CN1291025C - 固态发酵生产γ－亚麻酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固态发酵生产γ-亚麻酸的方法，生产γ-亚麻酸的菌种在通过液态或固态培养后作为种子，在适宜的条件下以谷物为主要原料进行固态发酵。固态发酵培养基组成(g/L)：谷物200.0-350.0，花生油3.0-8.0，玉米浆1.0-5.0，MgSO47H2O 0.1-0.5，K2HPO4 1.0-5.0，尿素1.0-5.0，余量为水；pH值6.0-6.2，121℃灭菌，30分钟。在无菌条件下，按5-10mL/100g固态培养基加入液态种子或按5-10g/100g固态培养基加入固态种子，发酵4-7天。产物油脂含量在5-20%，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达5-20%。可用于提取γ-亚麻酸，也可以干燥后粉碎作为食品添加剂使用或干燥粉碎后制成胶囊、片剂。本发明工艺简化、设备简单，投资少、成本低；有效解决污水排放问题，益于环保。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产γ-亚麻酸的方法，特别涉及一种固态发酵生产γ-亚麻酸的方法。
背景技术
γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid)简称GLA，分子式为C18H30O2，其结构为6，9，12-十八碳三烯酸，是人体的一种必需脂肪酸，在人体内由亚油酸转化而来。γ-亚麻酸作为人体合成前列腺素的前体物质，具有抗动脉粥样硬化、降低血清胆固醇浓度、降血压、抑制血小板凝集、增强免疫功能、保湿护肤等多种重要的生理活性作用。因此，γ-亚麻酸被认为是具有特殊医疗保健作用的营养素，已为世界上许多国家用于药品、保健食品和高级化妆品的生产。
目前，国内生产厂家通常采用两种生产方法，一种是从富含γ-亚麻酸的植物中(例如月见草等)提取，由于月见草为一年生植物产量少，并受地域、气候等因素影响大，因此从月见草等天然植物中提取的γ-亚麻酸价格昂贵。另一种是采用液态发酵法生产γ-亚麻酸，日本和英国在世界上率先开展液态发酵法生产γ-亚麻酸的研究工作。日本工业技术院化学技术研究所从1976年开始利用丝状真菌生产油脂的研究工作。此后，日本的资生堂公司、出光石油化学公司以及英国的一家公司相继采用发酵法商业化生产γ-亚麻酸。目前生产的菌丝体油脂含量已达35％以上，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量已达18％左右。但液态发酵方法涉及的生产设备要求比较复杂，生产中菌体易结块，因此投资大，加工成本高，同时废水的排放造成环境污染比较严重。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，针对目前γ-亚麻酸主要来源为植物提取和液体深层发酵法生产现状存在的问题，提供一种以谷物为培养基主要原料的固态发酵生产γ-亚麻酸的方法，意在简化其生产工艺，节能降耗、减小投资，并从根本上解决污水排放问题，益于环保。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案是：一种固态发酵生产γ-亚麻酸的方法，即采用固态发酵生物反应器发酵生产γ-亚麻酸，依次包括如下步骤：
(1)将γ-亚麻酸菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为24-28℃，培养4-5天，加入0.1-0.2％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量为1-2×105个；
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌的固态培养基上培养固态种子或再次液态扩大培养做成液态种子；液态种子培养基组成(g/L)：蔗糖10.0-30.0，玉米浆1.0-5.0，MgSO47H2O 0.1-0.5，K2HPO4 1.0-5.0，尿素1.0-5.0；pH值6.0-6.2，121℃灭菌，25分钟；经过摇瓶、种子罐常规扩大培养后作为液态种子；
(3)固态发酵培养基组成(g/L)：谷物200.0-350.0，花生油3.0-8.0，玉米浆1.0-5.0，MgSO47H2O 0.1-0.5，K2HPO4 1.0-5.0，尿素1.0-5.0，余量为水；pH值6.0-6.2，121℃灭菌，30分钟；在无菌条件下，按5-10mL/100g固态培养基加入液态种子或按5-10g/100g固态培养基加入固态种子，混合均匀铺在固态发酵的浅盘中，厚度0.5-2.5cm，湿度50-100％，通入0.2-1.5V/(V·min)无菌空气，温度为21-28℃，发酵4-7天；产物油脂含量在5-20％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达5-20％；
(4)发酵后产物处理：用于提取γ-亚麻酸，干燥后粉碎作为食品添加剂使用或干燥粉碎后制成胶囊、片剂。
所述谷物包括小米、小麦、大麦、燕麦、大米、糯米、玉米、高粱。
本发明的有益效果是：有效解决污水排放问题，消除废水污染，益于环保。同时简化其生产工艺过程，设备要求简单，投资少，加工成本低，易形成规模化生产。
具体实施方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1：
(1)将菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为25℃，培养5天。加入0.1％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量约1×105个。
(2)取20mL菌悬液接入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶中。摇瓶种子培养基(1L)：蔗糖30.0g，玉米浆3.0g，MgSO47H2O 0.2g，K2HPO4 3.0g，尿素3.0g，pH值6.1。温度为121℃灭菌，25分钟。摇瓶于25℃，转速为200转/分钟的摇床上培养36小时，作为种子液。
(3)按10％的接种量将摇瓶种子接入50L种子罐中。在50L种子罐中加入32L种子培养基。种子罐培养基(1L)：蔗糖30.0g，玉米浆3.0g，MgSO47H2O0.2g，K2HPO4 3.0g，尿素3.0g，pH值6.0，121℃灭菌，25分钟。温度为25℃±1℃，通气量1.5V/(V·min)，罐压0.02MPa，搅拌速度300转/分钟条件下发酵24小时。
(4)在无菌条件下，按5mL/100g固态培养基加入液体种子。固态发酵培养基组成(1Kg)：谷物275.0g，花生油5.0g，玉米浆5.0g，MgSO47H2O 0.2g，K2HPO4 3.0g，尿素3.0g，余量为水；pH值6.2，121℃灭菌，30分钟；降温至25℃后，混合均匀，铺在固态发酵反应器中，厚度2cm，湿度90％，通入0.9V/(V·min)无菌空气，温度为25℃，发酵5天。产物油脂含量在15.3％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达15.1％。谷物的选择包括小米、小麦、大麦、燕麦、大米、糯米、玉米、高粱等，还可选用榨汁后的水果、蔬菜渣，例如水果中的苹果、梨、桃等，以及蔬菜类的白菜、黄瓜、南瓜等。
(5)产物可直接提取γ-亚麻酸或于70℃干燥后粉碎作为食品添加剂使用以及制成胶囊、片剂。
实施例2：
(1)将菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为24℃，培养5天。加入以0.2％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量约1×105个。
(2)取10mL菌悬液接入100g固态培养基中。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油5.0g，玉米浆5.0g，MgSO47H2O 0.2g，K2HPO4 3.0g，尿素3.0g，余量为水；pH值6.1，121℃灭菌，30分钟。降温至25℃后，混合均匀，铺在固态发酵反应器中，厚度1.5cm，湿度100％，通入无菌空气0.8V/(V·min)，温度为25℃，发酵2天后作为固态种子。
(3)在无菌条件下，按5g/100g固态培养基加入固态种子。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油5.0g，玉米浆5.0g，MgSO47H2O 0.2g，K2HPO43.0g，尿素3.0g，余量为水；pH值6.0，121℃灭菌，30分钟。降温至25℃后，混合均匀，铺在固态发酵的浅盘中，厚度1.5cm，湿度75％，通入0.8V/(V·min)无菌空气，温度为27℃，发酵5天。产物油脂含量在15.9％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达14.5％。谷物的选择同实施例1。
(4)产物可直接提取γ-亚麻酸或于70℃干燥后粉碎作为食品添加剂使用以及制成胶囊、片剂。
实施例3：
(1)将菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为28℃，培养4天。加入以0.1％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量约1.5×105个。
(2)取20mL菌悬液接入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶中。摇瓶种子培养基(1L)：蔗糖30.0g，玉米浆3.5g，MgSO47H2O 0.3g，K2HPO4 4.0g，尿素3.0g，pH值6.2。121℃灭菌，25分钟。摇瓶于28℃，转速为200转/分钟的摇床上培养36小时，作为种子液。
(3)按10％的接种量将摇瓶种子接入50升种子罐中。在50L种子罐中加入32L种子培养基。种子罐培养基(1L)：蔗糖30.0g，玉米浆3.0g，MgSO47H2O0.2g，K2HPO4 3.0g，尿素3.0g，pH值6.1，121℃灭菌，25分钟。于28℃±1℃，通气量1.5V/(V·min)，罐压0.01MPa，搅拌速度300转/分钟条件下发酵24小时。
(4)在无菌条件下，按10mL/100g固态培养基加入液体种子。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油5.0g，玉米浆4.0g，MgSO47H2O 0.2g，K2HPO4 3.0g，尿素4.0g，余量为水；pH值6.0-6.2，121℃灭菌，30分钟。降温至28℃后，混合均匀，铺在固态发酵反应器中厚度2.5cm，湿度100％，通入0.7V/(V·min)无菌空气，温度为28℃，发酵4天。产物油脂含量在17.3％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达11.1％。谷物的选择同实施例1
(5)产物可直接提取γ-亚麻酸或于65℃干燥后粉碎作为食品添加剂使用以及制成胶囊、片剂。
实施例4：
(1)将菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为27℃，培养5天。加入以0.2％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量约2×105个。
(2)取10mL菌悬液接入100g固态培养基中。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油5.0g，玉米浆3.0g，MgSO47H2O 0.4g，K2HPO4 4.0g，尿素2.0g，pH值6.1，121℃灭菌，30分钟。降温至28℃后，混合均匀，铺在固态发酵的浅盘中，厚度2.0cm，湿度85％，通入无菌空气1.0V/(V·min)，温度为28℃，发酵2天后作为固态种子。
(3)在无菌条件下，按8g/100g固态培养基加入固态种子。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油5.0g，玉米浆3.0g，MgSO47H2O 0.4g，K2HPO44.0g，尿素3.0g。余量为水；pH值6.2，121℃灭菌，30分钟。降温至28℃后，混合均匀，铺在固态发酵反应器中，厚度1.5cm，湿度100％，通入1.0V/(V·min)无菌空气，温度为28℃，发酵4天。产物油脂含量在17.9％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达11.5％。谷物的选择同实施例1
(4)产物可直接提取γ-亚麻酸或于60℃干燥后粉碎作为食品添加剂使用以及制成胶囊、片剂。
实施例5：
(1)将菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为24℃，培养4天。加入以0.1％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量约1×105个。
(2)取20mL菌悬液接入装有80mL种子培养基的500mL三角瓶中。摇瓶种子培养基(1L)：蔗糖30.0g，玉米浆4.5g，MgSO47H2O 0.3g，K2HPO4 4.0g，尿素3.0g，pH值6.0。121℃灭菌，25分钟。摇瓶于28℃，转速为200转/分钟的摇床上培养24小时，作为种子液。
(3)按10％的接种量将摇瓶种子接入50L种子罐中。在50L种子罐中加入32L种子培养基。种子罐培养基(1L)：蔗糖30.0g，玉米浆3.0g，MgSO47H2O0.3g，K2HPO4 3.0g，尿素3.0g，pH值6.0，121℃灭菌，25分钟。于28℃±1℃，通气量1.5V/(V·min)，罐压0.02MPa，搅拌速度300转/分钟条件下发酵24小时。
(4)在无菌条件下，5mL/100g固态培养基加入液体种子。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油4.0g，玉米浆2.5g，MgSO47H2O 0.2g，K2HPO45.0g，尿素3.0g，余量为水；pH值6.0-6.2，温度为121℃灭菌，30分钟。降温至28℃后，混合均匀，铺在固态发酵反应器中厚度2.5cm，湿度100％，通入0.6V/(V·min)无菌空气，温度为21℃，发酵4天。产物油脂含量在8.3％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达9.1％。谷物的选择同实施例1
(5)产物可直接提取γ-亚麻酸或于70℃干燥后粉碎作为食品添加剂使用以及制成胶囊、片剂。
实施例6：
(1)将菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为28℃，培养4天。加入以0.1％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量约1.5×105个。
(2)取10mL菌悬液接入100g固态培养基中。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油3.0g，玉米浆3.5g，MgSO47H2O 0.3g，K2HPO4 5.0g，尿素3.0g，余量为水；pH值6.1，121℃灭菌，30分钟。降温至28℃后，混合均匀，铺在固态发酵的浅盘中，厚度2.0cm，湿度85％，通入无菌空气0.8V/(V·min)，28℃，发酵2天后作为固态种子。
(3)在无菌条件下，按8g/100g固态培养基加入固态种子。固态发酵培养基(1Kg)：谷物275.0g，花生油3.0g，玉米浆3.5g，MgSO47H2O 0.3g，K2HPO4 5.0g，尿素：3.0g，余量为水；pH值6.0，121℃灭菌，30分钟。降温至28℃后，混合均匀，铺在固态发酵反应器中，厚度0.5cm，湿度50％，通入0.8V/(V·min)无菌空气，温度为28℃，发酵4天。产物油脂含量在16.2％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达14.5％。谷物的选择同实施例1
(4)产物可直接提取γ-亚麻酸或于65℃干燥后粉碎作为食品添加剂使用以及制成胶囊、片剂。
Claims (2)
1、一种固态发酵生产γ-亚麻酸的方法，即采用固态发酵生物反应器发酵生产γ-亚麻酸，依次包括如下步骤：
(1)将γ-亚麻酸菌种接种在土豆斜面培养基上，温度为24-28℃，培养4-5天，加入0.1-0.2％(W/V)的吐温80溶液洗涤菌丝体，获得菌悬液，悬液中孢子含量为1-2×105个；
(2)上述菌悬液用于接种至灭菌的固态培养基上培养固态种子或再次液态扩大培养做成液态种子；液态种子培养基组成(g/L)：蔗糖10.0-30.0，玉米浆1.0-5.0，MgSO47H2O 0.1-0.5，K2HPO4 1.0-5.0，尿素1.0-5.0；pH值6.0-6.2，121℃灭菌，25分钟；经过摇瓶、种子罐常规扩大培养后作为液态种子；
(3)固态发酵培养基组成(g/L)：谷物200.0-350.0，花生油3.0-8.0，玉米浆1.0-5.0，MgSO47H2O 0.1-0.5，K2HPO4 1.0-5.0，尿素1.0-5.0，余量为水；pH值6.0-6.2，121℃灭菌，30分钟；在无菌条件下，按5-10mL/100g固态培养基加入液态种子或按5-10g/100g固态培养基加入固态种子，混合均匀铺在固态发酵的浅盘中，厚度0.5-2.5cm，湿度50-100％，通入0.2-1.5V/(V·min)无菌空气，温度为21-28℃，发酵4-7天；产物油脂含量在5-20％，脂肪酸中γ-亚麻酸的含量达5-20％；
(4)发酵后产物处理：用于提取γ-亚麻酸，干燥后粉碎作为食品添加剂使用或干燥粉碎后制成胶囊、片剂。
2、根据权利要求1所述的固态发酵生产γ-亚麻酸的方法，其特征在于所述谷物包括小米、小麦、大麦、燕麦、大米、糯米、玉米、高粱。
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