CN1306819A - 靛红防治老年神经疾病药物的制备 - Google Patents

Abstract

靛红防治老年震颤麻痹和癫痫的神经疾病药物的制备,为中老年人提供保护大脑神经元免受环境污染等伤害因子的侵害、抗氧化抗衰老以预防和治疗震颤麻痹运动失调、癫痫等神经障碍的专用制品。本发明是根据预防和治疗的目的不同而采用不同剂量和剂型,根据动物药理和临床药理以及药剂学的最新研究成果而设计的一种可供口服的,具有新用途且经济实用、毒性低的新型药剂。

Description

靛红防治老年神经疾病药物的制备

本发明涉及中药青黛中靛红(isatin)成分制备在医药方面的新用途，属于中药应用技术领域。

靛红系著名中药青黛中的一种成份，在人体尿液和海洋生物中也发现含该物质，现可人工合成，1974年曾发现靛红有降血脂作用(美国专利US3803319)。最近，我们发现靛红系人脑内内源性天然单胺氧化酶B(MAO-B)抑制因子，具有多种中枢神经活性(药学学报.1999,34；1)。

人口老龄化是新世纪世界多数国家面临的社会问题。随年龄增加，脑神经元变性坏死可致多种疾病，如老年震颤麻痹、痴呆、癫痫等症。老年震颤麻痹又称帕金森氏症，我国目前至少500万人患此症。最新理论认为该病因系中枢多巴胺神经元受环境污染，如MPTP等致病因子所毒害，MPTP在MAO-B作用下产生MPP⁺导致多巴胺神经细胞死亡，从而引起震颤麻痹。随年龄增加，靛红排泄增加，而MAO-B活性也相应增加，从而更易致多巴胺神经细胞死亡而患病。我们经潜心研究证明，靛红作为内源性MAO-B特异性抑制因子，有阻止致病因子的氧化、保护神经元并促进多巴胺释放等显著药理作用。

本发明说明书分制备方法、动物药效实验、毒性实验和临床实验四部分。本发明的目的是用合成的靛红制备一种抗老化、抗大脑衰老，专供用于预防和治疗老年震颤麻痹、癫痫等有关神经和运动疾病的保健及治疗药制剂。制备剂型分两种：胶囊剂和片剂。在16名志愿者口服3-6个月的实验结果证明服用药物(胶囊)组与对照组，根据Webste评分比较，有明显改善作用。

为实现上述发明目的，本发明主要原料是采用人工合成的靛红，上述原料可通过用超纯水和无水乙醇1∶1-8配合，加热，冷却，反复重结晶，制备出高纯度不含重金属的针状橘红色结晶，再将纯净靛红根据胶囊剂和片剂要求进行制备。第一部分本发明的制备方法1．取人工合成的靛红100克溶于超纯水和无水乙醇按1∶1-8的比例配好的溶媒中，缓慢在磁性搅拌器上加热50-80℃至溶解，然后逐渐冷却，即得针形橘红色结晶。滤去上清液另作他用，按上述方法再反复进行1-3次，挥去乙醇，干燥备用。滤出的上清液可收集，蒸馏挥去乙醇浓缩滤除水，干燥残渣部分，可作为靛红供再次按上述方法重结晶，提取纯品。按上述方法反复操作1-3次可提高结晶纯度达99％。制备时应避光。2．将上述原料研磨成粉末过80目筛，以1∶1-10倍药用淀粉混匀，制成50，100mg两种规格的胶囊供药用。3．将上述原料研磨成粉末过80目筛，按湿颗粒法压片，分为50,100mg两种规格。

低剂量50-100mg/日作为给中老年保健用药，预防震颤麻痹发病；较高剂量100-300mg/日作为帕金森氏病患者治疗药，可保护大脑多巴胺神经元并提高脑内多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5羟色胺(5-TH)等神经递质水平，从而达到抗衰老抗氧化保护大脑多巴胺神经元目的，起到保健和治疗双重作用。

服用方法：预防保健、抗衰老时可应用胶囊或片剂，每人每日50-100mg，治疗震颤麻痹时可用胶囊或片剂每人每日100-300mg，可分2-3次饭后服用。

实施例1：片剂的制备

              靛红               50g

              乳糖              300g

              微晶纤维素        110g

              羧甲醛纤维素钙     10g

              无水硅酸           10g

              羧基丙酰纤维素     15g

              硬脂酸镁            5g

                              共500g

各自称量出上述各种成份，将靛红结晶过80目筛的粉末、乳糖、羧甲基纤维钙和无水硅酸均一混合，然后用异丙醇溶解羧基丙酰纤维素，把上述5种成份混合，用湿式法制粒，将制成的颗粒和硬脂酸镁混合，制成每片含50mg和100mg靛红的两种片剂。

实施例2：胶囊的制备

                靛红       50g

                淀粉      445g

                硬脂酸镁    5g

                        共500g各自称量出上述各成份，与过80目筛的靛红结晶粉末混合均匀，慎充胶囊，制成每个含50mg和100mg靛红的两种胶囊剂。第二部分药效实验(一)ISA抗癫痫研究

1．对大鼠杏仁核点燃的影响

2．对小鼠最大电休克的影响

3．对戊四氮惊厥的抑制作用

4．对氨基脲惊厥的抑制作用(二)ISA抗帕金森氏病(震颤麻痹症)研究

1．在MPTP模型对多巴胺能神经元的保护作用

2．对6-OHDA损毁大鼠旋转行为的影响(一)ISA抗癫痫研究

1．ISA对大鼠杏仁核点燃效应的抑制作用

如前所述，该内源性MAO-B抑制因子对脑内主要的单胺类神经递质NE、DA和5-HT水平的调节具有重要意义。本研究为确定其中枢活性测定了其抗癫痫作用。除采用化学性惊厥模型和常规电惊厥模型，我们还应用目前国际公认理想的癫痫模型-大鼠的杏仁核点燃模型。本文在以上模型上研究了ISA的中枢药理活性，并探讨了其药理作用机理。

                             材料与方法：动物：雌性Wistar大鼠，体重180g～200g；昆明种小鼠，雌雄兼有，体重21±3g，由青岛市药品检验所动物中心提供。药品：ISA，由北京化工厂生产；二甲基亚砜(DMSO)，江苏洪声化工厂生产；戊巴比妥钠，Union公司进口分装；戊四唑、盐酸氨基脲均为日本NAKALAI TESQUE株式会社产品。以上产品均为分析纯。仪器：电子刺激器，SEN-3201；隔离器，SS-102J，均为日本光电公司产品；脑立体定向仪，江湾I型C，由第二军医大学生产；SMUP-PC生物信号处理系统，由上海医科大学生理教研室研制开发；生理药理多用仪，YSD-4型，蚌埠医学院和蚌埠无线电二厂联合生产。ISA对大鼠杏仁核点燃效应的影响电极植入及点燃步骤按作者曾报告的方法(药学学报，1999,34∶1)ISA对杏仁核点燃发作参数的影响：

将ISA溶于DMSO，在完全点燃的大鼠(n=12)单次ip 25,50,100,160,200mg/kg，给药容量为1ml/kg；于给药后30min测定后放电阈值(afterdischargethreshold,ADT)。后放电阈值的测定改用恒压刺激，其它参数不变。引起至少持续3sec的异常放电所需的刺激电压作为后放电阈值，记录在ADT刺激下引起的放电潜时、后放电时程和发作强度。给药前三天ip DMSO测定对照条件下的以上指标，与药物处理后所得结果作自身对照。ISA 100mg/kg，于给药后15,30,45,60,90,120,180,240min测定以上参数，以研究其时间一效应关系。ISA抗小鼠电惊厥实验

提前一周筛选动物。用生理药理多用仪通过角膜电极给予130V 0.5sec 50Hz交流电刺激，以出现强直性惊厥为阳性动物。取阳性动物60只，雌雄各半，随机分成六组，分别ip DMSO或ISA50,70,100,140,200mg/kg；ISA新鲜溶于DMSO，给药容量为5ml/kg。30min后按上述参数给予电刺激，记录屈曲、强直、阵挛和昏睡相的时间，计算强直发生率。以强直抑制率为指标计算ISA抗最大电休克发作的ED₅₀。ISA抗小鼠戊四唑惊厥实验

小鼠30只，雌雄各半，随机分成三组，分别ip DMSO或ISA 50,200mg/kg预处理。30min后sc PTZ 85mg/kg。PTZ需新鲜溶于蒸馏水，注射容量为10ml/kg。以出现阵挛性惊厥为指标记录潜伏期和2h内动物的惊厥发生率、强直发生率及死亡率。ISA抗小鼠氨基脲惊厥实验

小鼠30只，雌雄各半，随机分为三组，分别ip DMSO或ISA 50,200mg/kg，然后立即iv SCZ 200mg/kg，容量为10ml/kg。以出现狂奔和后肢强直惊厥为指标，计数SCZ后120min惊厥发生率、强直发生率、死亡率和潜伏期。统计学处理ISA对杏仁核点燃大鼠各发作参数的影响的统计学处理方法为配对t检验，其它计量资料采用组间t检验，数据均用 x±s表示；计数资料用比较两样本率差别显著性的方法进行统计学处理；ED₅₀的计算采用寇氏法。

                              结果ISA对大鼠杏仁核点燃效应的影响杏仁核点燃模型的制备

每日一次按以上参数刺激右侧杏仁核。AD呈现高幅高频的痫性放电，随着刺激次数的增加，ADD也进行性延长，由开始刺激时的10+2.1sec到首次出现第五期反应时的45.3±5.4sec(n=12,P＜0.01)；同时，动物也依次出现I到V期的行为反应；由首次刺激到出现第一次V期反应所需的刺激次数为13.3+4.2(n=12)。ISA对杏仁核点燃效应的影响

ISA对完全点燃大鼠的局灶性发作阈值(ADT)具有影响并呈剂量依赖关系(见表1)。ip ISA 50,100,160,200mg/kg均可显著升高ADT并呈剂量依赖关系，其中引起最大效应的剂量为100mg/kg，可升高阈值约20％。

在每次给予不同剂量的ISA前三天给动物注射溶媒DMSO测定其ADT并记录EEG、放电潜时、ADD和发作强度等参数。在ADT刺激下，动物都表现第V期反应。用ISA处理后EEG只出现短暂的性放电而不出现行为症状或只有轻微反应(stage 1)，说明ISA可显著抑制全身性阵挛发作的发生，显著降低第V期反应的百分率；同时，动物发作的平均评分较各自对照组也显著降低(见表1)，其中作用最为明显的是100mg/kg剂量组(P＜0.01)，这与该剂量对ADT的升高作用相一致。表1不同剂量ISA对完全点燃大鼠各种发作参数的影响( x±s)

剂量(mg/kg)	n	ADT(V)		评分		5期发作降低百分率(％)
							给药前	给药后	给药前	给药后
		2550100160200	991199	3.91±1.613.91±1.613.61±1.663.30±1.463.89±1.39	4.00±1.544.28±1.69*4.22±1.78**3.69±1.63*4.22±1.70*						55555	3.33±2.501.89±2.31**1.18±1.9**1.67±2.50**1.67±2.50**	33.377.888.954.550.0

给药后30min测定各参数，与DMSO处理组比较，*P＜0.05，**P＜0.01ISA对抗杏仁核点燃效应的时间-效应关系

ISA给药后15min到3h之间都可显著升高ADT，降低发作强度，其作用的峰值时间为1h(见表2)。表2 ISA 100mg/kg不同给药时间对发作参数的影响( x±s)

给药时间	ADT升高量(V)	发作分期降低量	Stage 5 seizureprotection(％)
				1530456090120180	0.2±0.42*0.61±0.41***0.74±0.60**0.85±0.62**0.79±0.60**0.71±0.46**0.76±0.87*	3.22±2.44**3.64±1.96***4.32±1.65***3.87±2.10**3.75±2.31**4.75±0.46***2.87±2.42*	66.788.988.910075.010075.0

与DMSO处理组比较，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001ISA对小鼠最大电休克的影响

ISA可剂量依赖性地取消最大电休克发作的强直相，200mg/kg ISA完全拮抗强直发作，缩短强直发作的时间；而对阵挛发作的影响相对不明显，甚至有延长阵挛时间的趋势(表3)。以强直发生率为指标，用寇氏法计算ED₅₀为123mg/kg。表3 ISA对小鼠最大电休克发作的影响(n=10, x±s)

	剂量(mg/kg)	强直发作时间(sec)	阵挛发作时间(sec)	强直发生率(％)	阵挛发生率(％)
						对照ISA	5070100140200	33.1±4.421.8±9.0**26.8±5.2*18.5±4.3***13.5±2.1--	10  5.8±3.1     810  9.3±4.0    109   6.4±2.4     98   12.9±7.1    82   17.3±4.8    70   13.3±3.3    6	1001009080200	8010090807060

与对照组比较，*，P＜0.05；**P＜0.01，***P＜0.001ISA对化学性惊厥的影响

ISA较高剂量(200mg/kg)时可明显降低戊四氮惊厥和氨基脲惊厥的强直发生率(P＜0.01)，低剂量(50mg/kg)时不具这种保护作用，相反能缩短戊四氮惊厥的发作潜伏期(P＜0.05)(见表4,5)。表4．ISA对PTZ惊厥的保护作用( x±s)

	n	剂量(mg/kg)	潜伏期(min)	强直发生率(％)	死亡率(％)
						对照ISA	101010	50200	21.7±8.711.8±7.0*21.1±13.9	901000##	909040#

与对照组比较，*,#P＜0.05；##P＜0.01

表5．ISA对小鼠氨基脲惊厥的影响( x±s)

	n	剂量(mg/kg)	潜伏期(min)	死亡时间(min)	强直发生率(％)	死亡率(％)
							对照ISA	101010	50200	71.9±21.759.7±+22.751.3±12.0*	86.0±23.773.2±42.287.5±29.9	9010010##	909090

与对照组比较，##P＜0.01

                              讨论

点燃模型与人类复杂一部分性癫痫在发作的行为表现，脑电图表现，痫样放电的扩散方式以及抗惊厥的药理学等方面极为相似，因此被认为是目前最为理想的人类复杂一部分性癫痫的良好模型。对目前临床常用的治疗复杂部分性癫痫的药物如苯巴比妥，卡马西平，丙戊酸钠和和安定都可有效也抑制杏仁核的点燃效应。

实验结果表明：内源性MAOI ISA对大鼠的杏仁核点燃有明显的抑制作用。ipISA 50-200mg/kg，显著升高ADT，降低阈电压刺激下动物的发作程度，提示ISA具有抗癫痫作用。另，ISA对放电潜时和ADD没有明显影响，甚至有延长ADD的趋势，ISA无阻止异常脑电扩布的作用，其对点燃的抑制效应可能是因为升高了癫痫放电灶的后放电阈值(ADT)所致。

据报道抗帕金森氏病的化学制品MAO-B抑制剂司利吉林在大鼠点燃模型上和小鼠的最大电休克发作和PTZ惊厥模型上都具有抑制作用，特别是在对局灶性发作阈值(ADT)的影响上，ISA与司立吉林的作用相似，以上说明ISA的抗癫痫作用与抑制MAO，升高单胺类神经递质水平相关。单次注射ISA50、200mg/kg均可显著降低脑内MAD-B的活性，同时脑内的NE和5-HT水平明显升高。已有证明：肾上腺素功能增强和脑内5-HT水平提高均有抑制癫痫与惊厥的作用。α₂受体激功剂可乐宁，多巴胺受体激动剂Apomorphine及DA的前体物质L-DOPA对由电刺激引起的完全点燃大鼠的发作均有抑制作用；而用6-OHDA和5,6-hydroxyltrytamine耗竭NE和5-HT可明显加快点燃进程。因此，脑内单胺类神经递质对于抑制癫痫发作和延缓癫痫的发展起重要作用。而ISA作为内源性MAOI，其对NE和5-HT的升高作用对于维持单胺能神经元在中枢的正常功能有重要意义。

总之，本文数据显示ISA可升高点燃大鼠的局灶性发作阈值，降低发作强度，降低全身性发作的百分率，说明ISA具有抗癫痫活性。(二)ISA抗帕金森氏病(震颤麻痹症)的研究1、ISA拮抗MPTP对多巴胺能神经元的毒性作用

帕金森氏病是一种老年性神经系统退行性疾病，主要病理特征是黑质多巴胺能神经元的变性坏死，从而使纹状体的DA含量显著降低，引起一系列的临床症状。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)是一种八十年代发现的神经毒素，可引起人和灵长类动物酷似PD的症状。现在利用MPTP制备灵长类和啮齿类动物的PD模型已被公认为研究PD最好的模型。

已有报道，老年人随着增龄MAO-B的活性增高，因此，MAO-B又被称为老化相关酶。另外，随着增龄，患PD的风险也随之增加。动物实验发现，特异性MAO-B抑制剂司立吉林可选择性保护DA能神经元免受MPTP的毒性损伤。ISA作为新近发现的内源性MAO-B抑制剂，随年龄增加尿中排泄也增加，考虑到MAO-B的增龄变化，该内源性因子可能在防治帕金森氏症方面重大意义。本文研究了ISA对MPTP的保护作用，国内外未见报道。MPTP价格十分昂贵，本文在特种C57BL/6J小鼠制备的MPTP模型观察了ISA抗PD神经化学机理。

                               材料和方法药品MPTP盐酸盐(MPTP hydrochloride,Research Biochemicals Incorporated,RBI公司)；ISA；盐酸去甲肾上腺素(NE)，盐酸多巴胺(DA),3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)，3,4-二羟苯乙酸(DOPAC)，高香草酸(HVA)，辛烷基磺酸钠(Ocytal Sulfate)均为Sigma产品；一水合柠檬酸，二水合柠檬酸三钠，EDTA.2Na，柠檬酸钾，磷酸氢二钾为北京化工厂产分析纯；高氯酸(天津东方化工厂，A.R.)；甲醇(色谱纯，天津西华特种试剂厂)仪器日本岛津公司6A系列高效液相色谱仪：包括LC-6A恒温柱箱，SCL-6A系统控制器，SIL-6A电化学检测器，Alltima C18反相柱(美国迪马公司-AlltechAssociation Inc.；250(4.6mm I.D.,5(m,100A)，国产保护柱(北京潮声技术开发公司，C18,10μm；MacLab/4e 4 channel Recorder,Chart和Peak软件(澳大利亚AdInstruments公司，在Macintosh微机上运行)用于色谱信号采集和处理；电子天平(Libror AEL-40SM)Shimdzu Co.产品；-85℃超低温冰箱(NUAIRE)，超声波组织匀浆机(Microsonicator,TENCONS,Scentirc Ltd.USA)；台式冰冻离心机动物C57BL/6J小鼠，雄性，体重18-22g，由北京医科大学实验动物科学部提供。实验前一周适应环境，12/12h昼夜循环光照，室温20℃，自由进水取食。方法1．药物处理盐酸MPTP溶于无菌NS，剂量为36mg/kg(相当于30mg/kg游离碱)，ip 10ml/kg；ISA用1.25％的西黄耆胶混悬，ig 10ml/kg，剂量200mg/kg/day。动物24只，随机分为三组：①正常对照组；②MPTP处理组；③ISA保护组。提前两天每天一次ig西黄耆胶或ISA，第三天ig后30min ip NS或MPTP，注意观察动物的行为表现；3h后再次ig ISA。一周后动物断头处死，迅速取出两侧纹状体，用铝箔包裹，置-85℃超低温冰箱保存至HPLC-ECD检测。2．流动相、标准溶液和样品处理液的配制

流动相选用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.14mol/L,pH4.2)，含1μmol/L的EDTA·2Na,0.78mmol/L的辛烷基磺酸钠和6％的甲醇(v/v)。流动相每次新鲜配制500ml，可循环使用一周，但每天需经0.45μm滤膜负压过滤兼脱气。

取适量标准品分别溶于dH₂O中使成1mg/ml,-85℃避光保存，临用前流动相稀释至适当浓度。

样品预处理液分A液B液分别配制。A液为0.4mmol/L的高氯酸；B液含20mmol/L的柠檬酸钾，300mmol/L磷酸氢二钾和2mmol/L EDTA·2Na。3．组织样品的预处理

样品从-85℃冰箱中取出转入1.5ml Eppendorf管中称重，加入0.5ml冰冷A液，置冰浴中用超声波匀浆机匀浆1min，匀浆液4C,12000rpm离心20min，取上清液与1/2体积B液混合，冰浴静置10min，离心(同前)。4．上样分析、绘制标准曲线、含量计算(1)设定最大柱压350kgf/cm²，流速为1.2ml/min,ECD设定电压0.8V，每一样品检测55min。(2)各标准品分别进样，检测其保留时间作为定性指标。(3)将各标准品混合并稀释成6个浓度梯度，即分别进样0.5,1,2,4,8,16ng检测并绘制标准曲线。(4)样品进样150μl，根据色谱峰面积从标准曲线上求出相应含量(ng/mg组织)。5．统计学处理：在Statistics软件中用ANOVA分析继之以Newman-Keuls的post hoc检验比较多组间差别的显著性。数据用 x±s表示。

                                结果一．MPTP与ISA引起的小鼠行为改变

系统给予MPTP 30mg/kg后约5min动物出现高频震颤、弓背、竖尾同时呼吸急促等急性症状，有的动物还会观察到前肢阵挛和后退；这些症状约持续15-30min。此后的动物出现运动减少、行动迟缓并渐渐采取腹卧位，不动。用ISA处理组震颤、弓背、竖尾等行为较单纯MPTP处理组不明显。24h后观察，动物行为均基本恢复正常。二．纹状体内儿茶酚胺及其代谢物的含量变化1．标准曲线在本实验选定条件下，标准品注入量0.5-16ng范围内，与峰面积之间呈良好的线性关系，r值均＞0.99，说明仪器稳定性较好。2．MPTP损毁与ISA保护对儿茶酚胺及其代谢物含量的影响给C57BL/6小鼠单次ip MPTP 30mg/kg，一周后检测发现纹状体内DA含量降低92％，其主要代谢物DOPAC、HVA分别降低86％和67％(见表6)；纹状体内NE和MHPG的含量变化不明显。用ISA处理组几乎完全翻转了MPTP对纹状体DA的耗竭；DA、DOPAC和HVA水平较单纯MPTP处理组分别升高了90％、82％和69％，而与正常对照组比较，差别没有显著性。表6 C57BL/6J小鼠纹状体内单胺递质及其代谢物的含量( x±s)

	n	DA	DOPAC	HVA	NE	MHPG
							CTRLMPTPMPTP+ISA	6610	5.53+0.650.42+0.21***4.21+0.68###	4.67+0.630.67+0.37**3.78+0.58##	1.20+0.090.40+0.17**1.28+0.14##	0.61+0.050.43+0.110.63+0.05	0.34+0.040.24+0.070.40+0.05

**P＜0.01,***P＜0.001与对照组比较；##P＜0.01，###P＜0.001与MPTP处理组比较3．药物处理对多巴胺更新率的影响

MPTP使小鼠纹状体内DA、DOPAC和HVA均显著降低，而DA的更新率DOPAC/DA和HVA/DA的比值却升高了，其中HVA/DA值的升高较正常对照组比较有极显著意义(P＜0.001)。ISA处理可逆转MPTP引起的DA更新率的升高，使其恢复到正常水平。

                              讨论

MPTP模型是当今帕金森氏病研究中应用最新也是最广泛的模型。MPTP可透过血脑屏障，选择性损毁多巴胺能神经元，所产生的症状和生化、病理改变都与PD患者极为相似。对MPTP毒性的敏感性因动物种系不同而有很大差异：人和灵长类动物如猴、狒狒等最敏感；啮齿类动物大鼠对此不敏感，只有C57BL/6J小鼠相对较敏感，因此我们选用C57BL/6J小鼠作为我们的研究对象。

给灵长类动物猴和狒狒等应用MPTP后可出现典型的PD症状，如运动障碍、肌肉僵直和静止震颤；而在C57BL/6J小鼠除了可以观察到短时的高频震颤、竖尾、弓背和前肢阵挛等急性症状外，动物很快恢复正常；但免疫组化方法显示黑质的TH-免疫阳性神经元缺失40％，腹侧被盖区(VTA)缺失17％。而此时HPLC-ECD检测得纹状体DA耗竭达85％，其两种主要代谢物3,4-二羟苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)也明显降低；同时大脑皮层的NE也降低，但降低幅度较DA少，说明与DA相比，MPTP对其它递质影响较少，在我们的实验中也有类似发现。

MPTP对DA能神经元的选择性毒性作用的研究结果表明：MPTP进入脑内后首先被胶质细胞中的MAO-B催化转化成MPDP，再进一步催化形成MPP；体外实验证明：MPP可直接引起胚胎中脑DA能神经元的变性坏死。进一步的实验发现：MPP是被纹状体DA能末梢上的选择性很强的单胺能转运体主动摄取的，再被线粒体外膜上的能量依赖性载体摄取到线粒体并堆积，抑制了呼吸链的NADPH:CoQ系统(复合体1)，使ATP合成障碍，引起ATP耗竭，最终导致细胞死亡。因此，MAO-B和单胺的重摄取机制是MPTP发挥毒性作用的关键环节，阻断它们可能会降低MPTP的毒性。实验已证明：特异性MAOB抑制剂司利吉林和非特异性MAO抑制剂帕吉林以及DA重摄取抑制剂均可有效拮抗MPTP对纹状体DA的耗竭作用，而MAO-A抑制剂不具此效应。本结果证明，ISA作为较为特异的MAOB抑制剂几乎完全对抗了MPTP对DA神经元的毒性作用，使纹状体内DA水平保持在正常水平，显示了强大的抗MPTP毒性作用。另外，由MPTP引起的DA更新率HVA/DA的升高也被ISA所逆转，所以ISA对维持脑内DA的正常代谢起一定作用。

MAO-B是一种老化相关酶，随着年龄的增加而活性增强；特别是在一些老年性神经退行性疾病如帕金森氏病和早老性痴呆等这种变化优为明显，同时不容忽视的是患上述老年性神经系统疾病的风险率也随增龄而增加。因此，在本实验中所观察到的ISA对抗环境毒素MPTP，保护DA能神经元的良好作用证明其在帕金森氏病的防治方面会具有重要意义。2、ISA对偏侧帕金森病模型大鼠旋转行为的影响

                             材料药品溴酸6-羟基多巴胺(6-OHDA)，盐酸阿朴吗啡(APO)，左旋多巴(L-DOPA)均为Sigma公司产品；引哚醌(ISA)，水合氯醛，甲基纤维素为北京化工厂产品。仪器脑立体定向仪(日本Narishige,NS-2型)，大鼠旋转行为自动测试系统(德国产)。动物Wistar大鼠，雌性，体重200±20g,24只，合格证号：960202购于青岛市药检所。

                              方法与结果大鼠偏侧帕金森氏病模型的建立和筛选

大鼠ip水合氯醛350mg/kg麻醉，固定于Narishige立体定向仪，在右侧中脑纹状体上行传导路---前脑内侧束(medial forebrainbundle,MFB)定位注射6-OHDA，去除单侧纹状体的多巴胺能神经支配。6-ODHA 3.6mg/kg溶于无菌生理盐水，其中含0.2mg/ml维生素C防氧化，按Earl氏法^[5]，注射部位取两点，第一点位于前囱尾侧(A)4.0mm，正中线旁开(L)1.2mm，硬膜下(V)7.8mm，齿棒低于耳间线2.3mm，注入2.5μl6-OHDA；第二点位于A:4.0mm，L:0.8mm，V:8.0mm，齿棒高于耳间线3.4mm，注入6-OHDA 3.0μl，注射速度为1.0μl/min，注毕留针5min。

注射6-OHDA两周后给大鼠sc APO 0.05mg/kg，用大鼠旋转行为记录仪监测1h。此旋转测试每周一次，连测三周，选择向健侧旋转且转速不低于300转/1h的大鼠作为合格模型，用于实验。ISA和L-DOPA对大鼠旋转行为的影向急性实验

取12只模型鼠，ISA溶于二甲基亚砜(DMSO),L-DOPA用0.25％甲基纤维素混悬，均ip容积均为1ml/kg。先用DMSO或ISA 20、100mg/kg预处理，30min后ip L-DOPA诱发旋转，用旋转测试仪记录数据。每次给药至少间隔四天，防止药物蓄积。慢性给药

取12只模型鼠，预先测试ip L-DOPA 20mg/kg诱发的旋转行为次数，三天后灌胃(ig)1.25％西黄蓍胶混悬的ISA 200mg/kg一周，第八天ISAig后30min L-DOPA 20mg/kg ip诱发旋转，记录数据。统计学处理：实验采用自身对照，用配对t检验(双侧)比较组间差别显著性，数据以 x±s形式表示。

                         结果大鼠旋转行为测定

损毁右侧MFB的大鼠清醒后即显示自发向损毁侧旋转行为，同时四肢肌张力增高，左上肢最明显；并有步态不稳等症状，两天后上述症状均有所缓解。两周后测试，先把动物置旋转测试仪中适应环境10min,APO0.05mg/kg sc,3～5min后动物表现向健侧旋转行为，头歪向左侧，以左上肢为支点，首尾相接，并伴有嗅、咬、舔等定型行为。约50％大鼠转速达300转/1h以上。

ISA对L-DOPA诱发旋转行为的影响1．ISA 20mg/kg和100mg/kg ip不能诱发恒定单向旋转行为；前者剂量对行为无影响；后者可引起镇静少动。2．L-DOPA本身可引起6-OHDA单侧损毁大鼠向对侧旋转行为。动物分别ip不同剂量L-DOPA激发，在10mg/kg剂量时，多数动物表现轻微旋转或不转，40mg/kg剂量时则旋转过强，高达1000转/2h，故选择20mg/kg剂量为最适测试条件，其转数在300～600转/2h之间。3．提前30min分别ip ISA 20或100mg/kg急性给药预处理，再ip L-DOPA20mg/kg，结果ISA 20mg/kg对L-DOPA诱发的旋转行为略有降低，而100mg/kg ISA显著抑制L-DOPA诱发的旋转行为(p＜0.01)。4．改变给药途径，每天ig ISA 200mg/kg慢性给药，连续给药7天，对L-DOPA旋转行为影响有显著统计学差异，总转数明显减少(p＜0.01)。

                          讨论

6-OHDA系儿茶酚胺能神经损毁药，使纹状体内DA含量急剧下降(达90％以上)，导致两侧运动功能失衡，给予L-DOPA诱发旋转行为，即为旋转模型。该模型与黑质、纹状体DA功能有良好相关性，常用于帕金森氏病药理研究。

目前认为PD动物旋转行为机理是：(1)黑质多巴胺能神经元变性引起纹状体内突触后膜多巴胺受体超敏，损毁侧受体对激动剂敏感性比对侧高。(2)促多巴胺释放药物仅刺激未受损一侧纹状体内的受体。(3)纹状体传出纤维抑制同侧运动活动，多巴胺受体兴奋可抑制纹状体传出纤维的活动。因此使用多巴胺受体激动剂如L-DOPA，则受损侧超敏多巴胺受体反应比健侧强，引起损毁侧活动增强，导致动物向健侧(对侧)旋转，而促多巴胺释放药主要刺激健侧受体，使动物向损毁侧(同侧)旋转，该旋转行为可辨别多巴胺受体激动药还是促多巴胺释放药，但难区分兼而有之的药物。本结果表明，ISA无增强L-DOPA的作用，反降低其诱发的向健侧旋转，这与我们在MPTP模型升高DA浓度、拮抗MPTP的作用的结果似乎缺乏一致性，说明本文ISA除发挥本身MAO-B抑制剂作用外还可能涉及抑制DA重摄取或促DA释放。因促DA释放药苯丙胺减少旋转，而纯MAO-B抑制剂可增强其旋转效应。我们已观察到在纹状体脑片灌流时，ISA有促进多巴胺游离作用(待发表资料)，这恰与ISA升高脑内DA水平，抗MPTP毒性作用相吻合。

总之，本文所观察到的ISA对L-DOPA旋转的抑制作用，说明除MAO-B抑制作用外，还可能有其它机理参与，如抑制DA重摄取或促进DA释放。MAO系老化相关酶，其活性随着年龄而增加，有趣的是ISA尿排泄也随年龄而增加，如帕金森氏病等患者这种变化更明显，因此，深入研究ISA作为内源性MAO-B抑制因子与帕金森氏病关系。对开发其潜在药用价值有重要意义。第三部分  ISA的急性毒性实验动物  昆明种小鼠50只，雌雄兼有，体重18-20g；实验前禁食12h。药品  ISA用1.25％的西黄耆胶混悬，用前摇匀，ig容积0.6ml/只。方法  动物随机分为5组，每组10只，按下表剂量ig，组间比为k=0.7。实验与上午进行，观察给药后24h各组动物的死亡和存活情况，计算死亡率。下表为用药后24h的死亡率，采用孙氏改良法计算LD₅₀=1091±359mg/kg(95％可信区间751-1374mg/kg)。表1小鼠ISA后24h急性毒性

分组	剂量(g/kg)	实验鼠数	死亡鼠数	死亡率P(％)
					12345	321.510.7	1010101010	1010642	100100604020

第四部分  临床试验部分

震颤麻痹(帕金森氏病，PD)是中老年期常见的神经系统变性疾病。其主要病因是黑质致密部多巴胺(DA)神经元损伤表达的酪氨酸(TH)减少或活性降低，导致脑内DA含量明显减少。临床多表现为震颤等运动障碍。目前外源性DA替代疗法只能控制症状，却无法阻止DA神经元的继续变性。近期大量的资料揭示PD黑质神经元变性可能与氧化反应和能量代谢障碍有关，故采用抗氧化剂治疗，目前已成为治疗PD的重要手段。现今国内外多采用化学合成剂丙炔苯丙胺做为PD的治疗。为进一步拓宽治疗PD的途径，本文应用ISA对10例PD志愿者进行了治疗观察，结果如下：一．病例选择

全部病例均系1995.10～1996.10青岛医学院附属医院神经内科门诊病人，均符合1984年全国锥体外系疾病讨论会所提出的诊断标准，观察病人16例，分为实验组7人和对照组9人。实验组每人每天服ISA胶囊制剂100-150mg/天，分三次服用，对照组不服用治疗PD的药物。观察时间3个月。结果见表Ⅰ．

表1．PD患者分组情况

组别	病人数	平均年龄(岁)	病程(年)	Webster记分治疗前(分)
					实验组对照组	79	65.7(52-75)64.9(56-73)	1.2(0.6-2.2)1.1(0.7-2.1)	12.9(8-16)11.2(8-18)

进步率为100％为痊愈50-90％为显著进步20-49％为进步1-19％为稍进步0为无效二、评定方法：

实验组和对照组均按Webster记分法进行比较

一是实验组治疗前后比较，二是二组间进行比较

                                结果一．进步率表2实验组治疗前后和未治疗组3月前后webster记分

		病例									平均
												1	2	3	4	5	6	7	8	9
		实验组对照组	治疗前治疗后进步率(％)治疗前治疗后进步率(％)	161601113-18.2	141214.3880	8712.51415-6.7	11110880	14137.118180	141214.31012-20	131115.41213-8.3											990	1112-9.1	12.911.79.111.212.1-6.9

由表1可看出；实验组应用ISA治疗3个月，7例患者治疗后较治疗前共减少8分(例2例6例7各减少2分，例3和例5减少1分)平均减少1.1分。由表2可看出：对照组(未治疗组)3个月前后，9例患者总分未减少，相反增加7分，平均每例增加0.8分

两组相比较：实验组7例治疗3月各共减少8分，而对照组增加7分，两者相差15分，平均每例相差1分

进步率：实验组7例中有5例为稍进步，而对照组5例症状稍加重。二实验室检查：两组在治疗前和3月后，均行血常规、肝功、肾功、超氧化物歧化酶(SOD)、心电图、血压检查，前后均无明显不同。三不良反应：在7例实验组患者中，只有1例在服药后的第12-16天有胃肠道不适，轻度恶心，未减量，症状逐渐消失，其余均未见不良反应。

                             讨论

ISA是一种天然存在于人尿中、动物体内和抗癫中药青黛中的一种MAO-B特异抑制剂，其神经保护作用与目前国内外应用的化学合成药丙炔苯丙胺(selegiline,L-deprenyl)药理作用相似。我们应用ISA治疗7例患PD志愿者，国内外尚无该药治疗PD报告，从7例的评分看，有5例稍有进步，其分数的减少主要是静止性震颤患者。但是与对照组相比，该药使PD病人的症状减轻，而未治疗组症状稍加重，说明该因子具有预防和治疗作用。

                             小结

ISA是近年发现的脑内内源性单胺氧化酶(MAO-B)特异性抑制因子，系统给予ISA可抑制MAO-B活性，显著升高脑内去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)的水平；NE、DA、5-HT是脑内重要的神经递质，特别是与老年性疾病震颤麻痹(帕金森氏病)、痴呆、癫痫等中枢神经系统疾病的发生发展有密切关系。本课题采用当今国际公认的有关动物模型-点燃模型、6-OHDA损毁引起的大鼠旋转行为模型以及啮齿类动物的MPTP模型等检测了MW-147的抗癫痫发作和抗帕金森病的中枢药理活性，并测定了脑内有关递质的变化。本研究在国内外未见相似报道。研究结果发现：1．ISA可明显抑制大鼠的点燃发作，表现在给药后发作阈值升高，发作强度降低，在同样的刺激条件下，发作的百分率明显降低(P＜0.01)，证明ISA具有抗点燃发作作用，说明其具有抗癫痫活性。2．在化学性惊厥模型和抗最大电休克的研究还发现：ISA可剂量依赖性地对抗小鼠的最大电休克发作，其ED₅₀为123mg/kg；ip 200mg/kg ISA可特异性取消戊四氮(PTZ)和氨基脲(SCZ)惊厥的强直相，延长存活时间，降低死亡率。3．在6-OHDA损毁造成的大鼠偏侧帕金森病模型-旋转模型上的实验发现：急性给予ISA 20mg/kg和100mg/kg后再ip L-DOPA，可降低开始阶段的转数(P＜0.05)，但对动物的总转数的影响无统计学显著性。4．ISA能明显对抗MPTP对小鼠多巴胺能神经元的损毁作用，用HPLC-ECD进行脑内神经化学检测表明：ISA可反转由MPTP损毁造成的小鼠纹状体内DA的耗竭(P＜0.001)，并维持DA的正常代谢。5．急性毒性实验测得口服ISA对小鼠的LD₅₀为1.0g/kg(95％可信区间751-1374mg/kg)，说明其毒性较低。6．临床试验结果：在16例帕金森氏症志愿者，实验组7人与对照组9人比较，按Webster评分法显示症状好转。7．结论：ISA内源性MAO抑制因子在抗癫痫和抗MPTP毒性作用中枢疾病模型方面，有显著的药理作用，在临床志愿者的临床研究也收到较好效果。

Claims (6)

1．靛红防治老年震颤麻痹和癫痫的神经疾病药物的制备，其特征在于用传统的工艺将含有靛红成份的结晶分别制备成为胶囊与片剂。

2．靛红防治老年震颤麻痹和癫痫的神经疾病药物的实用剂型，其特征在于：将靛红用纯水和无水乙醇1∶1-8配合，缓慢在磁性搅拌器加热至溶解，然后逐渐冷却，呈针形橘红色结晶。

3．按照权利要求2所述的靛红防治老年震颤麻痹和癫痫神经疾病药物的制备，其特征在于：靛红的加热溶解在50-85℃为最佳。

4．按照权利要求1所述的靛红防止老年震颤麻痹和癫痫神经疾病药物的制备，其特征在于：将针形橘红色结晶重复1-3次，以便纯化减少重金属离子。

5．按照权利要求3所述的靛红防治老年震颤麻痹和癫痫神经疾病药物的制备，其特征在于：将针形橘红色结净研磨成粉末过80目筛，以1∶5-10倍药用淀粉混匀，制作成50,100mg两种规格的胶囊。

6．按照权利要求3所述的靛红防治老年震颤麻痹和癫痫的神经疾病药物的制备，其特征在于：将针形橘红色结晶研磨成粉末过80目筛，按湿颗粒法压片，分别制作成50,100mg两种规格的片剂。