CN1289263A - 使用多糖分离物质混合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及色谱分离物质混合物的方法,其中使用化学和物理未改性的、不溶于水的、直链多糖的球状微粒。

Description

使用多糖分离物质混合物的方法
本发明涉及一种分离物质混合物，特别是对映体的方法，其中使用化学和物理未改性的、不溶于水的、直链多糖的球状微粒作为分离材料。
色谱法是一种完全分离混合物各组分，特别是分离类似化合物例如立体异构体的混合物的有效方法。由于越来越关注用于药物和生物化学的活性物质和农作物保护剂的纯对映体，所以对对映体化合物的色谱分离是特别感兴趣的。为了纯化这些化合物，一直在研究开发改进方法和寻求更好的分离材料，特别是多糖纤维素和淀粉基的分离材料，这是二种易于获得和廉价的含手性原子的聚合物。
因此，《色谱》65，(Chromatography 65)，LaborPraxis，730-738(1990)，概述了与三乙酰纤维素相比，在色谱法中使用颗粒尺寸是10至20微米的微晶三苯甲酰纤维素作为对映体分离的吸附剂。这二种物质可用于分析和制备分离。它们可以通过纤维素的衍生来获得。不使用未改性的聚合物。为了避免死体积和在操作过程中柱的致密，加入尺寸最大为5微米的相对小的颗粒被认为是所希望的。
WO95／05879同样涉及通过液相色谱法分离对映体的方法。这里特别值得注意的是用于改善分离效率的流动相。固定相是纤维素和直链淀粉的氨基甲酸酯衍生物和纤维素的酯衍生物。
DE-A-4317139描述了一种借助于制备气相色谱法分离吸入麻醉剂的对映体的特殊方法。固定相是在多孔载体材料(红色硅藻土色谱载体)上的聚硅氧烷溶液中的酯基衍生的环糊精。为了获得合适的分离材料，必须对环糊精进行化学改性，溶解在聚硅氧烷中并固定在合适的载体材料上。
US5，403，898采用含环糊精衍生物的聚硅氧烷作为分析和制备气相色谱法(GC)、色谱法(LC)中的手性固定相。这些全烷基环糊精化学键合在聚硅氧烷上。所使用的这些材料因此可以通过环糊精的化学改性和随后在硅氧烷上的化学固定而获得。
在US5，302，633中，为了实现手性固定相的不溶解性，首先将多糖(例如纤维素)的乙烯衍生物吸附在多孔载体(例如硅胶)的表面，然后进行聚合反应。第二种方案是使含乙烯基的多孔载体(例如改性的硅胶)与多糖的乙烯衍生物进行共聚反应。同样这里需要进行化学改性以便获得合适的分离材料。
EP-B-O157365描述了用于对映体和异构体分离和用于凝胶渗透色谱法的基于多糖氨基甲酸酯衍生物的固定相。合适的多糖是纤维素、直链淀粉、脱乙酰壳多糖、木聚糖、葡聚糖和菊粉。这里可以直接或者在物理或化学固定在多孔载体上之后使用制备的颗粒直径是1微米至300微米的粉末。因此也需要化学改性以获得合适的分离材料。
在DE-C2655292和DE-C2555361中，使用由葡聚糖衍生物制备的多孔凝胶作为电泳分离材料中的分离介质。为了获得不溶解性，含乙烯基的葡聚糖衍生物必须通过自由基聚合反应进行交联。
因此，已经已知许多在色谱分离方法中使用的多糖。然而，为了获得好的分离性能、颗粒尺寸分布、溶剂稳定性和耐溶剂性，总是必须对它们进行化学和／或物理改性。这点也涉及到成本的提高。
术语化学和／或物理改性特别地理解为通过引入特定基团的衍生化、在载体材料上的共价键固定和随后的化学和／或物理交联。
因此，本发明的目的是通过避免所使用的分离材料的化学和物理改性使分离方法简单化并降低成本。
本发明的目的是通过一种物质混合物的色谱分离方法实现的，在该方法中使用未进行化学和物理改性的、不溶于水的、直链多糖的球状微粒(以下称作本发明的分离材料)作为分离材料。
术语“球状微粒”应该理解为大体呈球形的微粒。在通过以共同的起点为出发点的在指向空间上等长轴线(其被定义为在所有空间方向上的球体半径)描述球形时，对于球状微粒来说轴长度的偏差可以是1至40％。优选获得偏差最高达25％，特别优选最高达15％的球状微粒。球状微粒的表面在宏观上可与覆盆子果(Himbeere)的表面相比，这里“凹陷处”或“凹处”的深度最大应是球状微粒平均直径的20％。附图1至4表示所使用的球状微粒的扫描电镜(SEM)的显微图(Camscan S-4)。
此外，回避对直链多糖进行化学和物理改性可以避免高成本的处理步骤，因此将提高色谱法的经济性。另一优点是色谱法非常好的再现性。
术语“物理改性”不能理解为常规的加工步骤，例如搅拌、离心、悬浮等。
根据本发明直链多糖可以是聚葡聚糖(polyglucane)或其它直链多糖，例如支链淀粉、果胶、甘露聚糖或聚果聚糖(Polyfructane)。然而，特别优选的是聚(1，4-α-D-葡聚糖)。
本发明的分离材料可用于物质混合物，特别优选是立体异构体，更优选是对映体的色谱分离。因此，特别感兴趣的是在制备和分析色谱法，例如气相色谱法，制备和分析薄层色谱法和特别是高效液相色谱法(HPLC)中使用本发明的分离材料。同样感兴趣地是在凝胶渗透色谱法(GPC)中使用本发明的分离材料来分离具有不同分子量的聚合物。同样属于本发明范围的应用是通过与低分子量或聚合化合物的特定或非特定的相互作用从溶液、乳液或悬浮液中分离物质。然而，同样该应用对离子型化合物，特别是金属阳离子也是感兴趣的。特别地，由于与多糖结构的类似性，在分离单糖、二糖和低聚糖中可以获得特别的效果。
同样由于本发明分离材料的生物相容性，本发明也涉及水处理，特别是废水处理，生物材料的分析，特别是血液和血清，或者例如基因材料(核苷酸)或其它生物化合物(例如寡核苷酸、肽或蛋白质)的分离或除去。
在本发明的意义上，术语“色谱法”应该理解为物理分离方法，其中物质的分离是通过在固定相和流动相之间的分配和／或吸附进行的。在本发明的范围中，本发明的分离材料，优选是聚(1，4-α-D-葡聚糖)，作为固定相使用，并与液体和／或气体的流动相结合。因此，特别的实施方案是：HPLC、GPC、GC、TLC和其它或可能的色谱法或类色谱法的分类说明。原则上，本发明可用于任何色谱法。
HPLC表示高效或高压液相色谱法。在HPLC中，使用非常细的材料(3至10微米)，因为随着固定相颗粒尺寸的降低柱的分离效率提高。分离材料的细颗粒特性需要高的压力(最高达400巴)。
在同样可以作为HPLC操作的凝胶渗透色谱法(GPC)(也被称作凝胶过滤色谱法)中，固定相由具有杂多孔溶胀网结构的其孔尺寸分布在几个数量级内变化的珠子组成，这样通过分子尺寸进行分级分离，这可以快速测定聚合物的分子尺寸分布。
气相色谱法(GC)用于分离呈气态或者可以蒸发而不分解的物质混合物，其中使用气体流动相。气相色谱法分析首先是在恒温的分离柱中施加气体、挥发性液体或挥发性固体。借助于载体气体(He、N2或H2)输送物质通过该柱，在柱中发生色谱分离。
薄层色谱法(TLC)是一种采用多步分配过程的色谱法，其中固定相(这里分离材料被称为吸附剂)以薄层的形式固定在合适的载体，例如玻璃、聚酯或铝上。在该薄层上通过洗脱液(流动相)的洗脱进行分离。
因此，本发明涉及本发明的分离材料，其本身包含未化学和物理改性的、不溶于水的、直链多糖和任选的其它助剂、添加剂和载体材料的球状微粒。
此外，本发明涉及本发明分离材料和任选的其它助剂和添加剂的应用，就其作为过滤器介质或吸附剂而言用于除去或截留物质(参见
实施例12)。
直链多糖是由单糖、二糖或其它单体单元以这种方式即单糖、二糖或其它单体单元总是以相同的方式相互连接而构成的多糖。以这种方式定义的每一个基本单元或者构件正好具有二个键，在每种情况下用于一个单体与另一个单体键合。但其中排除构成多糖的前端和末端的二个基本单元。这两个基本单元仅具有一个用于与另一个单体键合的键。在三个键(共价键)的情况下涉及支化。不出现支化或仅小范围地出现支化，这样在非常小的支化比例下常规的分析方法不能获知。
优选的不溶于水的直链多糖的实例是直链聚-D-葡聚糖，这里键的类型是不重要的，只要存在本发明意义中的线性。实例是聚(1，4-α-D-葡聚糖)和聚(1，3-β-D-葡聚糖)，这里聚(1，4-α-D-葡聚糖)是特别优选的。
如果基本单元具有三个或更多的键，那么采用术语“支化”。所谓的支化度是指每100个基本单元中未参与直链聚合物骨架的构成而形成支链的羟基的数目。
根据本发明，直链不溶于水的多糖的支化度低于8％，也就是说，每100个基本单元中它们的支链低于8。支化度优选低于4％，特别是至多1．5％。
如果不溶于水的直链多糖是聚葡聚糖，例如聚(1，4-α-D-葡聚糖)，那么在6位上的支化度低于4％，优选最大2％，特别优选最大0．5％，在不参与直链键合的其它位置上的支化度，例如在优选的聚(1，4-α-D-葡聚糖)中的2或3位的支化度优选在每种情况下最大是2％，特别地最大是1％。
特别优选的是未支化的或者其支化度太低以致于不能用常规方法确定的多糖，特别是聚-α-D-葡聚糖。
根据本发明，标记“α”、“β”或“D”仅指形成聚合物骨架的键，而不是支链的。
术语“性质相同的多糖”被理解为不是天然以这种形式出现的或者仅在与其它化合物(也可以是聚合物)的混合物中存在的的聚合物。这种性质相同的聚合物可以通过属于生物技术和基因工程方法(以其最广义的意义定义的)范畴的方法来制备。因此，这首先被理解为如下文所定义生物技术方法，但也指那些通过使用和改变例如细菌、真菌或藻类获得相应化合物的方法。另一方面，该术语例如也涵盖通过将生物技术或基因工程方法用于高级植物以从该植物进行分离而获得的多糖。这些植物特别地包括马铃著、玉米、谷类、木薯、稻类和豌豆。然而，本发明在这一方面也包括其它生产多糖的植物。
在本发明的范围中，优选在生物技术，特别是生物催化／生物转化或发酵方法制备的直链、不溶于水的多糖。术语“生物技术方法”覆盖所有的生物催化方法(=生物转化方法，即仅通过酶或与形成胞内或胞外蛋白质(承担该任务)的生物体相结合可以进行的方法)或者采用天然形成的或重组生物体进行的发酵方法。
在本发明的范围中，通过生物催化(即生物转化)制备的直链多糖是指使用所谓的生物催化剂，通常是酶，在适合于该反应的条件下，通过单体基本单元例如寡聚糖如单糖和／或二糖的催化反应制备的直链多糖。
在本发明的术语中，来自发酵的直链多糖是指通过使用天然形成的生物体例如真菌、藻类或细菌或者使用非天然形成的生物体，例如借助于常规定义的基因工程方法改性的天然生物体例如真菌、藻类或细菌的发酵方法制备的直链多糖。
此外，为了获得本发明中描述的效果，也可以通过使用一种或多种酶以这样的方式处理含支链的非直链多糖来获得直链多糖，即从多糖的骨架上裂解掉支链，在将支链除去之后获得直链多糖。这些酶例如是淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶或葡萄酸水解酶。
在本发明中，术语“不溶于水的多糖”是指根据德国药典(DeutschenArzneimittelbuch)(DAB=德国药典，WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft mbH，Stuttgart，Govi-Verlag，Frankfurt，Edition，1987)对应于第4至7组，属于分类“微溶解”、“难溶解”、“非常难溶解”或“实际上不溶解”化合物中的化合物。
在使用的本发明的多糖的情况下这则意味着使用量的至少98％，特别是至少99．5％在标准条件(T=25℃+／-20％，P=101325帕+／-20％)下不溶于水(对应于4或5组)。
对于本发明，优选难溶解至实际上不溶解的化合物，特别是非常难溶解至实际上不溶解的化合物。
对应于组6的“非常难溶解”可以通过下面的示例性描述来说明：在1巴的压力下，在1升去离子水中将待试验的1克聚葡聚糖／多糖加热至130℃，获得的溶液仅短暂地保持几分钟的稳定。在标准条件下冷却时，该物质再次沉淀出。在冷却至室温并借助于离心法分离之后，在考虑试验损失的情况下，可以至少回收使用量的66％。
均匀球状微粒的制备
优选使用的聚(1，4-α-D-葡聚糖)可以各种不同的方法制备。一种非常有利的方法描述在WO95／31553中。其说明书公开的内容特意在此引入以供参考。在该方法中，在淀粉蔗糖酶的帮助下，借助于生物催化(生物转化)方法来制备聚(1，4-α-D-葡聚糖)。聚(1，4-α-D-葡聚糖)也可以通过生物催化方法，使用多糖合成酶、淀粉合成酶、二醇转移酶、1，4-α-D-葡聚糖转移酶、糖原合成酶或磷酸化酶来制备。
专利申请DE-A-19737481描述了直链、不溶于水的多糖的球状微粒的制备和它们的分子量和直径。上述申请在此引入以供参考。
球状微粒可以如下制备：将不溶于水的直链多糖，特别是聚(1，4-α-D-葡聚糖)溶解在溶剂中，特别优选溶解在DMSO中，将该溶液加入沉淀剂中，优选水中，冷却获得的混合物优选至10至-10℃，并分离出形成的微粒。伴随使用合适的添加剂可以改善颗粒的性能，例如尺寸、表面结构、孔隙率等，并且改进该方法的进行。合适的添加剂的实例是表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠或N-甲基葡聚糖酰胺(N-Methylglucanoamid)，和糖类，例如果糖、蔗糖和葡萄糖。
球状微粒的性能
本发明中使用的直链多糖的分子量Mw可以在103克／摩尔至107克／摩尔的宽的范围内变化。对于优选的直链多糖聚(1，4-α-D-葡聚糖)来说，其分子量Mw优选是104克／摩尔至105克／摩尔，特别是2×104克／摩尔至5×104克／摩尔。分子量Mw表示重均分子量，是与使用直链淀粉标准的校正值相比通过凝胶渗透色谱法测定的。
颗粒的平均直径(数均)是1纳米至100微米，优选是100纳米至10微米，特别优选是1微米至5微米。直径分布因高的均匀性而出色。
聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒因比表面积是1平方米2／克至100平方米2／克，特别优选是3平方米2／克至10平方米2／克而出色。
微粒在各种不同溶剂中的稳定性试验表明，大量不同的溶剂均适合于在本发明的色谱法中使用。所使用的充当洗脱液的溶剂例如是正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、1，4-二噁烷、乙醇、丙酮、乙腈、甲醇、正庚烷和水。
色谱法
在色谱法中，本发明的由直链多糖，特别是聚(1，4-α-D-葡聚糖)制成的微粒尤其悬浮在溶剂，例如正庚烷中，借助于Ultraturrax充分搅拌，在超声浴中脱气。将该悬浮液加入柱中，并通过反复轻拍、反复振动和在超声浴中短时处理以便均匀和密实地填充以获得具有低比例死体积的填充。分离在现有技术中相应地用于HPLC的色谱装置中进行。试样浓度是2．0至0．025毫克／升溶剂，特别优选是0．25至0．05毫克／升溶剂。洗脱速度是2．0至0．25毫升／分钟，优选1．0至0．4毫升／分钟，特别优选是0．5毫升／分钟。这些数据可以根据使用的溶剂改变。使用的压力主要取决于溶剂的极性。它们通常是30巴至200巴。例如测试的压力是：乙腈是138至159巴，乙酸乙酯是约100巴，叔丁基甲基醚是约62巴和正庚烷是54-70巴。例如可以使用内标，例如1，3，5-三叔丁基苯。
附图的描述：
附图1：使用的球状微粒的扫描电子显微照片(参见实施例4)，放大倍数5000x。
附图2：使用的球状微粒的扫描电子显微照片(参见实施例4)，放大倍数10000x。
附图3：使用的球状微粒的扫描电子显微照片(参见实施例4)，放大倍数15000x。
附图4：使用的球状微粒的扫描电子显微照片(参见实施例4)，放大倍数20000x。
附图5：实施例12中描述的琼脂糖凝胶(在256纳米下使用0．5pg／ml溴化乙锭检测)，注意标题。
附图6：实施例12中描述的琼脂糖凝胶(在256纳米下使用0．5pg／ml溴化乙锭检测)，注意标题。
下面的实施例进一步详细说明本发明，而不是将本发明限于这些
实施例。
实施例
实施例1
采用淀粉蔗糖酶以生物催化方法体外制备直链不溶于水的多糖，例如聚(1，4-α-D-葡聚糖)
将10升20％的蔗糖溶液加入15升的无菌容器中。一次加入包含淀粉蔗糖酶的酶提取物。在该试验中酶的活性是20单位(1单位=1μmol蔗糖×min-1×mg酶)。该装置配有同样是无菌的KPG搅拌器。将该容器密闭，储存在37℃下并搅拌。在仅几个小时之后，形成白色沉淀。在96小时之后，反应结束。过滤出沉淀物，反复用水洗涤以便除去低分子量的糖。借助于膜式泵(Firma Vacuubrand GmbH＆Co．，CVC2)，在干燥橱中，在40℃下，在施加真空的条件下干燥过滤器中遗留的残渣。重量是651克(产率65％)。
实施例2
测定实施例1中由淀粉蔗糖酶合成的不溶于水的聚(1，4-α-D-葡聚糖)的分子量
在室温下，将来自实施例1的2毫克聚(1，4-α-D-葡聚糖)溶解在二甲基亚砜(DMSO，Riedel-de-Haen)并过滤(2微米过滤器)。将部分该溶液注射到凝胶渗透色谱柱中。所使用的洗脱液是DMSO。借助于RI检测器测定信号强度，并与直链淀粉标准(Firma PolymerStandard Systems)相比较进行评价。流动速度是1．0毫升／分钟。测量的结果是数均分子量(Mn)是7000克／摩尔，重均分子量(Mw)是34000克／摩尔。
实施例3
制备聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒
a)在60℃下，在1．5小时内，将400克聚(1，4—α-D-葡聚糖)
溶解在2升二甲基亚砜(DMSO，Riedel-de-Haen)中。然后将
该混合物在室温下搅拌1小时。在搅拌下，在2小时内，经滴液
漏斗将该溶液加入20升二次蒸馏水中。将该批料在4℃下储存44
小时。形成细悬浮液。首先通过滗析上清液分离出颗粒物。将沉
积物制浆，并一小部分一小部分地进行离心分离(RC5C超速离
心机，每次在5000转／分钟下旋转5分钟)。使用二次蒸馏水悬
浮固体残渣，并再次离心分离，将该过程再重复二次。收集固体，
将约1000毫升悬浮液冷冻干燥(Christ Delta 1-24KD)。分
离出283克白色固体(产率71％)。
b)将收集的上清液在18℃下储存过夜。如上所述进行加工。进
一步分离出55克白色固体(产率14％)。
实施例4
借助于电子显微镜观测实施例3获得的微粒
为了表征颗粒，拍出扫描电子显微镜(SEM)照片(Camscan S-4)。附图1至4表示颗粒的显微照片，该照片显示出它们是球状的，并且在形状、尺寸和表面粗糙度方面是非常均匀的。
实施例5
研究实施例3的颗粒的尺寸分布
为了表示实施例3的颗粒的尺寸分布特征，使用标准筛(MalvernInstruments)进行试验。该试验在假定密度是1．080克／立方厘米和体积浓度是0．012至0．014％下以Fraunhofer方式(评价：多方式，数目)进行。
表1：
实施例3的颗粒直径特性
实施例    直径    颗粒分布
1
No．  dn-2     Dw-2     dw／dn-3  d(10％)-4D(50％)-5d(90％)-6
(μm)    (μm)       (μm)         (μm)         (μm)
3a       1，664     4，184      2，541       0，873    1，504    2，624
3b       0，945     2，345      2，481       0，587    0，871    1，399*1dn：数均直径*2dw：重均直径*3dw／dn：颗粒直径分散度*4d(10％)：所有颗粒的10％的直径小于标示的值*5d(50％)：所有颗粒的50％的直径小于标示的值*6d(90％)：所有颗粒的90％的直径小于标示的值
实施例6
测定聚(1，4-α-D-葡聚糖)(对比实施例)的比表面积和聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒和马铃薯淀粉(对比实施例)的比表面积
使用Sorptomatic 1990(Fa．Fisons Instruments)测量比表面积。使用“Default method sorptomatic”方法进行评价。对于该试验，在减压下将试样在80℃下干燥过夜(来自Firma Vacuubrand GmbH＆Co．，CVC2的膜式泵)。事先对马铃薯淀粉和直接由生物转化法获得的聚(1，4-α-D-葡聚糖)进行研磨，以使颗粒的尺寸小于200微米。为此使用商业上可获得的磨(Waring)。
表2
聚(1，4-α-D-葡聚糖)(参见实施例3)的比表面积特性实施例序号  物质                            比表面积(平方米／克)1          聚(1，4-α-D-葡聚糖)                    2．2433          聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒            4．527-          马铃薯淀粉(Toffena，Fa．Suedstaerke)  1．280
实施例7
试验微粒在各种不同溶剂中的稳定性以确定合适的溶剂
为了试验各种不同溶剂在采用聚(1，4-α-D-葡聚糖)的色谱应用中的适用性，使用如下步骤：在凸缘玻璃瓶中在每种情况下在100毫克的实施例3的颗粒上加入一层3毫升溶剂。观察时间是24小时。以小时为间隔观察颗粒的变化。为此反应容器是摇动的。
结果表明，对于这里描述的色谱应用可以使用非常广的溶剂。只是甲苯、乙酸乙酯和二甲基亚砜例外。在未示出的个别情况下，必须首先试验溶剂的可应用性。试验的结果见表3。这里给出介电常数和偶极矩和／或Snyder极性指数以表示溶剂的极性。
表3：
聚(1，4-α-D-葡聚糖)微粒(见实施例3)在各种不同溶剂中的稳定性结果溶剂      介电常数    偶极矩   极性     观察结果(ε)*1       D*2      指数*3  (24小时后)正己烷      1，8865         -              0，0        无变化正庚烷      1，9209         -              0，0        无变化甲苯        2，379          0，375         2，3        透明，微溶胀的材料，浑浊的上清液乙酸乙酯     6，0814       1，78             -             颗粒粘附，浑浊的上清液二氯甲烷     8，93         1，60           3，4         无变化四氢吡喃     7，2          1，75           4，2         无变化1，4-二噁烷  2，2189         -             4，8         无变化乙醇         25，3         1，69           5，2         无变化丙酮         21，01        2，88           5，4         无变化乙腈         36，64        3，924          6，2         无变化甲醇         33，0         1，7            6，6         无变化二甲基甲酰胺 38，25        3，82             -          无变化二甲亚砜     47，24        3，96             -          溶解水           80，100       1，854          9，0         无变化*1根据《化学和物理手册》(Handbook of Chemistry and Physics)第77版的介电常数*2根据《化学和物理手册》(Handbook of Chemistry and Physics)第77版的偶极矩*3来自Merck，ChromBook的Snyder极性指数
实施例8
使用实施例3a的微粒填充色谱柱
将5克实施例3a的颗粒悬浮在约60毫升庚烷中。借助于Ultraturrax(Fa．Ika)进行短暂的搅拌，并随后在超声浴(SonorexSuper RK510H)中脱气。然后在最大流速下将该悬浮液加入长度是125毫米和直径是4毫米的柱(HibarFertigsaeule der Firma Merck AG)中。反复轻拍该色谱柱，或者反复摇动和在超声浴中短时地处理约1分钟以确保密实和均匀地填充分离材料，以便获得的填充具有低比例的死体积。
实施例9
庚烷中吲哚和2-甲基吲哚的分离
分离在Firma Merck的色谱装置Lichograph中进行。各个部件是：梯度泵L6200A、UV检测器L-400(在254纳米下测定)、色谱-积分仪D-2500和分离柱HibarFertigsaeule RT-125-4。试样浓度理想地是0．05至0．1毫克／毫升溶剂。可以使用1，3，5-三叔丁基苯(Fa．Fluka)作为内标。
使用正庚烷(Aldrich用于HPLC)准备好色谱柱。该装置通过正庚烷运行。洗脱速度是0．5毫升／分钟。压力是54巴。待分离的物质是吲哚和2-甲基吲哚。
表4
在正庚烷中分离吲哚和2-甲基吲哚的结果物质                        反应时间(分钟)1，3，5-三叔丁基苯(标准)      1．86吲哚                          9．12吲哚／2-甲基吲哚              8．98／7．372-甲基吲哚                    7．20
实施例10
在庚烷中分离吲哚和2-萘酚
如实施例10所述，进行该试验。
表5：
在庚烷中分离2-萘酚和吲哚的结果物质            保留时间(分钟)2-萘酚          2．242-萘酚／吲哚    1．92／9．16吲哚            9．12
实施例11
分离对映体混合物：外消旋1-(2-萘基)乙醇。
类似于实施例10进行该试验。在该实施例中，压力约是70巴。试样的浓度是0．25毫克／毫升溶剂。
表6
在庚烷中分离外消旋1-(2-萘基)乙醇的结果物质                     保留时间(分钟)1，3，5-三叔丁基苯(标准)    1．89S-(-)-1-(2-萘基)乙醇        32．031，3，5-三叔丁基苯(标准)    1．87R-(+)-1-(2-萘基)乙醇        36．30
实施例12
使用本发明的分离材料作为过滤器介质分离或保留物质
在使用580毫克实施例3制备的微粒作为过滤材料或吸收剂的条件下，使用3毫升的缓冲溶液1(参见下面)平衡一次性离心过滤器(Firma Schleicher&Schuell，例Centrix，目录号467012(1996年4月)：附图5和6中的“过滤器1”)。(如果需要离心分离(2000rpm))。随后，向过滤器中加入2毫升浓度是50μg／ml的DNA质粒水溶液(所使用的质粒：pBluescript II SK)(如果需要进行离心分离(在2000U／min下5分钟))。进行采用(附图5和6中“过滤器2”)QiagenMidipraep(Hilden，Deitschland)的对照过程和另一个采用QiagenMidipraep柱体而无Qiagen过滤器介质(填充有分离材料)的对照过程。
在每种情况下，赋予5μl洗脱液浓度约1／10的着色试剂(标记)，并且涂覆在琼脂糖凝胶板上(60％蔗糖、20mMEDTA、0．025％溴酚蓝)，随后进行凝胶电泳(Firma Biorad，Power Supply，100／200型)。作为对照以用于被检测的质粒的评价和分类，在泳道1中涂覆标记(MG5000)和涂覆所使用的DNA质粒溶液作为对照。附图5表示通过本发明的分离材料试样DNA被保留。
随后在柱(过滤器)中加入5毫升第2缓冲溶液以便进行洗脱，并且通过离心法(在2000rpm下5分钟)快速处理。
将洗脱液(如上所述的对照)涂覆在琼脂糖凝胶板上(60％蔗糖、20mMEDTA、0．025％溴酚蓝)，随后进行凝胶电泳(Firma Biorad，PowerSupply，100／200型)(参见附图6)。作为对照涂覆标记(MG5000)(泳道1)和涂覆DNA质粒溶液(泳道7)。
附图6表示，在使用本发明的分离材料时，再次将所使用的质粒DNA从柱中洗脱出。与商业上可获得的过滤材料对比表明至少具有相同质量的过滤性能。
缓冲液的描述：缓冲液1：    750mMNaCl50mMMOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸，pKa7．2)15％异丙醇0．15％TritonX-100缓冲液2：    1．25MNaCl50mM Tris，Tris*Clm，Ph8．515％异丙醇
附图5：
从左向右
泳道1：标记(Boehringer Mannheim DNA Molecular Weight MarkerX)
泳道2：无分离材料的过滤器2(空白对照)
泳道3：填充本发明分离材料的过滤器2
泳道4：过滤器1：具有本发明分离材料的柱Qiagen
泳道5：过滤器1：QiagenMidipraep(Hilden，Deutschland)对照
泳道6：采用分离材料的过滤器2
泳道7：纯的DNA-质粒溶液(商业上通用的质粒pBluescriptⅡSK)。
附图6：
从左向右
泳道1：标记(Boehringer Mannheim DNA Molecular Weight MarkerX)
泳道2：无分离材料的过滤器2(空白对照)
泳道3：填充本发明分离材料的过滤器2
泳道4：过滤器1：具有本发明分离材料的柱Qiagen
泳道5：过滤器1：QiagenMidipraep(Hilden，Deutschland)对照
泳道6：采用分离材料的过滤器2
泳道7：纯的DNA-质粒溶液(商业上通用的质粒pBluescript ⅡSK)。

Claims (18)

1．一种物质混合物的色谱分离方法，其中使用未进行化学和物理改性的、不溶于水的、直链多糖的球状微粒。
2．权利要求1的方法，其特征在于，通过柱色谱法进行分离。
3．权利要求2的方法，其特征在于，借助于HPLC(高效或高压液相色谱法)进行分离。
4．权利要求1的方法，其特征在于，通过薄层色谱法进行分离。
5．权利要求1的方法，其特征在于，借助于凝胶渗透色谱法进行分离。
6．权利要求1至5之一的方法，其特征在于，所述的物质混合物是立体异构体。
7．权利要求6的方法，其特征在于，所述的物质混合物是对映体。
8．权利要求1至7之一的方法，其特征在于，微粒的直径是10纳米至100微米。
9．权利要求8的方法，其特征在于，微粒的直径是1微米至5微米。
10．权利要求1至7之一的方法，其特征在于，使用聚(1，4-α-D-葡聚糖)作为多糖。
11．权利要求1至7之一的方法，其特征在于，使用通过生物技术方法获得的多糖。
12．直链、不溶于水的多糖的球状微粒的应用，其用于色谱分离物质混合物。
13．直链、不溶于水的多糖的球状微粒的应用，其用作吸收剂和过滤器介质。
14．一种分离材料，其包括化学和物理未改性的、不溶于水的直链多糖和任选的助剂、添加剂和／或载体的球状微粒。
15．权利要求14的分离材料，其特征在于，微粒的比表面积是3平方米／克至10平方米／克。
16．包括化学和物理未改性的、不溶于水的直链多糖和任选的助剂、添加剂和／或载体的球状微粒的过滤材料和／或吸收剂。
17．权利要求1至16之一的分离材料的应用，其用于从液体中除去和如果需要纯化和分离生物材料。
18．权利要求17的应用，其中生物材料是核苷酸。
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