag tga 3253Lys Val Arg Ser Pro Ile Ser Val Ala Trp Ala Ser Lys Lys

820 825 830aggctgtgcc tattttcacg tacacggaaa ataggcaggt tacgtgctat aacatatact 3313actgatagtg taaaaattct ttatactatc agcgtagaca gtacgtaagt ngaatctatt 3373gttgtagcac caaagtttca ttgttccgaa catttaatta ggattctatt actatattgt 3433atcagcacca aaagtttcat cgtcttagtt ccaaaaattt gattaagctt ttaagttgca 3493ttgtcttagt tccaaatatg ttactataac ttgctgataa aaacgtaaat aattatcaaa 3553tagggtattg aacattcaaa gaatttagga taaccaaata aacaataaaa aaatgaaaac 3613acaaaattgt tcctatttag taattttaca aatgtcaatt gttttgagaa ctcatcgatt 3673ttgcaataaa tttatagaag aacttgtcta ttttagtaaa atatagatca gaatttcctt 3733gcttgttcaa gtttcattct tttcatttta ttttatttta aaaaaagacc caaagtttgc 3793ctcataaaag aattttctct tatcatataa gagggagtta gtgctgactt tcctcttatc 3853atatccgtcg ac 3865<210>8<211>829<212>PRT<213>马铃薯<400>8Ile Leu Phe Asn Pro Phe Lys Tyr Pro His Gln Ile Ile Ser Thr Asn1 5 10 15Ile Pro Leu Phe Asn Phe Lys Tyr Asn Ser Met Glu Leu Asn Phe Gln

20 25 30Phe Tyr Phe Leu Cys Phe Leu Leu Cys Phe Ile Pro Leu Leu Gln Ala

35 40 45Gln Asn Leu Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu His Pro Gln His Ala Ser

50 55 60Thr Arg Thr Pro Phe Ser Ser Lys Phe Gln Trp His Leu Ser Phe Leu65 70 75 80Glu Asn Phe Thr Asn Ile Pro Leu Phe Asn Phe Lys Tyr Ile Gln Trp

85 90 95Asn Ser Ile Pro Ile Leu Phe Leu Cys Phe Tyr Ser Val Tyr Ser Pro

100 105 110Ala Thr Ser Ile Ser Ser Gly Glu Asn Ser Ser Ser Arg Leu Leu Tyr

115 120 125Ser Tyr His Ser Ala Phe Glu Gly Phe Ala Ala Leu Leu Ser Glu Asn

130 135 140Glu Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ser Asn Asn Val Leu Ser Ile Tyr Pro145 150 155 160Glu Arg Lys Leu Glu Val Gln Thr Thr Tyr Ser Tyr Lys Phe Leu Gly

165 170 175Leu Ser Pro Thr Lys Glu Gly Thr Trp Leu Lys Ser Gly Phe Gly Arg

180 185 190Gly Ala Ile Ile Gly Val Leu Asp Thr Gly Ile Trp Pro Glu Ser Pro

195 200 205Ser Phe Val Asp His Gly Met Ser Pro Ile Pro Lys Lys Trp Lys Gly

210 215 220Xaa Cys Gln Glu Gly Lys Asn Phe Asn Ser Ser Ser Cys Asn Arg Lys225 230 235 240Leu Ile Gly Ala Arg Phe Phe Gln Ile Gly His Met Met Ala Ser Lys

245 250 255Thr Ser Lys Ser Ile Asp Phe Met Glu Asp Tyr Val Ser Pro Arg Asp

260 265 270Ser Gln Gly His Gly Thr His Thr Ala Ser Thr Ala Gly Gly Ala Pro

275 280 285Val Pro Met Ala Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Gly Glu Ala Arg Gly

290 295 300Met Ala Pro Gly Ala His Ile Ala Ile Tyr Lys Val Cys Trp Ser Ser305 310 315 320Gly Cys Tyr Ser Ser Asp Ile Leu Ala Ala Met Asp Val Ala Ile Arg

325 330 335Asp Gly Val Asp Ile Leu Ser Leu Ser Ile Gly Gly Phe Pro Val Pro

340 345 350Leu Tyr Glu Asp Thr Ile Ala Ile Gly Ser Phe Arg Ala Met Glu Arg

355 360 365Gly Ile Ser Val Ile Cys Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Leu Ser

370 375 380Ser Val Ala Asn Glu Ala Pro Trp Ile Ala Thr Ile Gly Ala Ser Thr385 390 395 400Leu Asp Arg Lys Phe Pro Ala Ile Ile Gln Leu Gly Asn Gly Lys Tyr

405 410 415Val Tyr Gly Glu Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Gln Val His Asn Ser Gln

420 425 430Lys Val Leu Glu Ile Val Tyr Leu Asn Asp Gly Asp Asn Gly Ser Glu

435 440 445Phe Cys Leu Arg Gly Ser Leu Pro Arg Ala Lys Val His Gly Lys Ile

450 455 460Val Val Cys Asp Arg Gly Val Asn Gly Arg Ala Glu Lys Gly Gln Val465 470 475 480Val Lys Glu Ser Gly Gly Val Ala Met Ile Leu Ala Asn Thr Ala Val

485 490 495Asn Met Glu Glu Asp Ser Val Asp Val His Val Leu Pro Ala Thr Leu

500 505 510Ile Gly Phe Asp Glu Ser Ile Gln Leu Gln Ser Tyr Met Asn Ser Thr

515 520 525Arg Lys Pro Thr Ala Arg Ile Ile Phe Gly Gly Thr Val Ile Gly Lys

530 535 540Ser Ser Ala Pro Ala Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Ser Phe545 550 555 560Thr Asp Pro Ser Ile Leu Lys Pro Asp Val Ile Ala Pro Gly Val Asn

565 570 575Ile Ile Ala Ala Trp Pro Gln Asn Leu Gly Pro Ser Gly Leu Ala Glu

580 585 590Asp Ser Arg Arg Val Asn Phe Thr Val Leu Ser Gly Thr Ser Mer Ala

595 600 605Cys Pro His Val Ser Gly Ile Ala Ala Leu Leu His Ser Ile His Pro

610 615 620Lys Trp Ser Pro Ala Ala Ile Lys Ser Ala Leu Met Thr Thr Ala Asp625 630 635 640Thr Thr Asn His Gln Gly Lys Pro Ile Met Asp Gly Asp Thr Arg Ala

645 650 655Gly Leu Phe Ala Ile Gly Ala Gly His Val Asn Pro Gly Arg Ser Asp

660 665 670Asp Pro Gly Leu Ile Tyr Asp Ile Asn Ala Asn Asp Tyr Ile Thr His

675 680 685Leu Cys Thr Ile Gly Tyr Lys Asn Ser Glu Ile Leu Ser Ile Thr His

690 695 700Lys Asn Val Ser Cys His Asp Val Leu Gln Lys Asn Arg Gly Phe Ser705 710 715 720Leu Asn Tyr Pro Ser Ile Ser Val Ile Phe Lys Ala Gly Lys Thr Arg

725 730 735Lys Met Ile Thr Arg Arg Val Thr Asn Val Gly Ser Pro Asn Ser Ile

740 745 750Tyr Ser Val Glu Ile Val Ala Pro Glu Gly Val Lys Val Arg Val Lys

755 760 765Pro Arg Arg Leu Val Phe Lys His Val Asn Gln Ser Leu Ser Tyr Arg

770 775 780Val Trp Phe Ile Ser Arg Lys Arg Ile Gly Thr Gln Arg Arg Ser Phe785 790 795 800Ala Glu Gly Gln Leu Met Trp Ile Asn Ser Arg Asp Lys Tyr Gln Lys

805 810 815Val Arg Ser Pro Ile Ser Val Ala Trp Ala Ser Lys Lys

820 825<210>9<211>2492<212>DNA<213>马铃薯<220><221>CDS<222>(3)..(2489)<400>9ga att ctg ttc aac ccc ttt aaa tac ccc cat caa att ata tca aca 47Ile Leu Phe Asn Pro Phe Lys Tyr Pro His Gln Ile Ile Ser Thr

145 150 155ccg gag agg aag ctt gag gtt caa aca act tat tct tac aag ttc tta 527Pro Glu Arg Lys Leu Glu Val Gln Thr Thr Tyr Ser Tyr Lys Phe Leu160 165 170 175gga ctt agt cct aca aag gaa ggt act tgg tta aag tct gga ttt ggt 575Gly Leu Ser Pro Thr Lys Glu Gly Thr Trp Leu Lys Ser Gly Phe Gly

180 185 190cga ggc gcg atc att gga gtt ctt gat act gga att tgg cca gaa agt 623Arg Gly Ala Ile Ile Gly Val Leu Asp Thr Gly Ile Trp Pro Glu Ser

195 200 205cca agt ttt gtt gat cat gga atg tct cct att cca aag aaa tgg aaa 671Pro Ser Phe Val Asp His Gly Met Ser Pro Ile Pro Lys Lys Trp Lys

210 215 220ggt ntc tgc caa gaa gga aaa aac ttc aat tct tca agt tgc aat cgc 719Gly Xaa Cys Gln Glu Gly Lys Asn Phe Asn Ser Ser Ser Cys Asn Arg

225 230 235aag ctt att ggt gca agg ttt ttc cag ata gga cac atg atg gca tca 767Lys Leu Ile Gly Ala Arg Phe Phe Gln Ile Gly His Met Met Ala Ser240 245 250 255aag aca tca aaa tca ata gat ttt atg gag gat tat gta tca cct cga 815Lys Thr Ser Lys Ser Ile Asp Phe Met Glu Asp Tyr Val Ser Pro Arg

260 265 270gat tct caa ggc cat ggt aca cat aca gca tct act gca ggg gga get 863Asp Ser Gln Gly His Gly Thr His Thr Ala Ser Thr Ala Gly Gly Ala

275 280 285ccc gtt cca atg gcg agt gtg ctt gga aat gga gca gga gag gct cga 911Pro Val Pro Met Ala Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Gly Glu Ala Arg

290 295 300ggg atg gcc cct ggt gct cat atc gcg ata tac aaa gtt tgt tgg tct 959Gly Met Ala Pro Gly Ala His Ile Ala Ile Tyr Lys Val Cys Trp Ser

305 310 315agt ggt tgt tat agt tet gat ata ctt gca gca atg gat gta gct att 1007Ser Gly Cys Tyr Ser Ser Asp Ile Leu Ala Ala Met Asp Val Ala Ile320 325 330 335aga gat gga gta gac ata ttg tct ctt tca att ggt ggt ttc cct gtt 1055Arg Asp Gly Val Asp Ile Leu Ser Leu Ser Ile Gly Gly Phe Pro Val

340 345 350cca ctt tat gag gat act att gct att ggc agt ttt cga gct atg gaa 1103Pro Leu Tyr Glu Asp Thr Ile Ala Ile Gly Ser Phe Arg Ala Met Glu

355 360 365cgt gga att tca gtt ata tgt gct gca gga aat aat ggt cca att cta 1151Arg Gly Ile Ser Val Ile Cys Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Leu

370 375 380agt tca gta gca aat gag gct cct tgg att gcc act att ggt gct agc 1199Ser Ser Val Ala Asn Glu Ala Pro Trp Ile Ala Thr Ile Gly Ala Ser

385 390 395aca ctt gac agg aaa ttt cca gca ata att cag cta ggt aat ggc aag 1247Thr Leu Asp Arg Lys Phe Pro Ala Ile Ile Gln Leu Gly Asn Gly Lys400 405 410 415tat gtg tat gga gaa tcc ttg tac ccg ggc aaa caa gtt cat aat tct 1295Tyr Val Tyr Gly Glu Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Gln Val His Asn Ser

420 425 430cag aaa gtt ctt gag att gtt tat ctc aat gac ggt gat aat gga agt 1343Gln Lys Val Leu Glu Ile Val Tyr Leu Asn Asp Gly Asp Asn Gly Ser

435 440 445gaa ttt tgc tta aga ggg tct ctg cca aga gct aaa gtc cat gga aaa 1391Glu Phe Cys Leu Arg Gly Ser Leu Pro Arg Ala Lys Val His Gly Lys

450 455 460atc gtt gta tgt gat cgt gga gtt aat gga aga gca gag aaa ggt caa 1439Ile Val Val Cys Asp Arg Gly Val Asn Gly Arg Ala Glu Lys Gly Gln

465 470 475gtt gtt aaa gaa tca ggt ggt gtt gcc atg atc cta gca aat aca gca 1487Val Val Lys Glu Ser Gly Gly Val Ala Met Ile Leu Ala Asn Thr Ala480 485 490 495gta aat atg gag gaa gat tct gtg gac gta cat gtc cta cct gca aca 1535Val Asn Met Glu Glu Asp Ser Val Asp Val His Val Leu Pro Ala Thr

500 505 510ttg att ggt ttt gac gaa tca att cag ttg caa agc tat atg aac tca 1583Leu Ile Gly Phe Asp Glu Ser Ile Gln Leu Gln Ser Tyr Met Asn Ser

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545 550 555ttt act gat cct tca att ctc aaa cct gat gtg att gct cca ggt gtc 1727Phe Thr Asp Pro Ser Ile Leu Lys Pro Asp Val Ile Ala Pro Gly Val560 565 570 575aac ata att gct gct tgg ccgcaa aat cta ggt cct agt ggc ctg gct 1775Asn Ile Ile Ala Ala Trp Pro Gln Asn Leu Gly Pro Ser Gly Leu Ala

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625 630 635gac aca aca aac cac caa gga aaa cca atc atg gat ggt gac aca cga 1967Asp Thr Thr Asn His Gln Gly Lys Pro Ile Met Asp Gly Asp Thr Arg640 645 650 655gct gga ctt ttc gcc ata gga gct gga cat gta aat cct gga aga tcc 2015Ala Gly Leu Phe Ala Ile Gly Ala Gly His Val Asn Pro Gly Arg Ser

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690 695 700cac aag aat gtt agc tgc cac gac gtt tta cag aaa aac agg ggt ttt 2159His Lys Asn Val Ser Cys His Asp Val Leu Gln Lys Asn Arg Gly Phe

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820 825<210>10<211>829<212>PRT<213>马铃薯<400>10Ile Leu Phe Asn Pro Phe Lys Tyr Pro His Gln Ile Ile Ser Thr Asn1 5 10 15Ile Pro Leu Phe Asn Phe Lys Tyr Asn Ser Met Glu Leu Asn Phe Gln

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85 90 95Asn Ser Ile Pro Ile Leu Phe Leu Cys Phe Tyr Ser Val Tyr Ser Pro

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115 120 125Ser Tyr His Ser Ala Phe Glu Gly Phe Ala Ala Leu Leu Ser Glu Asn

165 170 175Leu Ser Pro Thr Lys Glu Gly Thr Trp Leu Lys Ser Gly Phe Gly Arg

180 185 190Gly Ala Ile Ile Gly Val Leu Asp Thr Gly Ile Trp Pro Glu Ser Pro

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275 280 285Val Pro Met Ala Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Gly Glu Ala Arg Gly

325 330 335Asp Gly Val Asp Ile Leu Ser Leu Ser Ile Gly Gly Phe Pro Val Pro

340 345 350Leu Tyr Glu Asp Thr Ile Ala Ile Gly Ser Phe Arg Ala Met Glu Arg

355 360 365Gly Ile Ser Val Ile Cys Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Leu Ser

405 410 415Val Tyr Gly Glu Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Gln Val His Asn Ser Gln

420 425 430Lys Val Leu Glu Ile Val Tyr Leu Asn Asp Gly Asp Asn Gly Ser Glu

435 440 445Phe Cys Leu Arg Gly Ser Leu Pro Arg Ala Lys Val His Gly Lys Ile

485 490 495Asn Met Glu Glu Asp Ser Val Asp Val His Val Leu Pro Ala Thr Leu

500 505 510Ile Gly Phe Asp Glu Ser Ile Gln Leu Gln Ser Tyr Met Asn Ser Thr

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530 535 540Ser Ser Ala Pro Ala Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Ser Phe545 550 555 560Thr Asp Pro Ser Ile Leu Lys Pro Asp Val lle Ala Pro Gly Val Asn

565 570 575Ile Ile Ala Ala Trp Pro Gln Asn Leu Gly Pro Ser Gly Leu Ala Glu

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660 665 670Asp Pro Gly Leu Ile Tyr Asp Ile Asn Ala Asn Asp Tyr Ile Thr His

675 680 685Leu Cys Thr Ile Gly Tyr Lys Asn Ser Glu Ile Leu Ser Ile Thr His

725 730 735Lys Met Ile Thr Arg Arg Val Thr Asn Val Gly Ser Pro Asn Ser Ile

740 745 750Tyr Ser Val Glu Ile Val Ala Pro Glu Gly Val Lys Val Arg Val Lys

755 760 765Pro Arg Arg Leu Val Phe Lys His Val Asn Gln Ser Leu Ser Tyr Arg

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820 825<210>11<211>3140<212>DNA<213>马铃薯<220><221>CDS<222>(1)..(2298)<400>11act cat tta ttc tcc ttt cta tgt ctt tta cta tgt ttt gtt tgc ata 48Thr His Leu Phe Ser Phe Leu Cys Leu Leu Leu Cys Phe Val Cys Ile1 5 10 15caa gct caa gat ttg caa act tac ata gtt cag tta cat cca cat gga 96Gln Ala Gln Asp Leu Gln Thr Tyr Ile Val Gln Leu His Pro His Gly

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290 295 300cat gga att tca gtt ata tgt gct gca ggg aat aat gga cca atc caa 960His Gly Ile Ser Val Ile Cys Ala Ala Gly Asn Asn Gly Pro Ile Gln305 310 315 320agt tca gta gcc aac ggt gct cct tgg att gcc act att ggt gct agc 1008Ser Ser Val Ala Asn Gly Ala Pro Trp Ile Ala Thr Ile Gly Ala Ser

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725 730 735Phe Ala Glu Gly Gln Leu Thr Trp Phe Asn Val Gly Asn Lys Ala Thr

740 745 750Lys Val Lys Ser Pro Ile Ser Val Thr Trp Ala Ser Met Lys

755 760 765<210>13<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>13Gln Thr Tyr Ile Val1 5<210>14<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>14Ile Val Gln Leu His1 5<210>15<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>15Ser Ser Arg Leu Leu1 5<210>16<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>16Gln Thr Thr Tyr Ser1 5<210>17<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>17Ser Ser Ser Cys Asn1 5<210>18<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>18Val Leu G1y Asn Gly1 5<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>19Gly Ala His Ile Ala1 5<210>20<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>20Phe Arg Ala Met Glu1 5<210>21<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>2lVal Ile Cys Ala Ala1 5<210>22<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>22Ala Ala Gly Asn Asn1 5<210>23<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>23Ser Ser Val Ala Asn1 5<210>24<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>24Tyr Gly Glu Ser Leu1 5<210>25<2ll>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>25Gly Ser Glu Phe Cys1 5<210>26<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>26Cys Leu Arg Gly Ser1 5<210>27<21l>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>27Arg Gly Val Asn Gly1 5<210>28<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>28Pro Ala Thr Leu Ile Gly1 5<210>29<2ll>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>29Ile Phe Gly Gly Thr1 5<210>30<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>30Pro Gln Asn Leu Gly1 5<210>31<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>31Val Asn Phe Thr Val1 5<210>32<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>32His Val Ser Gly Ile1 5<210>33<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>33Gly Phe Ser Leu Asn1 5<210>34<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>34Arg Arg Val Thr Asn

1 5<210>35<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>35Pro Asn Ser Ile Tyr1 5<210>36<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>36Leu Ser Tyr Arg Val1 5<210>37<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>37Ser Pro Ile Ser Val1 5<210>38<21l>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>38Val Ile Cys Ala Ala1 5<210>39<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>39Cys Ala Ala Gly Asn1 5<210>40<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>40Ala Ala Gly Asn Asn1 5<210>4l<21l>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>4lVal Ile Cys Ala Ala Gly Asn Asn Gly1 5<210>42<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>42Ile Ile Gly Val Leu1 5<210>43<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>43Gly Val Leu Asp Thr1 5<210>44<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>44Thr His Thr Ala Ser Thr1 5<210>45<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>人工序列的说明：人工序列<400>45Ser Arg Asp Ser1<210>46<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>46Arg Asp Ser Gly1<210>47<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>人工序列的说明：人工序列<400>47His Val Ser Gly Ile1 5<210>48<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>48Phe Thr Val Ser Gly Thr1 5<210>49<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>49Ser Tyr His Ser Ala1 5<210>50<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>50Gly Leu Ser Pro Thr1 5<210>51<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>51Trp Leu Lys Ser Gly1 5<210>52<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>52Phe Asn Ser Ser Ser1 5<210>53<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>53Ala Ser Thr Ala Gly1 5<210>54<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>人工序列的说明：人工序列<400>54Ala Ala Met Asp Val<210>55<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>223>人工序列的说明：人工序列<400>55Trp Ile Ala Thr Ile1 5<210>56<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>56Gly Pro Ser Gly Leu1 5<210>57<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>57Ile Ala Ala Leu Leu His1 5<210>58<2ll>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>58Lys Pro Ile Met Asp1 5<210>59<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>59Val Ser Cys His Asp1 5<210>60<2l1>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>60Tyr Pro Ser Ile Ser1 5<210>61<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的说明：人工序列<400>61Ser Leu Ser Tyr Arg

Claims

1．一种重组DNA分子，含有：

(b)含有SEQ ID NO:1、7、9或11所给出的核苷酸序列的核酸分子；

(d)与(a)-(c)任一定义的核酸分子的互补链杂交的核酸分子；

(ⅲ)核酸分子，其特异地与(ⅰ)的核酸分子或其互补链杂交。

2．如权利要求1的重组DNA分子，其中所述核酸分子为DNA、cDNA、基因组DNA或合成用合成DNA。

3．如权利要求1的重组DNA分子，其中所述核酸分子来自植物，优选拟南芥属或马铃薯。

4．如权利要求1-3任一的重组DNA分子，其中所述核酸分子可操作地连接到允许所述核酸分子在植物中表达的调节元件上。

5．含有权利要求1-4任一的重组DNA分子的载体。

6．含有权利要求5的载体或者权利要求1-4任一的重组DNA分子的宿主细胞。

7．一种与野生型植物相比具有改变的气孔特性的转基因植物的生产方法，包括将权利要求1-4任一的重组DNA分子或权利要求5的载体引入植物、植物细胞或植物组织的基因组中。

8.一种转基因植物细胞，含有稳定地整合到基因组中的权利要求1-4任一的重组DNA分子或权利要求5的载体或按照权利要求7的方法获得的，其中与野生型植物相比，核酸分子的表达导致枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在转基因植物中的表达或活性增加。

9．含有权利要求8的植物细胞的转基因植物或植物组织。

10．权利要求9的转基因植物，其与野生型植物相比气孔密度降低、气孔导度降低和/或水分消耗降低。

11．一种转基因植物细胞，含有稳定地整合到基因组中的权利要求1-4任一的重组DNA分子或其部分，权利要求5的载体或按照权利要求7的方法获得的，其中与野生型植物相比，核酸分子或其部分的存在、转录和/或表达导致枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶在转基因植物中的合成或活性降低。

12．权利要求11的植物细胞，其中通过反义、有义、核酶、共抑制和/或显性突变效应实现降低。

13．含有权利要求11或12的植物细胞的转基因植物或植物组织。

14．权利要求13的转基因植物，其与野生型植物相比在植物叶中气孔密度增加和/或气孔导度较高和/或糖含量增加和/或蛋白质含量增加。

15．含有权利要求8、11或12的植物细胞的权利要求9、10、13或14任一植物的可收获部分或繁殖材料。

16．含有权利要求1-4任一的重组DNA分子或权利要求5的载体的试剂盒。

17．一种与野生型植物相比产量增加和/或气孔密度增加的转基因植物的生产方法，其中

(b)由按照步骤(a)制备的细胞再生植物；和

(c)如果有的话，由按照步骤(b)制备的植物产生其它植物。

18．一种与野生型植物相比具有降低的水分消耗和/或降低的气孔密度的转基因植物的生产方法，其中

(b)由按照步骤(a)制备的细胞再生植物；和

(c)如果有的话，由按照步骤(b)制备的植物产生其它植物。

19．编码或调节枯草杆菌蛋白酶类丝氨酸蛋白酶表达的核酸分子或与这种核酸分子杂交的核酸分子、权利要求1-4任一定义的核酸分子、权利要求1-4任一的重组DNA分子、或者权利要求5的载体在生产鲜重和干重提高的植物、提高植物叶中的糖含量和/或蛋白质含量以生产叶温降低或失水降低和水分消耗降低的植物、调节(提高)二氧化碳吸入叶中和水分从叶中释放、在高强度条件下持续光合作用或者提高植物抗病性中的用途。