CN1298743C - 一种融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
一种融合蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1298743C CN1298743C CN 200410006549 CN200410006549A CN1298743C CN 1298743 C CN1298743 C CN 1298743C CN 200410006549 CN200410006549 CN 200410006549 CN 200410006549 A CN200410006549 A CN 200410006549A CN 1298743 C CN1298743 C CN 1298743C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fusion protein
- seq
- protein
- amino acid
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title abstract description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title abstract description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 5
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 3
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 2
- 102000012936 Angiostatins Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 description 2
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000721 basilar membrane Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 108010016700 plasminogen kringle 5 Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010046 negative regulation of endothelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种融合蛋白及其编码基因与应用,其目的是提供一种融合蛋白及其编码基因与在制备治疗新生血管异常生成引起的疾病的药物中的应用。该融合蛋白,是具有序列表中SEQ ID №:2氨基酸残基序列的蛋白质,或者是将SEQ ID №:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID№:2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №:2衍生的蛋白质。细胞实验证明,本发明的融合蛋白可有效地抑制血管内皮细胞的增殖,从而抑制血管的新生,进一步可抑制肿瘤生长;该融合蛋白可用于制备治疗新生血管异常生成引起的疾病(如肿瘤)的药物,具有广阔的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用,特别涉及一种融合蛋白及其编码基因与在制备治疗新生血管异常生长引起的疾病的药物中的应用。
背景技术
科学研究发现,肿瘤的生长和转移是依赖于人体内新生血管的。血管新生即形成新的毛细血管是体内一种非常重要的过程。它不仅涉及再生、创伤愈合等生理过程,还参与糖尿病、视网膜病变、风湿性关节炎和肿瘤生长与侵袭等病理过程。新生血管的形成为肿瘤细胞的迁移和实体瘤体积增大提供了营养和通道(Folkman,J.,1995,Nat.Med.1,27-31;Folkman,J.,1992,Exs.61,4-13;Battegay,E.J.,1995,J.Mol.Med.73,333-346;Bicknell,R.,and Harris,A.L.,1996,Curr.Opin.Oncol.8,60-65)。
因此,如何有效的截断肿瘤的血供、抑制新生血管,已经成为肿瘤治疗及防止肿瘤扩散的研究方向。
90年代以来,人们相继发现一些血管生成因子抑制剂。其中的血管生长抑素(Angiostatin)和内皮生长抑素(Endostatin),分别是纤维蛋白溶酶原和胶原蛋白X V III的片段(O’Reilly,M.S.,Holmgren,L.,Shing,Y.,Folkman,J.,1994,Cell.79:315;O’Reilly,M.S.,Boehm,T.,Shing,Y.,Folkman,J.,1997,Cell.88:277)。近来,血纤溶酶原(Plasminogen)的kringle 5(K5)蛋白片段被证明对内皮细胞的增殖和迁移有很强的抑制作用(Cao,Y.,Ji,R.W.,Davidson,D.,Folkman,J.,1996,J.Biol.Chem.271:29461;Ji,W.R.,Barrientos,L.G.,Trail,P.A.,1998,BBRC 247,414-419)。血管生成因子抑制剂的发现,使得人们从干预血管生成方面着手,治疗由于新生血管异常生成引起的疾病成为可能。
血管形成因子抑制剂对实体瘤的治疗前景尤为引人注目。目前为止,还没有一种有效的治疗实体肿瘤的药物。因为化疗法直接作用于癌细胞本身,所以大部分化学疗法都伴有较明显的副作用。而血管形成抑制疗法直接作用于内皮细胞,由于内皮细胞遗传上的稳定性,同源性和低突变,因而减轻或消除了药物反应(Boehm,T.,Folkman,J.,Browder,T.,O’Reilly,M.S.,1997,Nature 390,404-407)。医学研究证明实体瘤的血管生成能力特别旺盛,因而与正常机体争夺营养(Molema,Grietje;Griffioen,Arjan W.,1998,Immunology Today 19(9),392-394)。如能抑制新生血管的生成,就能有效的抑制肿瘤生长,并导致肿瘤死亡。这就使医学从抑制血管的生成来治疗肿瘤的途径成为可能。动物实验的结果已经显示出这样的前景(Molema,Grietje;Griffioen,Arjan W.,1998,Immunology Today 19(9),392-394)。因此,把血管生成抑制剂作为治疗肿瘤的新药来开发,已成为医药界的热点之一。
恶性肿瘤最本质的特征是侵袭和转移,侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤。侵袭涉及到粘附:即肿瘤细胞通过膜表面的受体与基底膜、基质成分层粘连蛋白、纤粘连蛋白和胶原蛋白结合;还涉及到肿瘤细胞分泌或利用包括金属蛋白酶在内的多种蛋白酶降解基底膜和基质。抑制金属蛋白酶一直是肿瘤治疗中比较常用的靶点。采用基因工程方法可以将具有不同机制的抗血管生成抑制剂组合在一起,二者联合达到早期抑制移植瘤的功效。目前,构建双功能嵌合分子正成为抗血管生成研究的新动向(Veenendaal LM,Jin H,Ran S.Proc Nacl Acad Sic USA,2002,99:7866-7871)。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的融合蛋白,名称为FK5,是具有序列表中SEQ ID №:2氨基酸残基序列的蛋白质,或者是将SEQ ID №:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №:2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №:2衍生的蛋白质。
序列表中序列2的氨基酸残基序列是由102个氨基酸残基组成的蛋白质。
一种融合蛋白编码基因,名称为FK5是下列核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQ ID №:1的DNA序列;
2)编码序列表中SEQ ID №:2蛋白质序列的多核苷酸;
3)与序列表中SEQ ID №:1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列1中的DNA序列由306个碱基组成。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
扩增该融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
该蛋白同时具有抑制增殖和迁移的双重功效,比单一的任何一种将具有更好的疗效。细胞实验证明,本发明的融合蛋白可有效地抑制血管内皮细胞的增殖,从而抑制血管的新生,进一步可抑制肿瘤生长;该融合蛋白可用于制备治疗新生血管异常生成引起的疾病(如肿瘤)的药物,具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pPIC9K-FK5的转化菌培养液的上清液电泳图谱
图2融合蛋白FK5抑制人脐静脉内皮细胞实验结果
具体实施方式
实施例1、融合蛋白FK5的表达
1、融合蛋白编码基因的合成和表达载体的构建
以5’-cttcctcgagatgtgtacaactcactggggtttcacactttgcaaaagagatgtagagac和3’-tagcgaattcgcaaagtgtgaaaccccagtgagttgtacattatcaggcacactgagg为引物,以Kringle-PET21b载体为模板(Intravitreal injection of plasminogen kringle 5,an endogenous angiogenic inhibitor,arrests retinal neovascularization inrats.Zhang D;Kaufman PL;Gao G;Saunders RA;Ma JX Diabetologia,2001Jun,44(6):757-65)进行PCR扩增,将人工合成编码C T T H W G F T L C十肽的DNA序列(序列表中的序列3)连接到K5的N端编码基因(序列表中的序列4)上。所采用的PCR条件为94℃30秒55℃30秒72℃1分钟。所获得的PCR产物两端具有XhoI和EcoRI限制性内切酶位点,利用XhoI和EcoRI的酶切位点,按照常规方法将通过PCR合成的融合DNA序列连接入高效表达质粒pPIC9K(购自美国Invitrogen公司),得到重组质粒pPIC9K-FK5。经过常规方法测序,证明融合DNA序列(序列表中的序列1)正确。
2、融合蛋白FK5的表达
将重组质粒pPIC9K-FK5用SacI线性化,采用浙江新芝公司电基因导入仪,将线性化的重组质粒pPIC9K-FK5导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内,经培养,挑选,His+和G418筛选,获得抗G418 2mg/ml的单克隆菌。挑选单克隆菌,接种于5ml YPD培养基中,30℃过夜,然后转入250ml BMGY培养基中,继续培养至OD600=2-3,收集菌体,用无碳源BMMY培养基稀释至OD600=1,继续培养,每隔24小时加甲醇一次,加入甲醇至终浓度为0.5%诱导表达,至96小时。离心取上清液。取10ul上清液,用10%tricin SDS-PAGE电泳,并经考马斯亮兰染色。结果如图1所示,在11KD的位置,融合蛋白的分子量为11KD,这表明该菌株在甲醇诱导下,可以表达FK5。图1中,泳道1为重组质粒pPIC9K-FK5的转化菌培养液的上清液电泳结果,泳道2为分子量标准。
3、融合蛋白的纯化
将上清液按照常规方法,经硫酸铵沉淀和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow和DEAE Sepharose柱层析进行纯化,获得纯化的FK5。经验证,经上述纯化的FK5的纯度95%。
实施例2、融合蛋白FK5抑制人脐静脉内皮细胞实验
材料
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自北大医院肿瘤研究所;MTT购自Amresco公司;细胞培养液1640购自GIBCO公司;小牛血清来自BIO WHITTAKER公司。
人脐静脉内皮细胞株在1640,10%FBS培养基中,37℃培养1天。将培养好的细胞按105个均等转移至12孔细胞板中,每孔1ml培养基,37℃下继续培养一天,然后更换为0.5ml 5%FBS的1640,分别加入实施例1中纯化的FK5使其终浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml,同时分别设加入相同浓度的天然的K5和bk5对照,以及0.02M的磷酸盐缓冲溶液对照和未加任何形式的K5的人脐静脉内皮细胞株培养物作为空白对照。其中,先将FK5,nk5和bk5用0.02M的磷酸盐缓冲溶液溶解,再加入上述培养基中。处理半小时,补加0.5ml 5%FBS的1640,培养3天后每孔加入100ml 5mg/ml MTT,4小时后吸干培养基加入2ml无水乙醇,570nm检测紫外吸收情况。结果如图2所示,融合蛋白FK5具有更好的抑制内皮细胞增殖的作用其抑制效果,其抑制效率比天然k5提高15%左右。图2中,ck为未加FK5的空白对照;pbs为FK5,nk5和bk5的溶解缓冲液-磷酸盐缓冲液,设为对照;nk5为天然的k5(Intravitreal injection of plasminogen kringle 5,an endogenous angiogenicinhibitor,arrests retinal neovascularization in rats.Zhang D;Kaufman PL;Gao G;Saunders RA;Ma JX Diabetologia,2001 Jun,44(6):757-65)。bk5为K5突变体(在天然K5的氨基酸序列中,去除了首尾的两个半胱氨酸,突变掉了自氮端的第3个半胱氨酸为苯丙氨酸);rk5为本发明的融合蛋白FK5。
序列表
<160>4
<210>1
<211>306
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tgtacaactc actggggttt cacactttgc aaaagagatg tagagactcc ttccgaagaa 60
gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcaaccac tgttactggg 120
acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 180
acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 240
ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 300
tgtgcc 306
<210>2
<211>102
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys Lys Arg Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly
20 25 30
Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala
35 40 45
Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg
50 55 60
Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly
65 70 75 80
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys
85 90 95
Asp Val Pro Gln Cys Ala
100
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tgtacaactc actggggttt cacactttgc 30
<210>4
<211>276
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>4
ccagatgtag agactctttc cgaagaagac tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga 60
ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc 120
catagacaca gcattttcac tccagagaca aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac 180
tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa 240
ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt gcggcc 276
Claims (7)
1、一种融合蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2、一种融合蛋白编码基因,是下列核苷酸序列之一:
1)SEQ ID NO:1所示的多核苷酸;
2)编码SEQ ID NO:2氨基酸序列的多核苷酸。
3、根据权利要求2所述的基因,其特征在于:其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
4、含有权利要求2所述基因的表达载体。
5、含有权利要求2所述基因的细胞系。
6、权利要求1所述融合蛋白在制备治疗新生血管不正常生长引起的疾病的药物中的应用。
7、权利要求1所述融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410006549 CN1298743C (zh) | 2004-03-08 | 2004-03-08 | 一种融合蛋白及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410006549 CN1298743C (zh) | 2004-03-08 | 2004-03-08 | 一种融合蛋白及其编码基因与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1666997A CN1666997A (zh) | 2005-09-14 |
CN1298743C true CN1298743C (zh) | 2007-02-07 |
Family
ID=35038302
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200410006549 Expired - Lifetime CN1298743C (zh) | 2004-03-08 | 2004-03-08 | 一种融合蛋白及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1298743C (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101768219B (zh) * | 2008-12-30 | 2012-11-21 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种重组融合蛋白及其制备方法和应用 |
CN101870734B (zh) * | 2010-05-25 | 2012-06-20 | 北京大学 | 一种抑制新生血管生成的融合多肽及其编码基因与应用 |
-
2004
- 2004-03-08 CN CN 200410006549 patent/CN1298743C/zh not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1666997A (zh) | 2005-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2583082T3 (es) | Variantes de plasminógeno y plasmina | |
RU2007105677A (ru) | Модифицированные витамин к-зависимые полипептиды | |
RU2009128647A (ru) | Варианты дезинтегрина и их фармацевтическое применение | |
DK161097B (da) | Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia | |
RU2004112768A (ru) | Полипептиды фактора коагуляции vii человека | |
EA201170917A1 (ru) | Ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, кодируемый им фермент, рекомбинантные векторы и хозяева, фармацевтические композиции и их применения, способы лечения и предупреждения болезней | |
HRP20100340T1 (hr) | Polipeptidi koji imaju antimikrobno djelovanje i polinukleotidi koji ih kodiraju | |
JP2009507474A5 (zh) | ||
JPH0866194A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子ミューテインをコードする遺伝子 | |
CN1869072A (zh) | 与胶原特异结合的神经生长因子及其编码基因与应用 | |
CN101134105A (zh) | 用于治疗和/或预防脑梗塞的含有重组人胰激肽原酶的药物组合物 | |
CN1298743C (zh) | 一种融合蛋白及其编码基因与应用 | |
RU2013111675A (ru) | Рекомбинантный fc-гибридный белок пятого домена фибронектина типа iii dcc | |
CN106282148A (zh) | 一种酶活提高的天冬酰胺酶突变体 | |
CN1865286A (zh) | 双功能表皮生长因子及其制备方法和用途 | |
CN1170928C (zh) | 一种肝癌相关基因及其应用 | |
CN1207305C (zh) | 一种重组人白细胞介素-11的制备方法 | |
CN101063130A (zh) | 对趋化因子受体cxcr4具有表型敲除效应的重组蛋白及其构建方法 | |
CN1294987C (zh) | 心肌肌钙蛋白i在制备抑制肿瘤药物中的应用 | |
CN1325442A (zh) | 衍生自人凝血酶原的内皮细胞增殖抑制剂 | |
CN1800218A (zh) | 肿瘤新生血管特异性结合多肽与重组人Tum-5融合蛋白及其制备方法 | |
CN1536082A (zh) | 水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株 | |
CN1289141C (zh) | 一种抑制血栓形成的药物 | |
CN1185342C (zh) | 编码人甲状旁腺激素的寡核苷酸及其高效表达方法 | |
CN1259337C (zh) | 人甲状旁腺激素基因突变体合成、表达、制备及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20070207 |
|
CX01 | Expiry of patent term |