CN1312289C - 诊断探针检测系统 - Google Patents

诊断探针检测系统 Download PDF

Info

Publication number
CN1312289C
CN1312289C CNB028232720A CN02823272A CN1312289C CN 1312289 C CN1312289 C CN 1312289C CN B028232720 A CNB028232720 A CN B028232720A CN 02823272 A CN02823272 A CN 02823272A CN 1312289 C CN1312289 C CN 1312289C
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
target
sequence
allelotrope
nucleic acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
CNB028232720A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1589331A (zh
Inventor
K·塞托
J·-H·李
L·布莱尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
One Lambda Inc
Original Assignee
One Lambda Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23263504&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1312289(C) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by One Lambda Inc filed Critical One Lambda Inc
Publication of CN1589331A publication Critical patent/CN1589331A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1312289C publication Critical patent/CN1312289C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种检测核酸序列是否存在的方法，所用诊断探针包括基本上分别互补于靶标核酸链的第一和第二靶标区的第一和第二探针区，其中第一探针区位于第二探针区的5’端。第一探针区基本上互补于靶标核酸链的第一靶标区，靶标核酸链还具有第二靶标区，其中当靶标核酸链上的所述第一靶标区与第二靶标区连续时，那么在诊断探针上的第一和第二探针区用核酸间隔区隔开。

Description

诊断探针检测系统
本申请要求于2001年9月24日提交的美国临时申请NO.60/324421的在先权益，该申请在此全部引入作为参考。
发明背景
本发明涉及一种检测核酸序列存在或不存在的方法，其中所述核酸序列是病原体等以及基因变体和突变体的特征性序列，所述变体和突变体包括在人类移植中令人关注的人白细胞抗原(HLA)相关的变体或突变体。与T-细胞受体(TCR)基因序列相关的变体和突变体也受人所关注。
在天然状态下，HLA位点(locus)具有高度多态性。在HLA因子的命名体系2000(Hum.Immunol.2001年4月，62(4)：419-468)中公开了：124个HLA-A等位基因、258个HLA-B等位基因、74个HLA-C等位基因、221个HLA-DRB1等位基因、19个DRB3等位基因、89个DRB4等位基因、14个DRB5等位基因、19个DQA1等位基因和39个DQB1等位基因，而且还有新的等位基因被陆续报道。作为进展很快的证明，WHO的HLA因子体系的命名委员会(www.anthonynolan.com/HIG/)在2002年7月更新后，表明有：250个HLA-A等位基因、488个HLA-B等位基因、118个HLA-C等位基因、312个HLA-DRB1个等位基因、38个DRB3等位基因、12个HLA-DRB4等位基因、25个HLA-DRB5等位基因、22个DQA1等位基因、53个DQB1等位基因、20个DPA1和99个DPB1等位基因。
所有的HLA-A、-B和-C等位基因具有相似的序列。而在DRB1、DRB3、DRB4和DRB5序列也具有相似性。由于存在相似性，当用一对引物进行序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)时，经常出现两个或更多个等位基因被扩增现象，或在诊断性序列特异性寡核苷酸探针检测(SSO)体系中，也经常出现两个或更多个等位基因被杂交的现象。因此，要达到每一个等位基因具有唯一的PCR-SSP或SSO检测模式，则需要利用多对引物或多个探针。进而，在鉴定HLA分型(typing)中使用的诊断杂交SSO探针也由于HLA等位基因具有高度同源性而受到干扰。因此，现有技术中的许多分型方法，例如Bugawan等，Tissue Antigens(1994)44：137-147中描述的方法，在鉴定HLA分型和其它应用中缺乏准确性。
PCR可以鉴别靶标DNA模板上的特征序列。如果出现扩增，则模板DNA包含与所引物相同的序列。如果没有出现扩增，则模板DNA的序列不同于引物序列。Newton等的美国专利No.5,595,890公开了一种用于确定基因分型的PCR诊断方法，包括利用PCR-SSP来鉴定HLA的分子分型。根据该方法，根据在多轮PCR中的阳性或阴性反应模式来鉴定未知等位基因。如上所述，由于HLA具有高度的多态性，Newton所公开的方法在HLA分型时，其效率是有限的。由于用两条分别具有特定序列的引物经常扩增出许多个HLA等位基因，因此需要增加PCR扩增反应的轮数，才能鉴定一个未知的等位基因。基于类似的理由，在上文中所提到的非-PCR方法中，为了准确的鉴定HLA的分型也需要很多条诊断探针。PCR要求引物对分别与在DNA模板上欲扩增的区域两侧相应。引物与预期序列退火能力依赖于引物的长度，并要在PCR热循环程序中设定退火温度。为了获得对DNA序列的特异性扩增，引物越长，则退火温度越高。PCR-SSP利用了引物长度和退火温度之间的平衡来达到引物导向序列扩增的特异性。
在临床使用中，用于HLA分型的PCR-SSP体系需要利用有限数目的PCR反应次数来达到尽可能高的分辨率，这样一对引物所能扩增出的等位基因数目将减少(即引物或探针的特异性需要提高)。共同美国专利No.6,207,379中公开的内容对本发明有用，将其引入本申请中作为参考。该专利中教导了诊断PCR引物用于鉴定非连续(缺口(gap))序列，以在HLA分型中的对相关等位基因的分辨率更高。在可选地另一个实施例中，美国专利No.6,207,379教导了利用诊断引物与在靶标核酸中的非连续序列进行杂交和聚合酶介导引物延伸来扩增靶标。除美国专利No.6,207,379的方法在对靶标HLA序列进行更高特异性的扩增是成功的之外，利用PCR和非-PCR的对HLA序列进行检测的方法仍然需要改进。
在美国专利No.6,207,379中描述的PCR发明中，提到在本领域中存在着如此需求：即对基于PCR-SSP的分子分型方法进行改进，进而提高分型方法的特异性以便减少在每次鉴定中所要进行PCR反应的次数。然而，在本领域中也存在用非-PCR方法对特异序列进行检测的需求。由于基本热动力学的原因，探针和模板，包括完全匹配的情况，总是处在杂交和非杂交之间的平衡状态。探针有时附着于靶标模板上，有时却没有附着在上面。PCR的延伸过程中，聚合酶对于将引物锁定在相应位置上是非常关键的。在非-PCR方法中，缺乏关键因素即聚合酶(和接下来的延伸阶段)，因此对于短的探针与靶标形成的杂交复合体不一定总是令人满意的长时间处于的稳定状态。基于此原因，通常认为杂交探针需要比相应的延伸引物更长以确保杂交复合体的稳定性。
在Gentalen等，Nucleic Acids Research Vol.27，No.6，pp1485-1491(1999)中所公开的内容对本发明也是有用的，其中公开了一种鉴定DNA链上两个位点之间的物理连锁(linkage)的方法，它是通过在寡核苷酸阵列中同一个点(address)有多于一个寡核苷酸探针的高密度寡核苷酸阵列来达到的。根据该方法，协同杂交可区分靶标序列在物理上连锁还是不连锁。
因此，仍然需要对基于杂交的检测体系进行改进，以便能够可靠地检测具有高度多态性情形中的特异性靶标，包括HLA分型和T-细胞受体(TCR)基因序列的鉴定。
发明概述
本发明涉及一种检测样品/靶标核酸序列的改进方法，尤其是检测编码人白细胞抗原(HLA)的核酸的方法和检测T-细胞受体(TCR)基因序列的方法，由此诊断探针的特异性得以增加，使得至少一个探针能够识别靶标上的两个或更多区域，优选地在增加这种特异性的同时并不增加探针与样品/靶标核酸序列之间的退火温度。增加探针组的特异性减少了被检测等位基因的数量，因而提高了方法的分辨率并降低了成本。
具体地说，本发明提供一种在样品核酸链中检测靶标核酸序列的存在的方法，包括如下步骤：在杂交条件下，将诊断探针与被怀疑包含靶标核酸序列的样品进行接触。所述诊断探针的核苷酸序列包含：位于其5’端的第一探针区和位于所述第一探针区3’侧的第二探针区，其中第一探针区基本上互补于所述靶标核酸序列的特征性的第一靶标区。第二探针区基本上互补于所述靶标核酸链的靶标核酸序列的特征性的第二靶标区。当在靶标核酸链上的所述第一靶标区与第二靶标区连续时，那么用核酸间隔区(spacer)隔开诊断探针上的第一和第二探针区。当在诊断探针上的第一和第二探针区连续时，那么在靶标核酸链上的第一和第二靶标区之间存在有间插(intervening)序列。对于特定的杂交条件，第一和第二探针区的长度应使得当第一和第二探针区基本上分别互补于第一和第二靶标区时，诊断探针能够与靶标核酸链稳定杂交而形成可检测的探针：靶标杂交体。然而，在所选择的杂交条件下，当第一或者第二探针区不是基本上分别互补于靶标核酸链的第一或者第二靶标区时，诊断探针不能够与靶标核酸链稳定杂交，不能形成高于指示稳定杂交存在的阈值的探针：靶标杂交体。因而，可根据探针：靶标杂交体的存在与否来判断样品中是否存在靶标核酸序列。
在本发明的实际应用中，靶标核酸和核酸探针可以是DNA、RNA或合成的改变了主链的DNA分子，如用硫酸或肽键替代磷酸键。
由于在缺乏稳定杂交的情况下也可能产生可检测信号，本领域普通技术人员可以想到通过比较阳性和阴性对照所产生的信号来确定稳定杂交存在或不存在。可以确定这样一种阈值，用它来区分稳定杂交与不稳定(包括瞬时)杂交，因而利用该阈值可以作为样品中是否存在靶标核酸序列的指标。其中一个方法，在选择出的预设条件下，阳性对照样品的最低值和阴性对照样品的最高值之间的中间值可选择为确定“阳性”反应的阈值。
根据本发明的一个优选方面，第一探针区和第二探针区分别与第一和第二靶标区完全互补，但这不是必需的。根据本发明的一个优选方面，样品/一条或多条靶标核酸链源自被检测的人体，但这也不是必需的。
虽然本发明的诊断探针上的第一和第二探针区可以是连续的，但这不是必需的。因此，根据本发明的一个优选实施方式，第一探针区和第二探针区可由间隔区分开，其中间隔区的核酸序列不互补于靶标核酸链的位于第一靶标区和第二靶标区序列之间的序列，即所谓的“间插序列”。具体地，选择间隔区以提供诊断探针的第一探针区和第二探针区核苷酸序列在互补中形成非连续互补，以致于只有在第一探针区和第二探针区分别基本上互补于第一和第二靶标区时才形成稳定的杂交体。根据本发明的方法另一个实施方式，不仅在第一和第二探针区之间存在间隔区，而且在所述靶标核酸上的第一和第二靶标区之间存在有间插序列。
探针上探针区之间的间隔区长度通常多于一个核苷酸而少于350个核苷酸，优选1到30，特别优选3到10个核苷酸。在大部分情况下，间隔区不必超过10或20个核苷酸碱基的长度。相反，靶标核酸的靶标区之间的间插序列长度可为1到500或更多个碱基，优选少于350个(1-350碱基)核苷酸。然而，间隔区长度以及靶标核酸链上的靶标区之间的间插序列长度都不应当过长而影响探针区对它们各自相应靶标区的协同结合。此外，探针区和靶标区的长度也不应当长到使任何一个探针区能独立地与其靶标区杂交，这种杂交依靠的是增加长度(并因而增加退火温度)而不要求其它探针区与其靶标区进行事先的瞬时杂交。只有当两个探针区均稳定地与其各自的靶标区杂交时才能产生高于指示靶标核酸存在的阈值信号。
在另一方面，本发明教导了一种检测在两个或更多样品核酸链上的两个或更多个靶标核酸序列的方法，其包括将被怀疑含有所述靶标核酸序列的样品与诊断探针在杂交条件下进行接触。第一靶标核酸序列具有第一靶标区和第一互补靶标区带(zone)。第二靶标核酸序列具有第二靶标区和第二互补靶标区带。所述诊断探针的核苷酸序列包括(1)第一探针区，基本上互补于所述第一靶标核酸序列的特征性第一靶标区，和(2)第二探针区，基本上互补于所述第二靶标核酸序列的特征性第二靶标区。对于选择杂交条件的要求是，当第一互补靶标区带基本上互补于第二互补靶标区带，第一探针区基本上互补于第一靶标区，第二探针区基本上互补于第二靶标区时，则第一和第二探针区能够使诊断探针与靶标核酸稳定杂交而形成可检测的探针：靶标杂交体。然而，在选择的杂交条件下，当第一互补靶标区带不是基本上互补于第二靶标区带，或第一探针区不是基本上互补于第一靶标区，或第二探针区不是基本上互补于第二靶标区时，则第一和第二探针区不能使诊断探针与靶标核酸稳定杂交，即不能形成高于指示稳定杂交体存在的阈值的探针：靶标杂交体。检测稳定的探针：靶标杂交体的存在与否来指示在样品中是否存在靶标核酸序列。
在一些实施方式中，诊断探针上的第一和第二探针区由核酸序列间隔区分开。在另一些实施方式中，第一靶标区和第一互补靶标区带被第一非互补区带所隔开，或第二靶标区和第二互补靶标区带由第二非互补区带所隔开。
在一些包括互补靶标区带的实施方式中，第一靶标区和第一互补靶标区带可由第一非互补区带所隔开，或第二靶标区和第二互补靶标区带可由第二非互补区带所隔开。在这些实施方式中，第一和第二非互补靶标区带之间，以及它们与间隔区均不是基本上互补的。
在有间隔区的那些实施方式中，其间隔区通常多于一个核苷酸而少于350个核苷酸，优选1到30，特别优选3到10个核苷酸(碱基)。在大部分情况下，间隔区不必超过10或20个核苷酸碱基的长度。相反，靶标核酸上的靶标区和互补靶标区带(CTZ)之间的非互补区带(NCZ)的长度可为1到500或更多个碱基，优选少于350个(0-350碱基)核苷酸。然而，间隔区长度以及在靶标核酸链上的靶标区之间非互补区带的长度都不应当过长而影响探针区对它们各自相应靶标区的协同结合。此外，探针区、靶标区和互补靶标区带的长度也不应当长到使任何一个探针区能独立地与其相应靶标区杂交，这种杂交依靠的是增加长度(并因而增加退火温度)而不要求其它探针区与其靶标区进行事先的瞬时杂交，也不应当使互补靶标区之间的形成稳定杂交。只有当两个互补靶标区能够相互稳定杂交和两个探针区稳定地与其各自的靶标区杂交才能产生高于指示靶标核酸存在的阈值信号。
在本发明的实际应用中，靶标核酸和核酸探针可以是DNA、RNA或合成的改变了主链的DNA分子，如用硫酸或肽键取代磷酸键。
由于在缺乏稳定杂交的情况下也可能产生可检测信号，本领域普通技术人员可以想到通过比较阳性和阴性对照所产生的信号来确定稳定杂交存在或不存在。可以确定这样一种阈值，用它来区分稳定杂交与不稳定(包括瞬时)杂交，因而利用该阈值可以作为样品中是否存在靶标核酸序列的指标。其中一个方法，在选择出的预设条件下，阳性对照样品的最低值和阴性对照样品的最高值之间的中间值可选择为确定“阳性”反应的阈值。
根据本发明的一个优选方面，第一探针区和第二探针区分别与第一和第二靶标区完全互补，但这不是必需的。根据本发明的另一个优选方面，第一CTZ和CTZ分别与第一和第二靶标区完全互补，但这不是必需的。根据本发明的一个优选方面，样品/一条或多条靶标核酸链来自被测人体，但这也不是必需的。
根据本发明，在同一探针上具有两个(或多个)序列区。在本发明中，缺口探针的两个被隔开的部分应当足够短以致它们本身不能达到充分的结合。最初的探针区可以基于欲检测的等位基因中存在的独特序列来设计。一旦最初设计被考虑后，探针的长度通常是接下来需要考虑的重要因素。在非期望序列与预期的靶标序列之间只有数个碱基对的差别(包括只有一个碱基对的差别)时，探针区的长度尤其关键。两个探针区均能与其靶标序列结合(稳定杂交)是产生阳性信号所必需的。
附图简要说明
图1A(及1A’)和1B描述了本发明第一种实施方式，其中在靶标样品上的第一靶标区是位于第二靶标区的3’侧，并由间插序列所隔开。
图2A(及2A’)和2B描述了本发明第二种实施方式，其中在靶标样品上的第一靶标区与第二靶标区是连续的，诊断探针包括第一探针区和第二探针区及其它们之间的间隔区。
图3A(及3A’)和3B描述了本发明第三种实施方式，其中在靶标样品上，第一靶标区位于第二靶标区的3’侧，并由间插序列所隔开，诊断探针包括第一探针区和第二探针区及其它们之间的间隔区。
图4A、4B、4C和4D描述了本发明第四种实施方式，其中在第一靶标核酸链上，第一靶标区位于第一互补靶标区带的3’侧，且第二靶标区位于第二互补靶标区带的5’侧。
发明详述
本发明涉及的核酸探针可以有许多种用途，但特别适用于检测特定靶标核苷酸序列的存在与否。不同于利用传统的探针，本发明提供一种诊断探针，其包括在同一探针序列上存在两个(或多个)核酸探针区，优选是非连续的。根据本发明，探针序列的两个部分，即第一和第二探针区，可分别与第一和第二靶标区特异的结合。第二探针区位于第一探针区的3’侧。第二探针区优选的位于第一探针区的下游并被隔开，但如果在样品核酸链上的靶标区之间是非连续的，则第一和第二探针区可以是连续的。
在本发明的实际应用中，其中的一个探针区的功能是使探针最初和瞬时地与样品核酸链的预期序列相结合。两个探针区都具备这种功能，即任何一个探针区在开始时都能产生瞬时的结合。当其中一个探针区瞬时结合后，另一个探针区则具有更合适的动力学(依靠局部浓度效应)，以致于更容易识别附近的另一个序列(通常在数百个碱基对范围内)。两个探针区均能增加诊断探针对特定等位基因或其它靶标序列的特异性。
每一个探针区的长度应当短至不能使该探针区本身单独与靶标序列在所确定的杂交条件下形成稳定杂交，以防止产生错误的阳性信号。一个探针区与其相应的靶标区之间的瞬时退火可导致其它探针区在其相应靶标区的局部浓度增加，进而达到使其它探针区对其相应的靶标区之间的退火，最终使探针与样品之间形成稳定杂交。
根据本发明的一个优选方面，设计的第一和第二探针区应当满足：在选定的杂交条件下，当两个探针区基本上互补于各自的靶标区时，则形成可检测反应产物，而在相同杂交条件下，如果任何一个探针区不是与其相应的靶标区基本上互补，则不形成高于指示靶标序列存在的阈值的可检测反应产物。可以这样理解，在实际操作中，本发明诊断探针的选择性依赖于杂交条件的选择。因而，本领域技术人员都知晓退火温度越高通常要求更长的探针区序列，而退火温度越低则通常需要越短的探针区序列。其它因素如反应物浓度、探针和样品核酸链中的GC含量也影响着诊断探针的设计和杂交条件的选择。
图1描述了本发明的一种实施方式，用于检测样品核酸链上是否存在靶标核酸序列的诊断探针，所包括的第一和第二探针区之间没有间隔区所隔开。具体地，图1A表示的是第一探针区与第一靶标区之间形成的瞬时杂交，其中样品核酸上第一靶标区位于第二靶标区的3’侧，并由间插序列所隔开。图1A’表示第二探针区与第二靶标区之间形成的瞬时杂交，其中样品核酸上第二靶标区位于第一靶标区的5’侧，并由间插序列所隔开。
一个探针区与其相应靶标区的瞬时杂交造成局部浓度效应，以致于在选定的杂交条件下，诊断探针上的其它探针区将能与其相应的靶标区形成稳定杂交。进一步考虑靶标和诊断探针的同一性来选择杂交条件，以便在第一探针区不是与第一靶标区基本上互补或者第二探针区不是与第二靶标区基本上互补的情况下，诊断探针不与靶标核酸链稳定杂交，即不形成可检测探针：靶标杂交体。图1B表示诊断探针上的两个探针区与在样品核酸上的各自靶标区分别杂交，因而在与诊断探针杂交的样品核酸链上形成了由样品核酸链上的靶标区之间的间插序列所构成的环。在图1B中，表示所形成的探针：靶标稳定杂交体。
图2描述了本发明第二种实施方式，其中用于检测在靶标核酸链是否存在的诊断探针，所包括的第一探针区和第二探针区由位于中间的间隔区所隔开。在这种情况下，在靶标样品上的第一靶标区与第二靶标区是连续的。具体地，图2A表示第一探针区与第一靶标区之间形成的瞬时杂交，其中在靶标核酸上的第一靶标区位于第二靶标区的3’端。图2A’表示第二探针区与第二靶标区之间形成的瞬时杂交，其中靶标核酸的第二靶标区位于第一靶标区的5’端。
图2B表示诊断探针上的第一和第二探针区与在样品核酸上的第一和第二靶标区分别杂交，因而在诊断探针上形成了由探针区之间的间隔区所构成的环，这是由于间隔区不能与样品/靶标核酸链上的序列杂交所致。在图2B中，表示所形成的探针：靶标稳定杂交体。
图3描述了本发明第三种实施方式，其中用于检测在靶标核酸链是否存在的诊断探针包括了由间隔区隔开的第一探针区和第二探针区。在这个实施方式中，在靶标样品上的第一靶标区与第二靶标区之间由间插序列所隔开。相应地，图3表示了将图1和图2中所示实施方式的特征结合起来的一个实施方式。具体地，图3A表示第一探针区与第一靶标区之间形成的瞬时杂交，其中在靶标核酸上的第一靶标区位于第二靶标区的3’侧。图3A’表示第二探针区与第二靶标区之间形成的瞬时杂交，其中靶标核酸上第二靶标区位于第一靶标区的5’侧。
图3B表示诊断探针上的第一和第二探针区与在样品核酸链上的第一和第二靶标区分别杂交，由于这两个环之间的序列不是基本上互补，因而在诊断探针上形成了由探针区之间的间插区所构成的环，同时在样品核酸链上形成了靶标区之间的间插序列所构成的环。在图3B中，表示所形成的探针：靶标稳定杂交体。
虽然图1、2和3中显示，在靶标核苷酸链上的第一靶标区位于第二靶标区的3’端，这只是为了说明性目的。在其它实施方式中，第一靶标区可以位于第二靶标区的5’端。也可以实施包含两个以上靶标区和两个以上探针区的实施方式。
在本发明另外的实施方式中，探针区可以与靶标区杂交，其中靶标区位于不同的靶标核酸链上，且在其中一个靶标核酸链上存在至少一个区带，该区带基本上与存在于其它靶标核酸链上的一个区带互补。
其中，第一靶标核酸链包含至少两个感兴趣的序列。第一靶标核酸链上的第一个序列作为第一靶标区，基本上互补于第一探针区。第一靶标核酸链上的第二个序列作为第一互补靶标区带(CTZ)，基本上互补于在第二核酸链上的第二互补靶标区带(CTZ)。第一CTZ与第一靶标区之间可以由第一非互补区带(NCZ)所隔开，该NCZ的长度优选少于350个核苷酸碱基(0-350个碱基)，但也可长达500个核苷酸碱基或更长。
在第二靶标核酸链上包含至少两个感兴趣的序列。第二靶标核酸链第一个序列作为第二靶标区，基本上互补于第二探针区。第二靶标核酸链的第二个序列是第二互补靶标区带(CTZ)，它基本上互补于第一靶标核酸链上的第一互补靶标区带(CTZ)。第二CTZ与第二靶标区之间可为第二非互补区带(NCZ)所隔开，该NCZ的长度优选少于350个核苷酸碱基(0-350个碱基)，但也可长达500个核苷酸碱基或更长。
在本发明前面的实施方式和各个方面中所涉及的原则，至少在杂交特性方面也同样适用于该实施方式和其它涉及CTZ的实施方式。具体地，对于稳定杂交而言，要求第一探针区和第一靶标区之间、第二探针区和第二靶标区之间基本上互补。此外，在这些涉及CTZ的实施方式中，为了第一探针区和第一靶标区之间、第二探针区和第二靶标区之间形成稳定杂交，则第一CTZ必须基本上互补于第二CTZ。然而，与前面的实施方式不同，在这些涉及CTZ的实施方式中，第一探针区不需要位于第二探针区的5’端。
图4是本发明第四种实施方式，其中用于检测在两个靶标核酸链是否存在的诊断探针包括了由间隔区隔开的第一探针区和第二探针区，其中第一探针区位于第二探针区的5’端。在这个实施方式中，第一靶标区和第一CTZ存在于第一靶标核酸链，而第二靶标区和第二CTZ位于第二靶标核酸链上。具体地，图4A显示在杂交之前的第一和第二靶标核酸链、诊断探针。图4B显示在第一和第二CTZ之间形成稳定的杂交。图4C显示第一探区与第一靶标区形成的瞬时杂交，其中在第一靶标核酸上的第一靶标区位于第一CTZ的3’端。在图4D中，表示所形成的探针：靶标稳定杂交体。
虽然图4显示，第一CTZ位于第一靶标区的5’端，第二CTZ位于第二靶标区的3’端，但在其它的实施方式中，CTZ不一定是这种位置关系。即，在同一核酸链上，CTZ可以相对于靶标区位于不同的位置。例如，第一CTZ可在第一探针区的3’端，而不是5‘端。另外的实施方式中，第二CTZ可位于第二靶标区的5’端，而不是3’端。还可采用这样实施方式，即第一CTZ位于第一探针区的3’端，而第二CTZ位于第二靶标区的5’端。此外，虽然在图4中显示的是第一探针区位于第二探针区的5’端，但并不是非得如此。例如，在别的实施方式中，第一探针区可以位于第二探针区的3’端。而且，在涉及CTZ的实施方式中，诊断探针可以含有也可以不含间隔区，或在两个靶标核酸链中的一个或两个不包括NCZ。
在涉及CTZ的实施方式中，CTZ可以多于一对，也就是说，在两个(或更多个)靶标核酸链之间可以有多个互补区带。在有些实施方式中，可以通过聚合酶链式反应(PCR)将一个或多个CTZ整合到一个靶标核酸链中。具体地，当PCR反应用于产生靶标核酸链时，利用一个或多个PCR引物可以掺入一个核酸区域，该区域与与另一个靶标核酸链上的区域互补。在这些有多对CTZ的实施方式中，在所述核苷酸链中的两个CTZ之间为一个NCZ所隔开。
图1-4中显示，诊断探针的5’端附着于固体支持物上。然而，这只是说明性的。根据本发明的诊断探针也可以在3’端或其它位置进行附着。
根据本发明的靶标核酸链可以源自任何天然材料或人工材料，包括人。
使用本发明方法的诊断探针，可以增加杂交分析的选择性，因为它利用了两个以上独特序列来作为检测的选择性标准。根据本发明，选择合适的诊断探针使得可以分辩在杂合情况中出现的模棱两可，这种导致检测结果不明确的原因是只利用常规设计的探针时，对两个不同等位基因构成的等位基因对的检测结果完全同于对另外的等位基因对的检测结果。
利用本发明方法的诊断探针，通过应用多于一个的与感兴趣核酸序列同源的序列区，可以达到在对特定等位基因或等位基因对(set)的识别中具有更高的特异性。增加核酸序列同源性的特异性识别提高了许多基于DNA的检测方法的检测能力。这些检测方法包括基于核酸序列的存在与否而进行的HLA组织分型(tissue typing)、遗传性疾病的检测、在组织中感染性生物体的检测或其它各种标记或条件的检测(如检测基因治疗技术的有效性)。
术语“核苷酸”在此处是指在DNA或RNA中的核苷酸，因而包括了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶为碱基，以脱氧核糖或核糖为糖元。然而，在本发明所使用的诊断探针中也可采用其它与常规碱基即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的某一个配对的修饰碱基。这种修饰碱基包括，如8-氮鸟嘌呤和次黄嘌呤。
在此处所述的与核苷酸相关术语“互补于”是指一个核苷酸可与另一个特定的核苷酸形成碱基对。例如，腺苷三磷酸与尿苷三磷酸或胸苷三磷酸互补、鸟苷三磷酸与胞苷三磷酸互补。但在合适条件下，胸苷三磷酸与鸟苷三磷酸可以形成碱基对，这在本说明书中不被认为是互补。同样，胞苷三磷酸与腺苷三磷酸之间在特定条件下也能形成碱基对，在本发明中也不被认为是互补。这也适合于胞苷三磷酸和尿苷三磷酸之间的情况。
术语“顺式(cis)”是指两个(或更多个)靶标区位于同一DNA链上的情形，即它们是同一等位基因的一部分。相反，术语“反式(trans)”是指两个(或更多个)靶标区位于不同的DNA链上的情形，即它们是不同等位基因的一部分。
术语“连续”是指位于同一核酸链上的两个序列、区、区带、段等的核酸相互之间相邻且无任何间隔。即在两个序列之间不存在间隔区、间插序列或非互补区带。
在此处的诊断探针被选择为“基本上”互补于另外的链上被检测的每一个特定序列。这意指诊断探针必须与它们各自的链足够互补以形成杂交。因此，诊断探针序列不必与样品/靶标核酸序列完全一致。从而，探针序列(包括诊断探针上的第一和第二探针区)不必完全互补于靶标序列。因而，不是所有探针都产生与负等位基因的阴性对照相似的完全的负信号。根据错配碱基的数目和错配碱基的类型(G-T错配有时也产生与G-C配对大致相同的信号)，1个碱基对错配的等位基因产生荧光信号基本上高于负对照。然而，只要真正阳性等位基因的信号明显高于那些潜在的交叉反应的等位基因，通常可以大于10-20％作为阈值或分离点来区分阳性和阴性反应。
通常在探针序列的中部可以容忍少数的错配而仍然可以杂交。一般而言，容忍错配碱基的程度依赖于探针的长度，反过来也影响变性和退火温度的选择。如果探针的变性温接近或高于退火温度(较低的严谨条件)，那么虽然有少数(通常1或2个，最多3个)的错配碱基，其探针仍然能与靶标序列结合。一个探针区可能在其序列的中部会容忍更多的错配碱基，但这种容忍程度同样决定于探针区的变性温度和所选择的杂交和检测条件中的退火温度。类似的参数也适用于互补靶标区带序列。优选第一和第二探针区，以及第一和第二互补靶标区带与它们各自的靶标区或区带完全互补。然而，这些区或区带之间的完全互补并不是必需的。
诊断序列-特异性寡核苷酸探针检测(SSO)系统是一种利用诊断探针分析特定靶标核酸序列是否存在的系统或设计。在这种系统或设计中，可用接头将诊断探针附着于支持物上，接头是本领域熟知的如聚碳(poly-carbon)和聚核苷酸接头。可选地，靶标序列可固定在固体支持物上，例如硝酸纤维素膜而诊断探针溶解在溶液中。在SSO中的诊断探针包括至少一个探针区。术语“探针区”指基本上互补于靶标核苷酸序列一部分的存在于诊断探针上的核苷酸序列。该靶标核苷酸链上与探针区基本上互补的部分被称作“靶标区”。在那些涉及多个靶标核苷酸链的实施方式中，可以在每一个靶标核苷酸链上具有一个特定核苷酸序列即“互补靶标区带”(CTZ)，而且一个靶标链上的CTZ基本上互补另一个靶标链上CTZ。将靶标区与在特定靶标核苷酸链上的CTZ分隔开的序列被称为非互补区带(NCZ)，且一个靶标链的NCZ不是基本上互补于另一个靶标链的NCZ。然而，NCZ不是必需的。
缺口探针(gap probe)是指特定类型的探针，即包含一个以上的探针区。缺口探针中的探针区之间可以有间隔区，也可以没有。“间隔区”是指在两个探针区之间的核苷酸序列，如果在靶标核苷酸序列上的相应靶标区之间存在间插序列，则间隔区与间插序列之间不是基本上互补的。如果在靶标核苷酸序列上的靶标区与CTZ之间存在非互补区带，则“间隔区”也不是基本上互补于非互补区带。探针：靶标杂交体是包括诊断探针与靶标核苷酸序列稳定杂交的复合体。
可对探针或靶标序列进行标记。直接的荧光化合物、生物素、FITC或地高辛(Dig)可用作标记(tag)。对于非直接检测，可用荧光或酶联抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白(Avidine/Strepavidine)(用于检测生物素)、抗-FITC抗体(用于检测FITC)、抗-Dig抗体(用于检测Dig)来作检测之用。根据一个实施方式，用羧基基团进行修饰的乳胶珠(latexbead)可用于固定探针。在珠上的羧基首先用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)进行活化，然后EDC-活化羧基基团与寡聚探针5’端的氨基基团进行反应。另外一个实施方式是用氨基与氨基、硫酸基与氨基进行连接，及使用其它化学物质。
通过下面描述性的实施例可以进一步理解本发明的其它方面和优点。
                          实施例1
在该实施例中，根据本发明单个的缺口探针包括第一探针区和第二探针区，用于将HLA DRB1*0308和HLA DRB1*1107等位基因与其它等位基因区别开来。而常规探针，OLR4040(5’-GCCTGATGAGGAGTACTG-3’)(SEQ ID NO：5)是设计用于检测DRB1第58位氨基酸密码子的GAG。探针OLR4093-2(5’-AAGCGGGGCCGGGTG-3’)(SEQ ID NO：6)可以识别 AAG CGGGGC(SEQ ID NO：8)的互补序列，该序列位于DRB1的第71-72位氨基酸处。然而，HLA DRB1*0308和HLA DRB1*1107等位基因均包含了这两个探针的序列而均能发生杂交。因而，这些等位基因使得在分析DRB1杂合性反应时产生许多不明确的结果。表1列出了这些DRB1等位基因和缺口探针及用于检测它们的常规探针序列之间的关系。
表1显示等位区域和探针序列的序列特征。在该实施例中的等位基因包含两个序列区即分别称为“区域1”和“区域2”。并显示了对于每一个区域的氨基酸位置。表中序列是从左到右的顺序，当达到一行的末端或双斜线“//”时(以先终止的为准)则就是序列末端。而且序列是连续的。例如，参照(等位基因)包含SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。SEQ ID NO：1是连续的序列，相应于区域1，开始于“CGG”而末端为“TGG”，并终止于“//”。SEQ ID NO：2作为连续序列，相应于区域2，开始于“GAG”而末端为“GTG”。
对于除参照序列之外的其它序列类型，当出现“-”时，则表示该特定序列包含的这个核苷酸碱基与参照(等位基因)相应的位置相同。当出现核苷酸字母而不是“-”时，则表示该特定序列包含的是字母所示核苷酸碱基而不是对照(等位基因)相应位置的碱基。当既不是“-”也没有出现字母时，则该特定序列不包括相应位置的核苷酸碱基。表中序列直接按顺阅读直到“//”或该行的末端，不管哪一个先出现均形成连续序列。(在有些表中，某一行可能延续到下一页。)。对于探针而言，由于不存在“//”，故其序列直接按顺序排列而成为一个连续的序列，而不同于等位基因中被分隔开的两个各别的连续序列。
探针OLR-4431-3包括一个中间区(inter-region)。中间区与等位基因序列不相应，而是人工序列。人工序列的例子包括诊断探针上的“间隔区”，如探针OLR-4431-3的“TTTT”。多于一个的等位基因可能共同拥有一个特定的序列编号(ID number)，因为等位基因在特定区域具有共同的序列。例如，表1中的对照等位基因DRB1*0101和DRB1*03011的等位基因系列均在区域1具有共同的序列，即相应于SEQ ID NO：1。然而，这两个等位基因在区域2相应部分的序列有差别。
上述关于表1中的结构说明同样适用于表3、5、7、9和11。
                           表1  DRB1等位基因靶标序列和探针序列的比较
序列类型 序列名称和相应的有关序列ID编号 区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置) 中间区 区域2(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
  55   56   57   58   59   60   61   69   70   71   72   73   74   75
参照等位基因 DRB1*0101(SEQ ID NOS：1和2) CGG CCT GAT GCC GAG TAC TGG // GAG CAG AGG CGG GCC GCG GTG
等位基因 DRB1*0415，DRB1*11011/012/041/042/05/06/081/082/09/10/121/122/13/15/18/19/22/24/26-30/34/37/39(SEQ ID NOS：3和2) --- --- --- -AG --- --- --- // --- --- --- --- --- --- ---
等位基因 DRB1*0308，DRB1*1107(SEQIDNOS：3和4) --- --- --- -AG --- --- --- // --- --- -A- --- -G- CG- ---
等位基因 DRB1*03011/012/021/022/03-07/09/14-16/18，DRB1*0422，DRB3*0204(SEQ ID NOS：1和4) --- --- --- --- --- --- --- // --- --- -A- --- -G- CG- ---
探针 OLR-4040(SEQ ID NO：5) - --- --- -AG --- --- ---
                                  表1    DRB1等位基因靶标序列和探针序列的比较
序列类型   序列名称和相应的有关序列ID编号 区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置) 中间区 区域2(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
    55     56     57     58     59     60     61     69     70     71     72     73     74     75
 参照等位基因 DRB1*0101(SEQ ID NOS：1和2) CGG CCT GAT GCC GAG TAC TGG // GAG CAG AGG CGG GCC GCG GTG
探针 OLR-4043-2(SEQ ID NO：6) -A- --- -G- CG- ---
探针 OLR-4431-3(SEQ ID NO：7) --- --- -AG --- --- TTTT -- --- -A- --- -G
由DRB1*0308和DRB1*1107等位基因所造成的混淆(即检测结果无法分辨)，传统的解决办法是进行第二轮PCR，要么只扩增DRB1*03xx，要么只扩增DRB1*11xx，然后重复探针杂交过程。因此，将DRB1*0308和DRB1*1107与其它相似的那些等位基因在第一轮PCR和探针杂交中区别开来，以避免进一步的PCR和杂交，这是非常有好处的。
具体地说，HLA基因的扩增和与固定于微球体上的探针之间的DNA杂交反应可按如下方法进行。用包含大约1ng/微升的基因组DNA和10微摩尔相应的序列特异性生物素化的引物，按照事先确定的热循环程序来进行标准基因扩增反应。5微升的反应混合物中包含了扩增的HLA-DRB1外显子2区域，进行变性、中和后，与存在于1M NaCl和70mM磷酸钠缓冲液的固定有探针的微球体进行混合(每次实验中每个探针用1000微球体)。于60℃温育15分钟以进行杂交反应。向混合物中加入2倍体积的50nM NaCl溶液(预热到60℃)，并离心5分钟。在不破坏沉淀的微球体的情况下，去除上清液。重复洗涤步骤2次。
用3倍体积5微克每微升的藻红蛋白-链霉素抗生素共轭体对杂交后的DNA进行标记。标记的混合物在60℃温育5分钟后，按上述方法进行洗涤。洗涤后的微球体重悬于80微升50nM NaCl中。用Luminex 100 Flow Analyzer在580nm下对注入的微球体进行激发、检测和计数荧光信号，而获得杂交信号。在每次实验中用大约100-200微球体进行分析以计算出每个探针的中值荧光强度(MFI)。获得每个探针的MFI后即可利用合适的阳性对照探针的MFI计算出相对杂交信号。
阳性对照探针可以识别在所有等位基因上的非多态性区域，该区域可通过特异性引物进行扩增。本发明中所述的靶标核酸链包括经聚合酶链式反应PCR扩增出的等位区域。阳性对照探针用于提供参照信号，以便估计扩增的DNA(扩增子，amplicon)在量上的差异。阳性对照信号用于计算所有诊断探针的相对信号，即诊断探针信号相对于阳性对照信号的百分率。对于DRB1的外显子2，所用的阳性对照探针序列是5’-ggAACAgCCAgAAggAC-3’(SEQ ID NO：9)。
根据本发明，称为OLR4431-3的缺口探针具有的序列为：5’-CTGATGAGGAGTACTTTTAGCAGAAGCGGGG-3’(SEQ ID NO：7)，其包括了两个探针区以对靶标核酸序列进行杂交(包括DRB1*0308和DRB1*1109)。第一个探针区即CTGATGAGGAGTAC(SEQ ID NO：10)可以与第一靶标区杂交，第二探针区即AGCAGAAGCGGGG(SEQ IDNO：11)可以与第二靶标区杂交。两个探针区之间由4个T所隔开，这4个T序列不与靶标序列杂交。对于在第58位密码子只含有GAG而没有第71-73位密码子的AAG CGG GGC(SEQ ID NO：8)序列的DRB1，利用该缺口探针所得到的荧光信号＜1％，因而有效排除了这种DRB1所产生的假阳性信号。该探针与第71-73位有AAG CGGGGC(SEQ ID NO：8)而第58位不含有GAG的DRB1等位基因也可产生＜20％荧光信号。在下面的表2中所显示的数据中，所述缺口探针与包含DRB1*0308的样品可产生几乎90％的阳性对照探针信号强度。相应地，可容易的建立确定阳性反应的转折点(通常是阳性对照最低值和阴性对照最高值之间的中间值)。考虑到在骨髓捐赠人登记时，检测所需要的样品数量，根据上述提供的方法可以区分DRB1*0308和DRB1*1107是否存在，那么可明显节约时间和成本。
                 表2.探针的荧光信号强度，与对照探针比较
         ％(被测探针信号/对照探针信号)
  细胞ID号   DRB1等位基因   OLR-4040(常规)   OLR-4093-2(常规)  OLR-4431-3(常规)
  GN0090   0308，0405   37.4   16.2  88.3
  TER227   03021，03021   0.0   31.7  16.4
  TER118   0301，1202   0.0   22.9  14.3
  TER087   0301，0803   0.0   20.4  11.9
  TER156   1104，1404   35.1   0.1  0.7
  TER119   1101，0101   26.3   0.0  0.5
  TER083   1102，0404   26.1   0.0  0.4
                  实施例2
在用SSO方法来进行检测中，在HLA-A位点的血清学水平DNA类型中有如下两个最常导致检测结果不明确的原因。第一个是，A*03011和A*2501杂合体与A*3204和A*6601杂合体具有很高频率的相同反应模式。第二个是，A*3201和A*6601杂合体与A*2502和A*7401杂合体具有很高频率的相同反应模式。用可以识别只存在于A*2501和A*2502中的两个靶标区的特异性探针将极大的减少在对上述杂合体进行检测中的第二轮检测。
在这个实施例中，单个的缺口诊断探针即A166-2，由一个短的间隔区所隔开的两个探针区组成，可将A*2501-2504的一些基因型与相当多的其它HLA-A基因型区分开来。下面的表3列出了这些HLA-A等位基因序列和用于检测它们的缺口探针和常规探针序列之间的关系。利用其中的两个常规探针可确定基因组中是否存在两个靶标区，但不能确定这些靶标区是否位于等位基因对中的同一条(cis)或不同条的(trans)等位基因上。探针A104-11，具有一个识别序列，可确定约第62位密码子到约第68位密码子所显示的靶标核酸序列(表3)是否存在。探针A150-19，也只具有一个识别序列，可确定约第77位密码子到约第85位密码子所显示的靶标核酸序列(表3)是否存在。
                        表3  HLA-A等位基因靶标序列和探针的序列的对比
  序列类型   序列名称和相应的有关序列ID编号     区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
  61   62   63   64   65   66   67   68   69
  参照等位基因   A*0101(SEQ ID NOS：12和13)   GAC   CAG   GAG   ACA   CGG   AAT   ATG   AAG   GCC     //
  等位基因   A*2424，A*2501-04(SEQ ID NOS：14和16)   ---   -G-   A-C   ---   ---   ---   G--   ---   ---     //
  等位基因   A*6601(SEQ ID NOS：14和13)   ---   -G-   A-C   ---   ---   ---   G--   ---   ---     //
  等位基因   A*3201(SEQ ID NOS：15和16)   ---   ---   ---   ---   ---   ---   G--   ---   ---     //
  等位基因   A*0301(SEQ ID NOS：15和13)   ---   ---   ---   ---   ---   ---   G--   ---   ---     //
  等位基因   A*68012(SEQ ID NOS：14和13)   ---   -G-   A-C   ---   ---   ---   G--   ---   ---     //
探针   A166-2(SEQ ID NO：17)   -G-   A-C   ---   ---   -     TTTT
探针   A104-11(SEQ ID NO：18)   G-   A-C   ---   ---   ---   G-   ---
探针   A150-19(SEQ ID NO：19)
                                     表3  HLA-A等位基因靶标序列和探针的序列的对比(续)
  序列类型   序列名称和相应的有关序列ID编号 区域2(第一行中的数字是指与下面行的核苷酸相关的氨基酸位置)
    77   78   79   80   81   82   83   84   85
  参照等位基因   A*0101(SEQ ID NOS：12和13)     C   CTG   GGG   ACC   CTG   CGC   GGC   TAC   TAC
  等位基因   A*2424，A*2501～04(SEQ ID NOS：14和16)     -   ---   C--   -T-   GC-   -T-   C--   ---   ---
  等位基因   A*6601(SEQ ID NOS：14和13)     -   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---
  等位基因   A*3201(SEQ ID NOS：15和16)     -   ---   C--   -T-   GC-   -T-   C--   ---   ---
  等位基因   A*0301(SEQ ID NOS：15和13)     -   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---
  等位基因   A*68012(SEQ ID NOS：14和13)     -   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---
探针   A166-2(SEQ ID NO：17)   --   -T-   GC-   -T-   C-
探针   A104-11(SEQ ID NO：18)
探针   A150-19(SEQ ID NO：19)    -   ---   C--   -T-   GC-   -T-   C--   ---   ---
          表4.HLA-A探针的荧光信号强度，与对照探针比较
    ％(被测探针信号/对照探针信号)
  细胞ID号   HLA-A等位基因   A166-2     A104-11     A150-19
  9008   2501   61.9％     87.3％     38.9％
  TER250   2501，68012   46.8％     90.5％     29.2％
  9057   6601   0.0％     72.5％     0.0％
  9035   3201   0.0％     0.001％     56.7％
  TER259   3201，6802   0.0％     91.4％     32.8％
缺口探针与两个靶标区的结合表明存在着两个靶标区以顺式存在的等位基因，其中。该结果可将其与两个靶标区虽然都存在但为反式的等位基因区别开来。对于反式存在的两个靶标区，常规探针可以与它们各自的靶标区结合，但缺口探针则不会结合，因为对两个靶标区中的一个所具有的亲合力不足以在这些杂交条件下形成稳定的结合。因而，例如，可以区分基因型A*2501/A*03011的等位基因对与基因型A*3204/A*6601的等位基因对。A166-2只结合至少含有一个A*25等位基因的样品，而A104-11和A150-19都能结合两种等位基因对的DNA。
探针A104-11可以与任何包含相应HLA-A靶标序列(在该实验中的等位基因A*2501、A*68011、A*6601和A*6802)的DNA(9008、Ter250、9057和Ter259)进行很好的结合。A150-19可以与任何包含相应靶标序列(在该实验中的等位基因A*2501和A*3201)的DNA(9008、Ter250、9035和Ter259)进行很好的结合。单独用这两个常规探针A104-11和A150-19不能区分下述DNA：即不能确定是以反式包含这两种靶标序列的杂合DNA，例如Ter259(A*2501/A*6802)，还是以顺式包含这两靶标序列的DNA(纯合A*2501)或Ter250(杂合A*2501)。然而，A166-2只对包含顺式构型DNA 9008(61.9％)和Ter(46.8％)的A*2501有很好的结合。对于A位点的外显子2，所用的阳性对照序列为5’-gCTACTACAACCAgAgCgAg-3’(SEQ ID NO：20)。
                     实施例3
在本实施例中，缺口探针即B204被用于确定识别序列是否以顺式存在。下面的表5列出了这种等位基因和其它HLA-B等位基因及用于检测它们的缺口探针和常规探针之间的序列关系。DNA#1067包含等位基因B*1521，包含了探针B106的靶标区，但没有B153的靶标区。反向(conversely)DNA的#1064和Ter244纯合的包含了探针B153的靶标区的等位基因。DNA#124包含探针B106和B153在HLA-B中的靶标区。然而，探针B204的信号对于这些DNA而言呈阴性，因为每个靶标区都位于不同的等位基因上，即以反式构型存在。探针B204的信号对于Ter250 DNA(等位基因B*1523)和9035(B*3801)而言呈阳性，因为它们包含的靶标区在同一个等位基因上，即以顺式构型存在。
针对第64-68位氨基酸密码子序列的探针B106可以识别至少73个HLA-B位点的等位基因。然而，如果针对第79-83位氨基酸密码子序列的探针B153作为缺口探针的一部分则大约只有5个HLA-B等位基因可被B204缺口探针所识别，从而利用缺口探针提高了SSO系统的分辨率。
                     表5  HLA-B等位基因靶标序列和探针序列的比较
  序列类型    序列名称和相应的有关序列ID编号            区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)   中间区               区域2(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
64  65  66  67  68  69  70   77   78   79   80   81   82   83
  参照等位基因   A*0101(SEQ ID NOS：21和22) ACA  CGG  AAT  ATG  AAG  GCC  CAC   //   AAC   CTG   GGG   ACC   CTG   CGC   GGC
  等位基因   B*1523，B*3801(SEQ ID NOS：23和24) ---  -A-  -TC  TGC  ---  A--  A--   //   ---   ---   C--   -T-   GC-   -T-   C--
  等位基因   B*1401，B*1521，B*3901(SEQ ID NOS：23和25) ---  -A-  -TC  TGC  ---  A--  A--   //   -G-   ---   C--   -A-   ---   ---   ---
  等位基因   B*51011，8*5301(SEQ ID NOS：26和24) ---  -A-  -TC  T-C  ---  A--  A--   //   ---   ---   C--   -T-   GC-   -T-   C--
  等位基因   B*5501(SEQ ID NOS：27和25) ---  -A-  -TC  TAC  ---  ---  --G   //   -G-   ---   C--   -A-   ---   ---   ---
  等位基因   B*4601(SEQ ID NOS：28和25) ---  -A-  --G  TAC  ---  CG-  --G   //   -G-   ---   C--   -A-   ---   ---   ---
  探针   B204(SEQ ID NO：29) ---  -A-  -TC  TGC  ---  TTT   ---   -T-   GC-   -T-   C-
  探针   B153(SEQ ID NO：30)   --   ---   C--   -T-   GC-   -T-   C
  探针   B106(SEQ ID NO：31) ---  -A-  -TC  TGC  ---  A--
                     表6 HLA-B探针的荧光信号强度，与对照探针比较
            ％(被测探针信号/对照探针信号)
  细胞ID号     HLA-B等位基因     B204     B153     B106
  9035     3801/3801     108.6％     117.0％     122.5％
  TER250     1523/5501     85.7％     90.6％     191.1％
  #124     1401/51011     1.8％     71.3％     57.6％
  #1064     5301/5301     1.6％     115.3％     0.0％
  TER244     51011/51011     1.7％     125.1％     0.0％
  #1067     1521/4601     0.74％     0.25％     65.9％
在表6中，探针B153的信号很强表明它可以识别存在于DNA 9035、Ter250、#124、#1064和Ter244中的HLA-B靶标序列，这些DNA分别相应于等位基因B*3801、B*1523、B*51011、B*5301和B*51011。相似地，B106可识别存在于DNA 9035、#124、#1067中靶标序列，这些DNA分别相应于等位基因B*3801、B*1523、B*1401和B*1521。用这两个常规探针不能分辨靶标序列是以反式构型存在如DNA#124(B*1401/B51011)，还是以顺式构型存在如DNA9035(B*3801)或Ter250(B*1523)。探针B204只针对9035(B*3801)和Ter250(B*1523)具有强的信号，这表明两个分隔开的靶标序列以顺式构型存在。对于B位点的外显子2，所用的阳性对照序列是5’-gCTACTACAACCAgAgCgA-3’(SEQ ID NO：32)。
                            实施例4
在该实施例中涉及HLA classII的DQB1位点。探针DQ25-8可识别靶标序列即DQB1*05031和DQB1*06011的特征序列，而DQ33可识别分隔开的DQB1*05031和DQB106011的特征序列。然而，利用探针DQ54G-3只可识别以顺式存在的上述两个探针区，可确定DQB105031是否是上述两个等位基因中的一个。下面的表7列出了这些HLA-DQB1等位基因及用于检测它们的缺口探针和常规探针之间的序列关系。
                           表7  HLA-DQB1等位基因靶标序列和探针序列的比较
序列类型 序列名称和相应的有关序列ID编号 区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置) 中间区 区域2(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
  52   53   54   55   56    57   58     59   68   69   70   71   72   73   74
参照等位基因 DQB1*05011(SEQID NOS：33和34)   CCG   CAG   GGG   CGG   CCT    GTT   GCC  GAG   //   CTG   GAG   GGG   GCC   CGG   GCG   TCG
等位基因 DQB1*05031(SEQID NOS：35和34)   ---   ---   ---   ---   ---    -AC   ---   //   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---
等位基因 DQB1*06011(SEQID NOS：35和36)   ---   ---   ---   ---   ---    -AC   ---   //   ---   ---   A--   A--   --A   ---   GA-
等位基因 DQB1*05011(SEQID NOS：33和34)   ---   ---   ---   ---   ---    ---   ---   //   ---   ---   ---   ---   ---   ---   ---
探针 DQ54G-3(SEQ IDNO：37)   ---   ---    -AC   ---   TTTT   ---   ---   ---   ---
探针 DQ25-8(SEQ IDNO：38)   -   ---   ---   ---   ---    -AC   --
探针 DQ33(SEQ ID NO：39)   --   ---   ---   ---   ---   ---   ---
             表8.HLA-DQB1探针的荧光信号强度，与对照探针比较
    ％(被测探针信号/对照探针信号)
  细胞ID号   HLA-B等位基因   DQ54G-3    DQ25-8     DQ33
  TER145   05031/05031     34.9％     34.1％     39.5％
  TER68   0201/05031     29.5％     25.2％     26.9％
  TER74   0502/0601     0.0％     28.4％     27.1％
  TER87   0201/0601     0.0％     39.1％     0.0％
  TER123   0201/0501     0.0％     0.0％     28.9％
表8中一些数据是HLA class II的DQB1位点中的一个例子。同样，常规探针DQ25-8对几个DNA-Ter145、Ter68、Ter74和Ter87的结合具有相对强的信号，其中这些DNA分别相应于等位基因DQB1*05031(纯合)、DQB1*05031(杂合)、DQB1*0601中存在的靶标序列。另外，DQ33对DNA-Ter145、Ter68、Ter74和Ter123的结合具有相对强的信号，其中这些DNA分别相应于等位基因DQB1*05031(纯合)、DQB1*05031(杂合)、DQB1*0502和DQB1*0501中存在的靶标序列。如前面的实施例中，利用这两个常规探针不能分辨识别位点是以反式还是以顺式构型存在，即不能将Ter74(DQB1 0502/DQB10601)(反式构型)与Ter145或Ter68区分开，而这两种等位基因均含有DQB1*05031。缺口探针DQ54G-3只识别以顺式构型存在的两个靶标序列，而只对包含DQB1*05031等位基因产生相对强的信号。对于DQB1位点的外显子2，所用的阳性对照序列是5’-gTCCCgTggTgAAgTAgCAC-3’(SEQ IDNO：40)和5’-gTCCCATTggTgAAgTAgCAC-3’(SEQ ID NO：41)。
                      实施例5
与实施例1相似，该实施例也涉及DRB1*0308，利用的是“半探针(half-probes)”，即探针具有比缺口探针OLR-04431-3更短的序列，即只含有两个探针区中的一个探针区。这些“半探针”(列于表9)与OLR-04431-3比较了对DRB1*0308、其它DRB1*03等位基因或DRB1*11等位基因作为样品的结合特性。下面的表9列出了这些DRB1等位基因及在该实验中使用的用于检测它们的缺口探针和半探针之间的序列关系。以DRB1*0308、其它DRB1*03等位基因或检测样品的DRB1*11等位基因，半探针不产生或几乎不产生信号(均＜1％)。OLR-04431-3也只对DRB1*0308 DNA产生强的信号(表10)。该实施例表明，在本实验中，短的单个识别位点序列本身是不能与任何DRB1*等位基因进行稳定的结合，而将它们装配起来成为单条序列时即能与DRB1*0308结合。在本实验中，单个的半探针对被测等位基因中识别序列的结合能力低于阈值。将“半探针”序列组合起来形成的探针，只对那些均包含了本实验中设计的两个半探针或探针区的靶标区的等位基因的结合能力可高于阈值。
                            表9  DRB1等位基因靶标序列和探针序列的比较
序列类型     序列名称和相应的有关序列ID编号      区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)     中间区        区域2(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
  55   56   57   58   59   60   61   69   70   71   72   73   74   75
参照等位基因     DRB1*0101(SEQ ID NOS：1和2)   CGG   CCT   GAT   GCC   GAG   TAC   TGG     //   GAG   CAG   AGG   CGG   GCC   GCG   GTG
等位基因     DRB1*0308，DRB1*1107(SEQ ID NOS：3和4)   ---   ---   ---   -AG   ---   ---   ---     //   ---   ---   -A-   ---   -G-   CG-   ---
探针     OLR4431-3(SEQ ID NO：7)   --   ---   -AG   ---   ---     TTTT   ---   ---   -A-   ---   -G
探针     OLR-4611(SEQ ID NO：42)   --   ---   -AG   ---   ---     TTTT
探针     OLR-4612(SEQ ID NO：43)   --   ---   -AG   ---   ---
探针     OLR-4613(SEQ ID NO：44)   ---   ---   -A-   ---   -G
探针     OLR-4614(SEQ ID NO：45)   ---   ---   -A-   ---
                      表10  探针的荧光信号强度，与对照探针比较
               ％(被测探针信号/对照探针信号)
    Cell ID     DRB1 Alleles     OLR-4431-3     OLR4611     OLR4612     OLR4613     OLR4614
    GN090     0308，0405     64.0％     0.0％     0.0％     0.1％     0.3％
    TER227     03021，03021     0.5％     0.0％     0.0％     0.6％     0.4％
    TER87     0301，0803     0.2％     0.0％     0.0％     0.3％     0.2％
    TER118     0301，1202     0.0％     0.0％     0.0％     0.0％     0.0％
    TER119     0101，1101     0.0％     0.0％     0.0％     0.1％     0.3％
    TER156     1104，1404     0.0％     0.0％     0.0％     0.0％     0.3％
表10显示缺口探针OLR4431-3只对来自GN090的DNA产生相对强的信号，该DNA包含DRB1*0308。OLR4611、OLR4612、OLR4613和OLR4616只含有OLR4431-3中两个缺口区中的一个区域。这些探针均不能对上述样品DNA产生任何识别信号。该实施例表明，两个探针区的协同结合是对预期靶标序列产生阳性信号所必需的。对于DQB1外显子2，所用的阳性对照探针序列是5’-ggAACAgCCAgAAggAC-3’(SEQ ID NO：46)。
                         实施例6
在该实施例中，缺口探针OLR4029-6可识别两个短的靶标区，即外显子2的近5’末端的15个碱基区(第12-16位密码子)和外显子2的近3’末端的12个碱基区(第68-71位密码子)，其中所述外显子2来自DRB1*16等位基因(表11)。这两个识别(靶标)区相距150个碱基。DRB1*16等位基因在外显子2的5’端与DRB1*15等位基因是相同的(表11)。(这两群等位基因实际上是“断裂基因”或者可认为是最初的DR2等位基因群的亚群。)为了鉴定基因型，利用单个探针而将DRB1*16群中的等位基因与DRB1*15群中的等位基因区分开来是非常有好处的。下面的表11列出了这些DRB1等位基因及用于检测它们的缺口探针之间的序列关系。
                             表11  DRB1等位基因靶标序列和探针的序列的对比
  序列类型   序列名称和相应的有关序列ID编号          区域1(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
  8   9     10   11   12   13   14   15   16
  参照等位基因   DRB1*0101(SEQ ID NOS：47和48)   TTG   TGG     CAG   CTT   AAG   TTT   GAA   TGT   CAT
  等位基因   DRB1*1501(SEQ ID NOS：49和50)   C--   ---     ---   -C-   ---   AGG   --G   ---   ---
  等位基因   DRBI*1502(SEQ ID NOS：49和50)   C--   ---     ---   -C-   ---   AGG   --G   ---   ---
  等位基因   DRB1*16011(SEQ ID NOS：49和51)   C--   ---     ---   -C-   ---   AGG   --G   ---   ---
  等位基因   DRB1*16021(SEQ ID NOS：49和52)   C--   ---     ---   -C-   ---   AGG   --G   ---   ---
探针   OLR-4029-6(SEQ ID NO：53)   -C-   ---   AGG   --G   ---
                    表11  DRB1等位基因靶标序列和探针的序列的对比(续)
  序列类型   序列名称和相应的有关序列ID编号     中间区           区域2(第一行中的数字是指下面一行中核苷酸的相关氨基酸位置)
    67   68   69   70   71   72   73
  参照等位基因   DRB1*0101(SEQ ID NOS：47和48)     //     CTC   CTG   GAG   CAG   AGG   CGG   GCC
  等位基因   DRB1*1501(SEQ ID NOS：49和50)     //     A--   ---   ---   ---   GC-   ---   ---
  等位基因   DRB1*1502(SEQ ID NOS：49和50)     //     A--   ---   ---   ---   GC-   ---   ---
  等位基因   DRB1*16011(SEQ ID NOS：49和51)     //     T--   ---   --A   G-C   ---   --C   ---
  等位基因   DRB1*16021(SEQ ID NOS：49和52)     //     ---   ---   --A   G-C   ---   --C   ---
探针   OLR-4029-6(SEQ ID NO：53)   ---   --A   G-C   ---
    表12.探针的信号强度，与对照探针比较
    细胞ID号     DRB1*基因类型     4029-6信号
    TER69     09012/1502     7.8％
    E18994     07011/1501     8.9％
    E10351     1303/16011     29.4％
    TER262     1413/16021     22.8％
    TER85     0801/1401     0.0％
    Hicks     0804/1101     0.1％
    TER160     0415/1301     0.0％
    AP630     03021/1201     0.0％
探针OLR4029-6确实显示了明显的信号而将DRB1*16与DRB1*15等位基因区分开来。在本实验中，对DRB1*16等位基因的信号是DRB1*15等位基因的2.5倍，虽然在两个靶标区之间有150个碱基所隔开(表12)。在5’端的DR2特异性序列可鉴别DRB1*15或DRB1*16，但不能产生足够强的信号(表12)。DRB1*16特异性序列与5’的DR2特异性信号协同而显著增强了对DRB1*16等位基因的信号(表12)。3’探针区本身不足以对DRB1*0801、DRB1*0804、DRB1*1101、DRB1*0415和DRB1*1201产生高于背景的信号。对于DQB1外显子2，所用的阳性对照探针序列是5’-ggAACAgCCAgAAggAC-3’(SEQ ID NO：9)。
       序列表
<110>ONE LAMBDA
<120>诊断探针检测系统
<130>27978/37504A
<140>To be assigned
<141>Herewith
<150>US 60/324,421
<151>2001-09-24
<160>53
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DRB*0101
<400>1
cggcctgatg ccgagtactg g                           21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DRB*0101
<400>2
gagcagaggc gggccgcggt g                           21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DRB1*0415，等位基因s DRB1*11011/01 2/041/042/05/0 6/081/082
/09/1 0/121/122/13/15/18/19/22/24/
26-30/34/37/39
<400>3
cggcctgatg aggagtactg g                21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DRB1*0308，DRB1*1107
<400>4
gagcagaagc ggggccgggt g                21
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>常规探针，OLR4040
<400>5
gcctgatgag gagtactg                    18
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>常规探针，OLR4040
<400>6
aagcggggcc gggtg                                  15
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gap探针，OLR4431-3
<400>7
ctgatgagga gtacttttag cagaagcggg g                31
<210>8
<211>9
<212>DNA
<213>人
<400>8
aagcggggc                                         9
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>阳性对照探针
<400>9
ggaacagcca gaaggac                                17
<210>10
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针区
<400>10
ctgatgagga gtac                                   14
<210>11
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针区
<400>11
agcagaagcg ggg                                    13
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*0101
<400>12
gaccaggaga cacggaatat gaaggcc                     27
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*0101
<400>13
cctggggacc ctgcgcggct actac                       25
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*2424，A*2501-2504
<400>14
gaccggaaca cacggaatgt gaaggcc                     27
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*0301
<400>15
gaccaggaga cacggaatgt gaaggcc                     27
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*2424，A82501~04
<400>16
cctgcggatc gcgctccgct actac                       25
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gap探针，A*68012
<400>17
cggaacacac ggattttgga tcgcgctccg                  30
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，A104-11
<400>18
ggaacacacg gaatgtgaag                             20
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，A150-19
<400>19
cctgcggatc gcgctccgct actac                       25
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>阳性对照探针
<400>20
gctactacaa ccagagcgag                             20
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*0101
<400>21
acacggaata tgaaggccca c                           21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因A*0101
<400>22
aacctgggga ccctgcgcgg c                           21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因B*1523，B*3801
<400>23
acacagatct gcaagaccaa c                           21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因B*1523，B*3801
<400>24
aacctgcgga tcgcgctccg c                           21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因B*1401，B*1521，B*3901
<400>25
agcctgcgga acctgcgcgg c                           21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因B*5501
<400>26
acacagatcttcaagaccaa c                            21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因B*5501
<400>27
acacagatct acaaggccca g                           21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因B*4601
<400>28
acacagaagt acaagcgcca g                           21
<210>29
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gap探针，B204
<400>29
acacagatct gcaagtttgg atcgcgctcc g                31
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，B153
<400>30
acctgcggat cgcgctcc                               18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针B106
<400>31
acacagatct gcaagacc                               18
<210>32
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>阳性对照探针
<400>32
gctactacaa ccagagcga                              19
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DQB1*05011
<400>33
ccgcaggggc ggcctgttgc cgag                        24
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DQB1*05011
<400>34
ctggaggggg cccgggcgtc g                           21
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DQB1*06011
<400>35
ccgcaggggc ggcctgacgc cgag                        24
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DQB1*06011
<400>36
ctggagagga cccgagcgga g                           21
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gap探针，DQ54G-3
<400>37
ggcctgacgc cgattttctg gagggggcc                   29
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，DQ25-8
<400>38
gcaggggcgg cctgacgc                               18
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，DQ33
<400>39
tggagggggc ccgggcgt                               18
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>阳性对照探针
<400>40
gtcccgttgg tgaagtagca c                           21
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>阳性对照探针
<400>41
gtcccattgg tgaagtagca c                           21
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因OLR-4611
<400>42
ctgatgagga gtactttt                               18
<210>43
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，OLR-4612
<400>43
ctgatgagga gtac                                   14
<210>44
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，OLR-4613
<400>44
agcagaagcg ggg                                    13
<210>45
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针，OLR-4614
<400>45
agcagaagcg gg                                     12
<210>46
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>阳性对照探针
<400>46
ggaacagcca gaaggac                                17
<210>47
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>参照序列
<400>47
ttgtggcagc ttaagtttga atgtcat                      27
<210>48
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>参照序列
<400>48
ctcctggagc agaggcgggc c                           21
<210>49
<211>27
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因s DRB1*1501和DRB1*1502
<400>49
ctgtggcagc ctaagaggga gtgtcat                     27
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因s DRB1*1501和DRB1*1502
<400>50
atcctggagc aggcgcgggc c                           21
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DRB1*16011
<400>51
ttcctggaag acaggcgcgc c                           21
<210>52
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<223>等位基因DRB1*16021
<400>52
ctcctggaag acaggcgcgc c                           21
<210>53
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Gap探针，OLR-4029-6
<400>53
cctaagaggg agtgtctgga agacagg                     27

Claims (9)

1.一种检测样品核酸链中靶标核酸序列存在的方法，包括如下步骤：
在杂交条件下，将被怀疑包含靶标核酸序列的样品与诊断探针进行接触；
其中所述诊断探针的核苷酸序列包含(1)位于诊断探针5’端的第一探针区，基本上互补于所述靶标核酸序列的特征性第一靶标区，和(2)位于所述第一探针区3’侧的第二探针区，所述第二探针区基本上互补于靶标核酸链的靶标核酸序列的特征性第二靶标区，其中当靶标核酸链上的所述第一靶标区与第二靶标区连续时，那么诊断探针上的第一和第二探针区由核酸间隔区所隔开，当诊断探针上的第一和第二探针区连续时，则靶标核酸链上的第一和第二靶标区之间存在着间插序列；
由此在所选择的杂交条件下，当第一探针区基本上互补于第一靶标区并且第二探针区基本上互补于第二靶标区时，第一和第二探针区能够使诊断探针与靶标核酸链稳定杂交，形成可检测的探针：靶标杂交体；
但在所选择的杂交条件下，当第一探针区不基本上互补于第一靶标区或第二探针区不基本上互补于第二靶标区时，诊断探针不能够与靶标核酸链稳定杂交，不能形成在指示稳定杂交的阈值之上的可检测的探针：靶标杂交体；和
检测稳定的探针：靶标杂交体的存在或不存在，作为样品中的是否存在靶标核酸序列的指标。
2.权利要求1的方法，其中诊断探针上的所述第一探针区和第二探针区由间隔区所隔开，其中间隔区的核酸序列不互补于所述靶标核酸上的第一靶标区和第二靶标区之间的样品核酸链序列。
3.权利要求2的方法，其中所述间隔区长度为1至30个碱基。
4.权利要求2的方法，其中所述间隔区长度为3至10个碱基。
5.权利要求1的方法，其中在靶标核酸序列上的所述第一靶标区与所述第二靶标区相距1至350个碱基。
6.权利要求1的方法，其中第一探针区和第二探针区分别与第一靶标区和第二靶标区完全互补。
7.权利要求2的方法，其中在所述靶标核酸上的第一靶标区和第二靶标区之间存在有间插序列。
8.权利要求1的方法，其中靶标核酸序列是一或多个人白细胞抗原(HLA)或T细胞受体(TCR)基因序列的特征序列。
9.权利要求1的方法，其中样品核酸链来自于人类。
CNB028232720A 2001-09-24 2002-09-24 诊断探针检测系统 Ceased CN1312289C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32442101P 2001-09-24 2001-09-24
US60/324,421 2001-09-24

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007100877390A Division CN101074450A (zh) 2001-09-24 2002-09-24 诊断探针检测系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1589331A CN1589331A (zh) 2005-03-02
CN1312289C true CN1312289C (zh) 2007-04-25

Family

ID=23263504

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028232720A Ceased CN1312289C (zh) 2001-09-24 2002-09-24 诊断探针检测系统
CNA2007100877390A Pending CN101074450A (zh) 2001-09-24 2002-09-24 诊断探针检测系统

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007100877390A Pending CN101074450A (zh) 2001-09-24 2002-09-24 诊断探针检测系统

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8512953B2 (zh)
EP (2) EP1430150B1 (zh)
JP (1) JP2005504281A (zh)
CN (2) CN1312289C (zh)
AU (1) AU2002327046B2 (zh)
BR (1) BR0212773A (zh)
CA (1) CA2460759C (zh)
WO (1) WO2003027309A2 (zh)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1312289C (zh) * 2001-09-24 2007-04-25 一兰姆达公司 诊断探针检测系统
AU2003235894A1 (en) * 2002-05-08 2003-12-12 Arkray, Inc. Method of detecting target nucleic acid
GB2395556A (en) * 2002-11-22 2004-05-26 Dynal Biotech Ltd Nucleic acid probe
GB2395557A (en) * 2002-11-22 2004-05-26 Dynal Biotech Ltd Nucleic acid probes
CA2524572C (en) 2003-05-01 2018-07-10 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides comprising a molecular switch having enhanced sensitivity to the presence of a mismatch
US8193331B2 (en) 2003-12-25 2012-06-05 Canon Kabushiki Kaisha Probe set and method for identifying HLA allele
EP1816195A4 (en) * 2004-11-19 2009-06-03 Wakunaga Pharma Co Ltd NUCLEIC ACID FRAGMENTS FOR DETECTING NUCLEIC ACID AND METHOD FOR DETECTING NUCLEIC ACID
JP2006166911A (ja) * 2004-11-19 2006-06-29 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 核酸検出用核酸断片および核酸検出方法
EP1856280A4 (en) * 2005-01-12 2009-09-09 Applera Corp COMPOSITIONS, METHODS AND KITS FOR SELECTIVE AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
WO2007011902A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Applera Corporation Methods for rna profiling
GB0703997D0 (en) 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Methods for detecting nucleic sequences
GB0703996D0 (en) 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Nucleic acid detection
JP5143450B2 (ja) * 2007-03-14 2013-02-13 斉 大戸 Ｈｌａ−ｂローカスにおける新規アリル
EP2152908B1 (en) 2007-05-03 2017-03-15 One Lambda, Inc. Methods of screening for binding interaction using sets of microparticles and unique probes
US9752191B2 (en) 2009-07-09 2017-09-05 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with chronic allograft nephropathy
US8409802B2 (en) 2009-08-14 2013-04-02 Roche Molecular Systems, Inc. Format of probes to detect nucleic acid differences
KR20160039229A (ko) 2013-07-30 2016-04-08 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 정량적 dna-기반 영상화 및 초해상도 영상화
US11104951B2 (en) 2014-05-22 2021-08-31 The Scripps Research Institute Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries
US10443100B2 (en) 2014-05-22 2019-10-15 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection
US11512343B2 (en) 2014-12-19 2022-11-29 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide probe for detecting single nucleotide polymorphism, and method for detecting single nucleotide polymorphism
CN107828889B (zh) * 2017-11-13 2021-06-11 首都医科大学附属北京儿童医院 一种用于hla-drb1*03基因定性检测的pcr扩增引物及试剂盒
US10323272B1 (en) * 2018-01-31 2019-06-18 Enzo Biochem, Inc. Nucleic acid probes for in situ hybridization
US11851701B2 (en) 2018-03-15 2023-12-26 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide probe for detecting single nucleotide polymorphisms, and method for determining cis-trans configuration
EP3833757A4 (en) 2018-08-10 2022-05-18 City of Hope PROGRAMMABLE CONDITIONAL SIRNAS AND USES THEREOF
EP4367673A1 (en) * 2021-07-06 2024-05-15 Switch Therapeutics Inc. Methods of generating core strands in conditionally activatable nucleic acid complexes

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4835098A (en) * 1985-09-04 1989-05-30 Regents Of University Of Minnesota Characterization of HLA alleles with locus-specific DNA probes
US4946773A (en) * 1985-12-23 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Detection of base pair mismatches using RNAase A
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
CA1338457C (en) 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
US6031091A (en) * 1987-09-21 2000-02-29 Gen-Probe Incorporated Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US5296351A (en) 1988-10-20 1994-03-22 Alexander A. Morley Method for diagnosis of monoclonality in leukaemia and lymphoma
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
JP3595841B2 (ja) 1992-12-04 2004-12-02 サーナ セラピューティクス，インコーポレイテッド リボザイム増幅診断用薬
US6207373B1 (en) * 1998-02-25 2001-03-27 Nanogen, Inc. Methods for determining nature of repeat units in DNA
US5518884A (en) * 1994-02-28 1996-05-21 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid sequences specific for mycbacterium kansasii
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods
US5854033A (en) * 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5589322A (en) * 1995-12-12 1996-12-31 Eastman Kodak Company Process for making a direct dispersion of a photographically useful material
DE69637518D1 (de) * 1995-12-22 2008-06-19 Dade Behring Marburg Gmbh Homogene vervielfältigung und nachweis von nukleinsäuren
US5785835A (en) 1996-04-12 1998-07-28 One Lambda Electrophoresis method and devices
US5780233A (en) * 1996-06-06 1998-07-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Artificial mismatch hybridization
US6194149B1 (en) * 1998-03-03 2001-02-27 Third Wave Technologies, Inc. Target-dependent reactions using structure-bridging oligonucleotides
US6207379B1 (en) * 1998-09-11 2001-03-27 One Lambda Method for amplification of DNA
AU5495600A (en) 1999-06-17 2001-01-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Oligonucleotide arrays for high resolution hla typing
US6806051B2 (en) * 2000-09-25 2004-10-19 Picoliter Inc. Arrays of partially nonhybridizing oligonucleotides and preparation thereof using focused acoustic energy
US6350580B1 (en) * 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
US6573051B2 (en) * 2001-03-09 2003-06-03 Molecular Staging, Inc. Open circle probes with intramolecular stem structures
AU2002365028A1 (en) * 2001-07-17 2003-06-30 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using multi-subunit probes
CN1312289C (zh) * 2001-09-24 2007-04-25 一兰姆达公司 诊断探针检测系统

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5424413A (en) * 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1430150A2 (en) 2004-06-23
BR0212773A (pt) 2004-10-13
AU2002327046B2 (en) 2007-11-29
CN101074450A (zh) 2007-11-21
US8512953B2 (en) 2013-08-20
CA2460759A1 (en) 2003-04-03
US9988671B2 (en) 2018-06-05
CA2460759C (en) 2011-05-31
WO2003027309A2 (en) 2003-04-03
WO2003027309A3 (en) 2003-10-16
EP1430150B1 (en) 2015-08-19
EP1430150A4 (en) 2005-02-02
CN1589331A (zh) 2005-03-02
EP2980222A1 (en) 2016-02-03
US20130330725A1 (en) 2013-12-12
JP2005504281A (ja) 2005-02-10
US20030165925A1 (en) 2003-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1312289C (zh) 诊断探针检测系统
JP4216333B2 (ja) オリゴヌクレオチドの化学結合による核酸検出及び増幅
CN1189573C (zh) 多核苷酸序列变异的微阵列型分析
JP5286283B2 (ja) 一塩基変異多型（ｓｎｐ）を判別する方法
EP1256632A2 (en) High throughput polymorphism screening
JP6234463B2 (ja) 核酸の多重分析の方法
WO2009140802A1 (zh) 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途
CN1824786A (zh) 基于连接的选择性扩增方法
AU2002327046A1 (en) Diagnostic probe detection system
US20070065847A1 (en) Degeneratively Labeled Probes
US20060216723A1 (en) High through-put detection of pathogenic yeasts in the genus trichosporon
EP2748320A2 (en) Compositions, methods, and kits for nucleic acid hybridization
CN108060213A (zh) 基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点用探针和试剂盒
CN107937493B (zh) 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物
CN114606335A (zh) 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用
US20030154033A1 (en) Methods and compositions for detecting differences between nucleic acids
CN101065483B (zh) 碱基多态性的鉴定方法
WO2009121091A1 (en) Mapping method for polyploid subjects
CN101280338B (zh) 一种检测核酸多态性的核酸扩增方法
Jang et al. Multiplex genotyping of cytokine gene SNPs using fluorescence bead array
KR20160129967A (ko) 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법
Asari et al. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphisms using 3′ nucleotide differences in ligase detection reaction probes
US20030129598A1 (en) Methods for detection of differences in nucleic acids
CN101812515A (zh) 一种核酸突变的检测方法
Scott et al. A review of current methods in DNA fingerprinting

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070425

Termination date: 20100924

C35 Partial or whole invalidation of patent or utility model
IW01 Full invalidation of patent right

Decision date of declaring invalidation: 20080801

Decision number of declaring invalidation: 11963

Granted publication date: 20070425