CN1293193C - 具抗血栓作用的日本七鳃鳗口腔腺kgd模体蛋白的基因克隆与表达 - Google Patents

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“具抗血栓作用的日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白的基因克隆与表达”属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中一条具KGD模体蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其与血小板细胞膜上糖蛋白gpIIb/IIIa结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓形成的生物学活性，可在制备抗血栓药物中应用。

Description

具抗血栓作用的日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白的基因克隆与表达
技术领域
具抗血栓作用的日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白的基因克隆与表达属于生物技术领域，涉及到日本七鳃鳗口腔腺中一条具KGD模体蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其与血小板细胞膜上糖蛋白gpIIb/IIIa专一性结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受体构象的改变，阻断受体与多种配体的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓形成的生物学活性，可在制备抗血栓药物中应用。
背景技术
称为“抗血小板药物”的一类药物已经被作为治疗血栓性疾病的有效手段在临床上得到广泛应用。正常情况下，体内止血、凝血系统与纤溶系统处于生理性平衡，保持正常血流状态。但在一些病理情况下，如血管内膜损伤或静脉血流阻滞时，由于血小板活化并粘附到内皮下组织，进而引发一系列止血、凝血过程，最后形成了血栓。血小板在血栓形成，特别是动脉血栓形成过程中起着重要作用。当血管内皮损害暴露内皮下组分时，血小板就会被活化，发生血小板的粘附和聚集。血栓的主要成分是由活化的血小板和纤维蛋白组成。因此，特异的抗活化血小板和抗纤维蛋白的药品可以作为血栓导向剂。目前所研制的抗血小板抗体主要是针对活化血小板上两个主要位点而制备的：(①GPIIb/IIIa②GMP140。而最有效的抗血小板药物就是GPII b-IIIa拮抗剂，因为不管通过什么受体，什么代谢途径，最后必须通过GP II b-IIIa复合物的纤维蛋白原受体，血小板才能发生“聚集”而形成血栓(Huang TF et al.，1987)(Shebuski RJ et al.，1989)。
KGD(1-2)序列能特异性与血小板细胞膜上糖蛋白GPIIb/IIIa特异性结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受体构象的改变，阻断受体与多种配体的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，阻断血栓的形成。由于KGD模体蛋白为血小板糖蛋白GPIIb/IIIa抑制剂，其凭借所具有的KGD模体专一与血小板糖蛋白GPIIb/IIIa结合而与血管内皮细胞表面表达的整合素α、β的结合能力却极低或没有，这个特性将使KGD模体蛋白具有强效抗凝功能，而却无溶血等副作用。由此可见，KGD序列多肽将成为GPIIb/IIIa拮抗剂中的主力军，具有抗血栓药物开发的重要价值。
目前在自然界只在毒蛇中发现了两种具KGD模体的天然蛋白：美国响尾蛇蛇毒barbourin(1)和乌苏里蝮蛇毒Ussurista(2)，而本项目的日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白Lampetrin4的cDNA序列及其蛋白序列及功能在国内外尚无人研究和报道，本发明在世界上尚属首次发现。
参考文献：
1.Scarborough RM，Rose JW，Hsu MA，Phillips DR，Fried VA，Campbell AM，Nannizzi L，et al.Barbourin，a GPIIb-IIIa-specificintegrin antagonist from the venom of sistrurus m.barbouri J Biol Chem，1991，266(15)：9359-9362
2.Oshikawa K and Terada S.Ussuristatin2，a novel KGD-bearing disintegrin from Agkistrodon ussuriensis venom.J Biol Chem.1999，125.
发明内容
日本七鳃鳗(Lampetra japonica)属圆口纲(Cyclostomata)、七鳃鳗目、七鳃鳗科、七鳃鳗属，是迄今发现的最古老的无颌脊椎动物。其为海洋洄游性鱼类，成体生活在海洋，经常用吸盘附在其它鱼体上吸食其血与肉，使被吸附的鱼血流不止。日本七鳃鳗的这种独特生活习性暗示着其口腔腺中必定具有强效抗凝物质。
本发明在于从日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中发现了一条能翻译出KGD(Lys-Gly-Asp)模体的开放阅读框，经对其mRNA全长的进行钓取、测序、生物信息学分析后发现，这条基因为在自然界首次发现，为来源于日本七鳃鳗的KGD多肽新基因。经对其进行cDNA克隆后，对其重组蛋白在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。此KGD重组蛋白的生物学活性涉及到抗血小板聚集进而抗血栓形成之功能。
本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺中一条具KGD模体蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其抑制血小板聚集的最终共同通路从而阻断血栓形成的生物学活性。
本发明从日本七鳃鳗口腔腺中分离提取mRNA，利用从前期构建的cDNA文库、EST文库中获得的生物学信息及mRNA全长钓取的测序结果选取开放阅读框设计引物，采用RT-PCR方法获得了一条KGD蛋白的cDNA及其序列，本发明还提供了其在大肠杆菌BL21中成功表达的蛋白及其序列，此KGD模体重组蛋白具抗血小板聚集的作用，可以在制备抗血栓药物中应用。
此KGD模体蛋白被命名为Lampetrin4，其cDNA序列381bp长，其蛋白质由127个氨基酸组成，含一个KGD模体，蛋白分子量为12,954Da。其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列为：
1   atggcctccaggctgcttctacgagcgtctctcaacgccggccgt
    M  A  S  R  L  L  L  R  A  S  L  N  A  G  R
46  cgtgtcgcggccgtcgggagcgtgagaccggcgatgcgagccatg
    R  V  A  A  V  G  S  V  R  P  A  M  R  A  M
91  gcgagcggaggtggcatccccactgatgaagaacaggccacgggc
    A  S  G  G  G  I  P  T  D  E  E  Q  A  T  G
136 ttggagaggttgaccatggaggctaagaaaaaaggcactgacccc
    L  E  R  L  T  M  E  A  K  K  K  G  T  D  P
181 tggagcattgagccacccaagacttacgcaggaaccaaggaagat
    W  S  I  E  P  P  K  T  Y  A  G  T  K  E  D
226 ccacacattgtgccgtccattggtgaaaagcggctgatcggctgc
    P  H  I  V  P  S  I  G  E  K  R  L  I  G  C
271 atctgtgaggaggacaacacagctgtggtgtggttctggctgcac
    I  C  E  E  D  N  T  A  V  V  W  F  W  L  H
316 aagggtgactgccagcgctgcccttcttgtggtgcctcctacaag
    K  G  D C  Q  R  C  P  S  C  G  A  S  Y  K
361 ctcgttccccacgagctgccgcactga 387
    L  V  P  H  E  L  P  H  *
于大肠杆菌中表达的重组KGD模体蛋白Lampetrin4具有抑制由ADP诱导的人血小板聚集的作用，其作用的IC50为6.4μmol/L。
附图说明
图1为本发明实验步骤流程示意图；
图2为重组KGD模体蛋白Lampetrin4对ADP诱导的人血小板聚集抑制作用曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的描述.
1.总RNA的提取：采用GIBCO BRL的Trizol试剂。具体如下：
(1)取日本七鳃鳗口腔腺迅速置于液氮中保存；
(2)称取0.2g毒腺组织，加1ml TRIzol试剂制备毒腺匀浆，4℃孵育5min；
(3)加0.2ml氯仿，盖紧盖后用力振摇15sec，然后置于冰上5min；
(4)4℃，12000xg，离心15min；
(5)将上层水相移入另一离心管，加0.5ml异丙醇，并在冰上孵育10min；
(6)4℃，12000xg，离心15min；
(7)弃上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗涤，旋涡混匀；
(8)4℃，10000xg离心5min，得到RNA沉淀；
(9)空气干燥后，用适量TE或无Rnase水溶解备用。
2.以自行设计的引物进行RT-PCR扩增，以获得日本七鳃鳗口腔腺KGD模体蛋白的cDNA；按以下条件进行反转录反应：42℃20min，99℃5min，5℃5min引物序列如下：P1：5’-XXcatatggcctccaggctgcttctacga-3’P2：5’-XXaagcttgtgcggcagctcgtggggaac-3’
3.将获取的目的cDNA与pET23b(Novagen公司产品)载体相连接，转化入克隆菌DH5a后进行阳性转化子的筛选鉴定；为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET23b做为基因克隆的载体，克隆具体操作如下：
(1)目的基因的回收与测序：目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit进行；对回收DNA进行测序，此项工作由大连宝生物工程有限公司完成。
(2)质粒的提取：采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。
(3)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接：由于所设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。
(4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coli BL21中。
(5)阳性转化子的筛选鉴定：利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定。
(6)对阳性重组子进行终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为30℃过夜诱导。表达产物命名为Lampetrin4；
4.对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。
(1)10000g离心10min收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100ml的原培养液加4ml冰冷的1X Binding buffer的比例重悬细胞。
(2)将上述样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。
(3)14000g离心20min以去除细胞碎片。
(4)上清以0.45μm的滤膜过滤。
(5)吸去His.Bind Column上室的贮液，并打开下面管口；
(6)用10ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；
(7)将过滤好的上清液上样；
(8)用10ml的1x Binding Buffer洗柱；
(9)用10ml的1x Wash Buffer洗柱；
(10)用5ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白。
5.运用LBY-NJ2型血液凝聚仪利用人富含血小板血浆(PRP)系统进行血小板聚集实验。
(1)人富含血小板血浆(PRP)与贫血小板血浆(PPP)的制备
A)采集人空腹全血加入装有3.28％枸椽酸钠的塑料离心管中，血液与枸椽酸钠的比例为9∶1。
B)1000rpm室温离心5min，取米黄色上清即为人富含血小板血浆(PRP)；
C)将余液继续以4000g室温离心10min，取上清即为人贫含血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)。
(2)测定重组蛋白对ADP诱导的人血小板聚集的抑制作用
A)取2只比色杯，分别加入PPP和PRP各300μl，置于聚集仪中37℃预热5min，用PPP校零，测定PRP中的血小板数。然后用PPP稀释PRP，调整血小板数至3×105/μl；
B)将PPP、用PPP调整后的加入30ul的PBS或不同浓度Lampetrin4的PRP置于LBY-NJ2型血液凝聚仪中37℃温育3min；
C)以PPP调零；
D)将PRP样品加入终浓度为3μmol/L的ADP启动血小板的凝聚反应；
E)比浊法测定Lampetrin4对血小板聚集的抑制作用，测定PAG1(1min聚集度)、PAG3(3min聚集度)、PAG5(5min聚集度)、MA(最大聚集度)。取对最大聚集度的抑制率作为参数作图。

Claims (8)

1.一种来源于日本七鳃鳗口腔腺的KGD(Lys-Gly-Asp)模体蛋白，其特征在于此蛋白质由127个氨基酸组成，含一个KGD(Lys-Gly-Asp)模体，蛋白分子量为12，954Da，此KGD模体蛋白被命名为Lampetrin4，且由如下氨基酸序列组成：
M  A  S  R  L  L  L  R  A  S  L  N  A  G  R
R  V  A  A  V  G  S  V  R  P  A  M  R  A  M
A  S  G  G  G  I  P  T  D  E  E  Q  A  T  G
L  E  R  L  T  M  E  A  K  K  K  G  T  D  P
W  S  I  E  P  P  K  T  Y  A  G  T  K  E  D
P  H  I  V  P  S  I  G  E  K  R  L  I  G  C
I  C  E  E  D  N  T  A  V  V  W  F  W  L  H
K  G  D  C  Q  R  C  P  S  C  G  A  S  Y  K
L  V  P  H  E  L  P  H
2.编码根据权利要求1所述的来源于日本七鳃鳗口腔腺的KGD模体蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于它由如下的核苷酸序列组成：
1   atggcctccaggctgcttctacgagcgtctctcaacgccggccgt
46  cgtgtcgcggccgtcgggagcgtgagaccggcgatgcgagccatg
91  gcgagcggaggtggcatccccactgatgaagaacaggccacgggc
136 ttggagaggttgaccatggaggctaagaaaaaaggcactgacccc
181 tggagcattgagccacccaagacttacgcaggaaccaaggaagat
226 ccacacattgtgccgtccattggtgaaaagcggctgatcggctgc
271 atctgtgaggaggacaacacagctgtggtgtggttctggctgcac
316 aagggtgactgccagcgctgcccttcttgtggtgcctcctacaag
361 ctcgttccccacgagctgccgcactga 387
4.一种重组质粒，其特征在于它含有权利要求2或3的基因。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于所述基因连接于pET23b载体上。
6.一种基因工程菌，其特征在于它被根据权利要求4或5所述的重组质粒转化。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于其宿主细胞为E.coli BL21。
8.根据权利要求1所述的来源于日本七鳃鳗口腔腺的KGD模体蛋白在制备抗血栓药物中的应用。
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