CN1295079A - 液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法及其中间体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法及其中间体,以解决用常规液相合成方法合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链困难的问题;本发明的方法包括以下步骤:(1)、合成Boc－R－OSu;(2)、合成HCl.X(r－OCH3)－OH;(3)、将步骤(1)及(2)的产物进行反应,合成Boc－R－X(r－OCH3)－OH;(4)、将步骤(3)的产物脱除保护基并氨解,生成H2N－CHR－X’－O,其中R代表氨基酸或肽;X’表示谷氨酰胺或天门冬酰胺,本发明可广泛用于合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺的二肽、三肽及多肽。
Description
本发明涉及肽链的合成方法及其中间体物质，特别是液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法及其中间体。
谷氨酰胺是人体中含量最多的氨基酸，它在肌肉和血浆中的氨基酸总量约分别为75％和26％。在肌肉蛋白质中，游离的谷氨酰胺占细胞内总氨基酸库的61％，比所有其它氨基酸总量还高。谷氨酰胺在维持肠道机能，促进免疫功能，维持体内酸碱平衡及提高机体对应激的适应等方面都发挥着极其重要的生理作用，它是生物合成核酸的必需前体物质，是蛋白质合成与分解的调节物，是氨基氮在组织间转运的载体，是肾脏排泄氨的重要基质，是肠粘膜上皮细胞、肾小管细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的重要能量物质。
在临床上，一些高消耗性疾病(如严重感染、严重创伤、大手术、大面积烧伤与恶性肿瘤后期等)对谷氨酰胺的需要大大超过了机体合成的能力。如果没有外源性谷氨酰胺的补充，会导致病情进一步恶化，所以及时有效地补充谷氨酰胺是十分重要的。但谷氨酰胺的理化性质限制了它在临床上的应用，谷氨酰胺在水中的溶解度差，20℃时，1升水中只能溶解35克，与其它氨基酸相比溶解度低，而且不能达到外源补充(尤其是肠外营养补充)的有效浓度，很难达到有效血药浓度，谷氨酰胺不稳定、易水解，特别是在受热后，容易形成毒性物质焦谷氨酸和氨。
体内的天门冬酰胺在游离状态下的生理作用虽然没有谷氨酰胺那么重要，但它是一些具有重要生理作用的肽的不可缺少的残基，例如由13个残基组成的神经紧张肽可由下丘脑中提出，在中枢神经系统中广泛分布，有降压和升血糖作用，其第8位即为天门冬酰胺。由8个氨基酸残基组成的T肽，第6位为天门冬酰胺，是艾滋病病毒的抑制剂。但天门冬酰胺与谷氨酰胺一样，在水中的溶解度很差。
研究表明，若将谷氨酰胺、天门冬酰胺经化学修饰形成肽，则可达到溶解度高、稳定性好的效果。Ala-Gln的溶解度是谷氨酰胺的16倍，且稳定性好，配成静脉营养液后加热消毒不会形成焦谷氨酸和氨，经静脉注射后在体内经二肽酶作用迅速分解释放出谷氨酰胺，生物利用率高、半衰期短、没有积累作用。在传统的全肠外营养液(TPN)中加入Ala-Gln，给予疾病模型动物，结果是动物的肠功能得到有效的维持和恢复，肝脏、肌肉等的蛋白质合成增加，动物的成活率提高；健康志愿者试验表明：Ala-Gln不仅安全，生物利用率高，而且在体内很快经二肽酶水解释放出谷氨酰胺。初步观察的肿瘤病人和腹部大手术病人显示：给予Ala-Gln组，氮平衡、副反应、淋巴细胞、平均住院时间等指标明显好于对照组。
按照普通的液相合成肽链的方法，合成含谷氨酰胺或天门冬酰胺的肽链应该是用谷氨酰胺或天门冬酰胺与氨基酸或肽链直接偶联，但由于谷氨酰胺和天门冬酰胺的溶解度差，且在大多数有机溶剂中都不溶，应用常规液相合成方法很难得到谷氨酰胺和天门冬酰胺的寡肽或多肽。目前，制备含有谷氨酰胺及天门冬酰胺残基的寡肽或多肽多采用生物技术的方法，例如Ala-Gln二肽的制备是先用发酵法制备谷氨酰胺，然后再用酶催化合成(Veselkova A，Plachy J，Zeman R， The dipeptideL-alanyl-L-glutamine--its preparation and therapeutic use.Ceska Slov Farm，1996，45：14-6)，但生物技术的方法一般工艺操作复杂，且需贵重纯化设备。
本发明的目的是提供一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法，包括以下步骤：
(1)、将需要与谷氨酰胺、天门冬酰胺偶联的氨基酸或肽的-N端及-COOH端分别进行保护，形成B-R-A，其中：
R代表氨基酸或肽；
B代表苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)；
A代表活泼酯，优选为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、对硝基酚酯(ONP)、2，4，5-三氯酚酯(OCP)、五氯酚酯(OPCP)、五氟酚酯(OPFP)或哌啶酯(OPIP)；
(2)、合成HCl.X(I-OCH3)-OH
其中：X代表谷氨酸或天门冬氨酸，当X代表谷氨酸时，I代表r；当X代表天门冬氨酸时，I代表β；
(3)、将步骤(1)及步骤(2)的产物进行反应，合成B-R-X(I-OCH3)-OH，其中：
R代表氨基酸或肽；
X代表谷氨酸或天门冬氨酸，当X代表谷氨酸时，I代表r；当X代表天门冬氨酸时，I代表β；
B代表苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)；
(4)、将步骤(3)的产物脱除保护基并氨解，生成H2N-R-X’-OH，其中：
R代表氨基酸或肽；
X’代表谷氨酰胺或天门冬酰胺。
本发明的另一个目的是提供一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链过程中的中间体。
该中间体的化学通式为B-R-X(I-OCH3)-OH，其中：
R代表氨基酸或肽；
X代表谷氨酸或天门冬氨酸，当X代表谷氨酸时，I代表r；当X代表天门冬氨酸时，I代表β；
B代表苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)。
本发明由于采用了上述方法，使液相合成含谷氨酰胺或天门冬酰胺的寡肽或多肽成为可能，可以进行稳定的规模化生产，成本低，从根本上解决了谷氨酰胺和天门冬酰胺溶解度差、液相合成困难的问题。
本发明的意义在于：
1．在寡肽或多肽的液相合成中，直接应用谷氨酰胺、天门冬酰胺参加反应，由于存在溶解度差的问题，反应不易实现，而谷氨酸、天门冬氨酸经酯化，氨解后与被保护的氨基酸的活泼酯较易转化形成为含谷氨酰胺和天门冬酰胺的二肽、三肽和多肽。
2．本发明应用液相多肽化学合成技术，合成的含谷氨酰胺或天冬酰胺的二肽、三肽和多肽，纯化方便，不需昂贵的纯化设备，经过重结晶即可达到一定的纯度，便于工业化生产。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、丙氨酰一谷氨酰胺二肽的合成
以丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)为原料。Ala的氨基经Boc试剂保护，羧基经N-羟基琥珀亚胺活化，得到Boc-Ala-Osu；Glu先形成谷氨酸的γ甲酯，然后与Boc-Ala-Osu反应，得到Boc-Ala-Glu(γ-COOCH3)-OH，二肽中间体再经脱除Boc和氨解后得到目的化合物Ala-Gln二肽，步骤如下：
1．Boc-Ala-OH(M.w.=190.2)的合成
将8.9g(0.1mmol)L-Ala溶于100ml水，100ml1N NaOH水溶液和200ml二氧六环的混合液中，在冰浴中冷却，加入24g(0.11mmol)焦碳酸二叔丁酯。于室温搅拌半小时，将反应液减压浓缩至100-150ml，外用冰浴冷却，用300ml AcOEt(乙酸乙酯)覆盖液面，以KHSO4的稀溶液酸化水相至pH3-4，立即用AcOEt提取水相4-5次，用水洗有机相两次(300ml×2)，以无水MgSO4干燥有机相过夜。过滤，除溶剂，向残余油状物中加入少量Boc-Ala-OH晶种，再加石油醚稀释，放入冰箱过夜。过滤，收集结晶干燥后得16.0g，收率84.2％，熔点80-82℃。
2．Boc-Ala-OSu(M.w.=287.2)的合成
将40.0g(0.2103mol)Boc-Ala-OH和24.21g(0.2103mol)SuOH溶于干燥的二氧六环中，外用冰浴冷却至0℃，搅拌加入43.43g(0.2103mol)DCC(碳二亚胺)。将反应混合物保持在0～5℃之间过夜。滤出DCU，用少量二氧六环洗涤沉淀，合并滤洗液，减压浓缩。析出物用乙腈溶解，过滤，将滤液浓缩，固体用异丙醇重结晶，过滤，收集固体，干燥后得40.1g，收率68.0％，熔点152-154℃。
3．HCl.Glu(γ-OCH3)-OH(M.w.=197.5)的合成
将56.0ml无水甲醇冰冷，剧烈搅拌下滴入8.0ml SOCl2，搅拌片刻后，加入12.0g(0.2mol)L-Glu。维持冰冷搅拌20分钟后，移去冰浴，于室温旋转蒸发除尽溶剂和SOCl2，加入无水乙醚至沉淀完全析出。冷却，过滤，以无水乙醚洗沉淀，经P2O5真空干燥，得12.5g，产率77.6％，熔点151-153℃。
4．Boc-Ala-Glu(γ-OCH3)-OH(M.w.=333.2)的合成
将23g(0.11495mol)HCl.H-Glu(OCH3)-OH溶于140ml 14.0％(相当于0.2299mol)的NaHCO3水溶液中。在搅拌下加入30.0g(0.1045mol)Boc-Ala-OSu溶于140ml二氧六环的溶液，于室温反应，待反应完毕后，将反应混合物外用冰盐浴冷却，搅拌，徐徐滴加10％NaHSO4水溶液至酸性。在冰盐浴中析出的油状物立即用AcOEt提取4-5次，有机相用5％柠檬酸水溶液、水各洗2次。将有机相用MgSO4干燥，除溶剂得油状残余物34.5g，即为中间体Boc-Ala-Glu(γ-OCH3)-OH(M.w.=333.2)，产率：99.1％。
5．Ala-Glu(γ-OCH3)-OH(M.w.=233)的合成
将33.32 g(0.1mol)Boc-Ala-Glu(OCH3)-OH溶于20.0ml干燥二氯甲烷中，外用冰浴冷却至0℃，加入10ml TFA。维持0℃反应30分钟后减压除去TFA，所得残余物(Rf值为0.70)直接用于下一步反应。
6．H-Ala-Gln-OH(M.w.=217.15)的合成
向上一反应后所得残余物中加入100ml氨水，室温氨解48小时。减压浓缩至20ml左右，加入80ml丙酮沉淀出固体，过滤，干燥得粗品18.5g。用水和丙酮混合溶剂重结晶，得纯品15.5g，产率：71.4％，熔点210-212℃。
7．所得产物丙氨酰-谷氨酰胺二肽的分析鉴定：
(1)．熔点
文献值：212-214℃
测定值：210-212℃
(2)．旋光
文献值：[α]d 12=11.2°
测定值：[α]d 20=10.4°
(3)．分析元素 C H N
理论值：44.24 6.91 19.35
分析值：44.23 7.03 19.38
(4)．质谱
理论值：217.15(M)
测定值：218(M+1)
(5)．核磁共振谱
其结果与Sigma对照品一致。
上述实施例中，各步骤的反应方法及条件均是常规的，发明点在于突破了常规的液相合成方法，创造了新的工艺路线。
实施例2：甘氨酰-谷氨酰胺二肽的合成
基本的步骤与实施例1相同，只是将丙氨酸换成甘氨酸，N-端的保护基为9-苯甲氧羰基(Fmoc)，-COOH端的活泼酯为对硝基酚酯(ONP)。本实施例所得到的中间体为Fmoc-Gly-Glu(γ-OCH3)-OH。
实施例3：丙氨酰-天门冬酰胺的合成
基本的步骤与实施例1相同，将谷氨酸换成天门冬氨酸即可。本实施例中所得到的中间体为Boc-Ala-Asp(β-OCH3)-OH。
本发明的方法不仅适用于合成二肽、三肽、还可用于合成含谷氨酰胺或天门冬酰胺的多肽，其合成的原理是一样的。
本发明中-N端的保护基可是苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)；-COOH端的保护基为活泼酯，优选为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、对硝基酚酯(ONP)、2，4，5-三氯酚酯(OCP)、五氯酚酯(OPCP)、五氟酚酯(OPFP)或哌啶酯(OPIP)。
Claims (9)
1、一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、将需要与谷氨酰胺、天门冬酰胺偶联的氨基酸或肽的-N端及-COOH端分别进行保护，形成B-R-A，其中：
R代表氨基酸或肽；
B代表苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)；
A代表活泼酯，优选为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、对硝基酚酯(ONP)、2，4，5-三氯酚酯(OCP)、五氯酚酯(OPCP)、五氟酚酯(OPFP)或哌啶酯(OPIP)；
(2)、合成HCl.X(I-OCH3)-OH
其中：X代表谷氨酸或天门冬氨酸，当X代表谷氨酸时，I代表r；当X代表天门冬氨酸时，I代表β；
(3)、将步骤(1)及步骤(2)的产物进行反应，合成B-R-X(I-OCH3)-OH，其中：
R代表氨基酸或肽；
X代表谷氨酸或天门冬氨酸，当X代表谷氨酸时，I代表r；当X代表天门冬氨酸时，I代表β；
B代表苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)；
(4)、将步骤(3)的产物脱除保护基并氨解，生成H2N-R-X’-OH，其中：
R代表氨基酸或肽；
X’代表谷氨酰胺或天门冬酰胺。
2、根据权利要求1所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法，其特征在于：所述步骤(3)是在冰盐浴冷却的条件下，用NaHSO4水溶液调pH至酸性。
3、根据权利要求1或2所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法，其特征在于：所述R代表丙氨酸、甘氨酸或精氨酸。
4、根据权利要求3所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法，其特征在于：所述R代表丙氨酸，所述X’代表谷氨酰胺。
5、根据权利要求3所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的方法，其特征在于：所述R代表甘氨酸，X’代表谷氨酰胺。
6、一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的中间体，其化学通式为B-R-X(I-OCH3)-OH，其中：
R代表氨基酸或肽；
X代表谷氨酸或天门冬氨酸，当X代表谷氨酸时，I代表r；当X代表天门冬氨酸时，I代表β；B代表苄氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)或9-苯甲氧羰基(Fmoc)。
7、根据权利要求6所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的中间体，其特征在于：所述R代表丙氨酸、甘氨酸或精氨酸。
8、根据权利要求7所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的中间体，其特征在于：所述R代表丙氨酸，X代表谷氨酸。
9、根据权利要求7所述的一种液相合成含谷氨酰胺、天门冬酰胺肽链的中间体，其特征在于：所述R代表甘氨酸，X代表谷氨酸。
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|---|---|---|---|---|
| CN100343275C (zh) * | 2003-03-19 | 2007-10-17 | 四川三高生化股份有限公司 | 一种甘氨酰谷氨酰胺的制备方法 |
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