CN1319520C

CN1319520C - 核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂

Info

Publication number: CN1319520C
Application number: CNB2005100237836A
Authority: CN
Inventors: 徐宇虹; 张健存; 陈剑; 章丽辉
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2025-02-03
Also published as: CN1679514A

Abstract

一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，用于治疗病毒感染性疾病。本发明含有核苷膦酸类化合物作为活性成分，核苷膦酸类化合物和脂质分子形成复合物或脂质体制剂。本发明相对于核苷膦酸类化合物的其它制剂，能够有效地改变药物在体内的分布特性，使药物富集于病灶部位，使药物在相同剂量下对病毒的抑制作用，得到了有效的提高，并降低药物对肾脏的毒副作用。大大提高此类药物的应用前景。

Description

核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂

技术领域

本发明涉及的是一种用于药物的制剂，特别是一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂。

背景技术

病毒感染严重威胁着人类健康，迫切需要有效的药物治疗。以乙型肝炎为例，我国的乙肝病毒携带者有超过一亿人，其中慢性乙型肝炎患者约3000万，目前的治疗用药中，α-干扰素的疗程较长，价格昂贵，而且只有30~50％的响应率，拉米呋定为核苷类似物，通过抑制逆转录酶以及DNA聚合酶的作用来阻断病毒繁殖，效果明显，但有一定的副作用，而且容易引发病毒DNA聚合酶突变而出现抗药性，停药后反弹更是严重。

核苷膦酸类化合物，对逆转录酶以及DNA聚合酶有广谱的抑制性，是一类很有前途的抗病毒化合物。经对现有技术文献的检索发现，美国Gilead公司在此领域已经获得一系列专利(USP 5,935,946 Nucleotide analog compositionand synthesis method核苷类似物的处方和合成途径；USP 5,733,788 PMPApreparation替诺福韦的制备)。但不足之处在于其中某些化合物生物利用度低，特别是病灶细胞摄取率低，但代谢迅速，用药剂量较大，毒性相应变大；已上市的阿德福韦酯，因肾脏毒性较大，导致患者往往不能完成治疗。将脂质体和脂质复合物技术应用于核苷膦酸类化合物尚未见专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，使其提高核苷膦酸类化合物在病灶部位的有效浓度以及进入被感染细胞的效率，从而提高药效，降低用药剂量，减小毒性。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明含有核苷膦酸类化合物作为活性成分，将核苷膦酸类化合物和脂质形成脂质复合物和脂质体制剂，其中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99~50％，脂质的摩尔百分比为50~99.01％。本发明所说的核苷膦酸类化合物是如下开链结构

其中，B为核苷碱基或修饰的碱基，包括腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，鸟嘌呤以及它们的修饰衍生物，还包括以上结构的膦酸酯类化合物。

R为H，CH₃，CF₃，CH₂OH，CH₂F；X为O，S。

本发明所说的脂质为各种天然或人工合成的阳离子磷脂、阴离子磷脂、中性磷脂、以上磷脂的聚乙二醇修饰修饰产物、胆固醇和其混合物。

本发明所说的脂质体，其结构为脂质双分子层构成的囊泡结构，包括单层脂质体、多层脂质体、多室脂质体，其粒径在20nm到50μm之间。

本发明所说的脂质复合物，其中包含的核苷膦酸类化合物与脂质间通过非共价键作用结合，包括配位键、氢键、亲水疏水作用、电荷相互作用或物理包裹。复合物的粒径在20nm到50μm之间。

本发明所说的脂质复合物，是带负电荷的核苷膦酸类化合物与带正电荷的阳离子脂质间以电性作用力相互结合形成的复合物。

本发明中所说的磷脂具有两亲性，可以形成双分子层囊泡结构装载药物，或直接形成脂质颗粒装载药物。

本发明所形成的脂质体和脂质复合物均包含脂质膜，其中包含0~100％天然或人工合成的阳离子两亲性化合物。

部分核苷膦酸类化合物带负电，本发明中所说的阳离子磷脂和阳离子两亲性化合物带正电荷，可以和带负电荷的核苷膦酸类化合物结合，通过两者间的静电作用形成复合物，大大提高载药率。

本发明中所说的磷脂的聚乙二醇修饰产物可以在脂质体或脂质复合物表面形成一个亲水性的高分子层，有助于保持其稳定性，降低了血浆蛋白与其作用，使其在血浆中的循环时间大大延长，从而维持较高的、平稳的血药浓度，在抗病毒治疗中，发挥持续的抗病毒作用防止病毒复制，抑制耐药变异株的产生。

本发明中所说的胆固醇具有调节药物从脂质复合物或脂质体中释放速度的作用。

应当说明的是，许多脂质都适合用于本发明，除以上脂质外，药学领域内的技术人员已知的任何成囊泡脂质都可以考虑。

本发明可以通过薄膜分散法、乙醇注入法、高压乳匀法等方法实现，也可通过pH梯度法、钙离子梯度法和电性包裹法实现，后者有更高的包封率。

采用激光粒度散射仪(英国MALVEN公司)检测实施例5得到的脂质复合物，其粒径在200纳米以下，且分布集中，呈单峰分布。采用原子力显微镜(AFM)观察的图片也证实其粒径的纳米尺度。进一步，通过调节脂质配方或改变制备方法，可以使制得的粒子粒径小至十几纳米，大至50微米。

本发明的有益效果表现在以下方面：

核苷膦酸类化合物脂质体和脂质复合物能够有效地作用于细胞膜，促进细胞对药物的摄取，使药物在细胞内的浓度增加，药效得以提高。将核苷膦酸类化合物中的替诺福韦制成脂质复合物，以Hep G2 2.2.15细胞株作为体外细胞模型(该细胞含有整合的乙肝病毒DNA，在细胞培养过程中，能持续稳定地向培养液中分泌表面抗原(HBsAg)及乙肝病毒DNA，为评价抗乙肝病毒药物活性的最常用细胞)，进行细胞药效试验。相对于游离的替诺福韦溶液，替诺福韦脂质复合物在相同浓度下对病毒的抑制作用，得到了有效的提高，表面抗原量显著下降，乙肝病毒DNA拷贝数大大降低。

核苷膦酸类化合物脂质体和脂质复合物能够显著改变药物的体内组织分布。将核苷膦酸类化合物中的替诺福韦制成脂质复合物，用同样剂量的游离药物和药物的脂质复合物对小鼠进行尾静脉注射，分别于不同时间点处死小鼠，将其肝脏和肾脏用生理盐水洗净，用滤纸吸干，称重后组织匀浆，用高效液相色谱测定组织匀浆中的药物浓度。替诺福韦脂质复合物与替诺福韦溶液相比，在肝脏药物浓度大幅度提高，增加了对病毒的抑制作用，而在肾脏药物浓度大大降低，减轻了对肾脏的毒性。核苷膦酸类化合物临床使用时一个非常显著的缺点就是肾毒性大，往往使得治疗不能完成。本发明对肝脏的靶向性和对肾毒性的降低将大大提高此类药物的应用前景。

具体实施方式

实施例1

将含24mg 1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵(DOTAP)的氯仿溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去氯仿使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，向茄形瓶中加入1mg/ml替诺福韦(Tenofovir，PMPA)的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为50.00％，脂质的摩尔百分比为50.00％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数降低81％，乙肝病毒的DNA拷贝数下降66％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加180％，在肾脏中的最大浓度下降35％。

实施例2

将含66毫克二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、14毫克3β-[N-(N’，N’-二甲氨基乙基)-氨甲酰]胆固醇(DC-cholestrol)和11毫克胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去氯仿使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，向茄形瓶中加入1mg/ml替诺福韦的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为20.00％，脂质的摩尔百分比为80.00％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数降低58％，乙肝病毒DNA拷贝数下降51％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加230％，在肾脏中的最大浓度下降49％。

实施例3

将含64mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的丙酮溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去丙酮使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，向茄形瓶中加入1mg/ml替诺福韦的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为16.67％，脂质的摩尔百分比为83.33％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数降低85％，乙肝病毒DNA拷贝数下降76％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加280％，在肾脏中的最大浓度下降54％。

实施例4

将含186.2毫克卵磷脂(EPC)、40.6毫克胆固醇溶于乙醇中，用微孔滤膜过滤乙醇溶液，待用。将20毫升0.5毫克/毫升替诺福韦的HEPES缓冲液加入到50ml含有搅拌子的烧瓶中，然后将乙醇溶液以一定的速率，注入HEPES缓冲液中，恒温高速搅拌，减压蒸去乙醇，形成脂质体的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为9.09％，脂质的摩尔百分比为90.91％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数下降53％，乙肝病毒DNA拷贝数下降47％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加320％，在肾脏中的最大浓度下降53％。

实施例5

将含251毫克二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、47毫克溴化双甲基双十八烷基胺(DDAB)和115毫克胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去氯仿使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，向茄形瓶中加入1mg/ml阿德福韦(Adefovir，PMEA)的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为4.76％，脂质的摩尔百分比为95.24％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的阿德福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数降低62％，乙肝病毒DNA拷贝数下降55％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加400％，在肾脏中的最大浓度下降57％。

实施例6

将含399mg卵磷脂、289mg甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、73mg1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵(DOTAP)、122mg胆固醇(cholesterol)的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发使其成膜后，向茄形瓶中加入1mg/ml替诺福韦磷酸盐缓冲液10ml，振摇，-70℃冷冻后，室温复融，反复10次后，过高压乳匀机10次，形成半透明的脂质体的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为3.23％，脂质的摩尔百分比为96.77％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数下降72％，乙肝病毒DNA拷贝数下降62％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加530％，在肾脏中的最大浓度下降72％。

实施例7

将553mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、105mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、217mg胆固醇溶于乙醚溶液中，将10mg替诺福韦溶于磷酸盐缓冲液中，条件下将脂质的乙醚溶液注入替诺福韦水溶液中，加热搅拌除去乙醚，形成半透明的脂质体的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为2.44％，脂质的摩尔百分比为97.56％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数下降68％，乙肝病毒DNA拷贝数下降60％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加570％，在肾脏中的最大浓度下降75％。

实施例8

将含815mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、125mg[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)、215mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发使其成膜后，向茄形瓶中加入HEPES氯化钙缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，以HEPES缓冲液透析，调节钙离子浓度，形成钙离子梯度，加入10mg阿德福韦，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为1.96％，脂质的摩尔百分比为98.04％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的阿德福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数下降55％，乙肝病毒DNA拷贝数下降43％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加450％，在肾脏中的最大浓度下降60％。

实施例9

将含963mg二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和183mg二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、379mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发使其成膜后，向茄形瓶中加入HEPES溶液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，加入酸性溶液调节外水相至pH＝4，加入10mg替诺福韦，摇匀，形成均匀乳白的脂质复合物的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为1.41％，脂质的摩尔百分比为98.59％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的替诺福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数下降43％，乙肝病毒DNA拷贝数下降31％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加660％，在肾脏中的最大浓度下降87％。

实施例10

将1687mg豆磷脂(SPC)、573mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发使其成膜后，向茄形瓶中加入1mg/ml阿德福韦的缓冲液10ml，手摇振荡，使脂质充分水化，将脂质体依次通过0.8um，0.4um，0.3um，0.22um等一系列的聚碳酸脂膜数次，结果随着膜孔径的减小，得到半透明的脂质体的混悬液。

本实施例中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99％，脂质的摩尔百分比为99.01％。

以本实施例制得的制剂作为实验组，同样剂量的阿德福韦溶液作为对照组，与对照组相比，细胞实验乙肝病毒表面抗原数下降33％，乙肝病毒DNA拷贝数下降25％，药物组织分布的动物实验表明，药物在肝脏中最大浓度增加700％，在肾脏中的最大浓度下降93％。

Claims

1、一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，其特征在于，含有核苷膦酸类化合物作为活性成分，并使核苷膦酸类化合物和脂质形成脂质复合物和脂质体制剂，所述的核苷膦酸类化合物是如下开链结构：

其中，B为腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，或鸟嘌呤；R为H，CH₃，CF₃，CH₂OH，CH₂F；X为O，S，脂质为1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵、二月桂酰磷脂酰胆碱、十六烷基三甲基溴化铵、卵磷脂、胆固醇、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、溴化双甲基双十八烷基胺、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、豆磷脂或它们的混合物，核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂中，核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99~50％，脂质的摩尔百分比为50~99.01％。

2、根据权利要求1所述的核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，其特征是，所述的脂质体，其结构为脂质双分子层构成的单层脂质体、多层脂质体或多室脂质体，其粒径在20nm到50μm之间。

3、根据权利要求1所述的核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，其特征是，所述的脂质复合物，其中包含的核苷膦酸类化合物与脂质间通过配位键、氢键、亲水疏水作用、电荷相互作用或物理包裹的作用将结合的，复合物的粒径在20nm到50μm之间。

4、根据权利要求1或者3所述的核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，其特征是，所述的脂质复合物，是带负电荷的核苷膦酸类化合物与带正电荷的阳离子脂质间以电性作用力相互结合形成的复合物。

5、根据权利要求1所述的核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂，其特征是，所述的脂质体和脂质复合物均包含脂质膜，其中包含0~100％天然或人工合成的阳离子两亲性化合物。