CN1286527C - 抗过敏特异性IgY及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗过敏特异性IgY及其制备方法，本发明制备方法包括下列步骤：筛选出引致过敏性疾病的过敏原，在筛选和分类组合各种过敏原的基础上，分别制备单一或复合的过敏原抗原，制备免疫球蛋白IgE抗原，制备免疫蛋，制备抗各种过敏原特异性IgY粗提物，抗各种过敏原特异性IgY粗提物和抗IgE特异性IgY粗提物的纯化，制备抗某一种特定过敏原的特异性复合IgY。本发明特异性IgY制剂用于哮喘等过敏性疾病的预防和治疗具有特效、安全、使用方便的特点。

Description

抗过敏特异性IgY及其制剂
技术领域
本发明涉及一种抗体及其制备方法，特别是涉及一种抗各种过敏性疾病的复合IgY及其制备方法。
背景技术
过敏症是一种最为常见的多发病，对人类健康构成极大危害。全世界不知有多少人终生饱尝这种疾病的折磨，甚至造成残废或猝死。在印度，“过敏症”发病率占人口总数高达11-12％；在美国仅花粉过敏症的人群发病率就高达15％，每年要耗资6亿美元治疗这种疾病；而在中国，据不完全统计，各种过敏性疾病的患者有上亿人之多。有报道显示，全世界每年仅用于治疗支气管哮喘的医疗费用就超过30亿美元，由于这类疾病而导致的误工、误学及早亡所造成的损失更是无法计算。
过敏性疾病，是一种由外界抗原物质作用于体内发生的不正常的免疫反应。临床表现如支气管哮喘和支气管炎、过敏性鼻炎、过敏性喉水肿(喉炎)、过敏性皮肤炎等，症状顽固，治疗起来相当困难。通常采用激素类和拟肾上腺素等化学药物治疗。令人遗憾的是，目前广泛应用的治疗方案及其药物都仅仅是局部抗炎或短暂纾缓症状的、不完善的治标手段，而不是“病因治疗”。更重要的是，所带来的副作用都相当大。如应用皮质激素会引致中枢神经系统和肌肉骨骼以及内分泌方面的不良反应，并可诱发口咽部和食道真菌感染，以及疱疹病毒感染；尤其对小儿危害更大，使小儿生长受抑、影响小儿骨骼和性腺等方面的发育。采用拟肾上腺素能药和β2-受体激动剂，还会引起高血压、心律失常等心血管疾病及出现骨骼肌震颤(如手抖)，甚至造成患者肾上腺皮质功能不全或衰竭；严重时会引起心脏停搏而死亡。国际医学界根据长期观察和统计分析揭示，过度使用β2-受体激动剂等是前几年哮喘死亡率不断增加的祸根。
鉴于局部抗炎和平喘等治疗方法存在的严重缺陷，针对过敏性疾病是由于某种“过敏原”导致人体发生“特异反应”(变态反应)而引起的机理，于某种“过敏原”导致人体发生“特异反应”(变态反应)而引起的机理，医学界研究开发了一种特异性免疫方法(“脱敏疗法”)，通过反复注射特异性过敏原刺激机体产生“封闭抗体”，和再次进入机体的“过敏原”结合为复合物而被网状内皮系统清除。
这种方法被称为“过敏症”的“最新疗法”，但是在实施中却存在着许多困难和危险性。不但起效慢、疗程长(长达2-5年)而难于坚持；而且，注射后容易出现乏力、关节痛、荨麻疹等不良反应，还会诱发支气管痉挛和过敏性休克等严重不良反应，甚至造成死亡。因此，严重影响了这种本来是先进的“最新疗法”的推广应用。
目前的现状是，虽然近几十年来全世界有关过敏性疾病的治疗药物和设备不断问世，但是，过敏性疾病的发病率，不仅未能下降，甚至还出现哮喘的患病率和死亡率反而逐年增加的反常现象。残酷的现实表明，至今全世界尚未找到一种根治过敏性疾病特别是哮喘的安全可靠的方法。因此，研究开发一种从病发根源上入手、副作用又小的有效治疗方法和药物，对于使千百万患者彻底摆脱过敏性疾病的煎熬、保障人民身心健康、提高广大国民健康素质，无疑具有十分重要的意义。
技术内容
本发明的目的在于提供一种对哮喘等过敏性疾病特效、安全、使用方便的抗体制剂及其制备方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
1、筛选出引致过敏性疾病的过敏原
A、花粉症过敏原：蒿属花粉、豚草花粉、狗尾草、梯牧草、黑麦、树木花粉如法国梧桐、枫、杨、榆、柏、构、桑、柳、松、悬铃木、桦、银杏等。
同时也可依据对多数过敏症患者的“特异性皮肤试验”结果的统计分析，来筛选决定本地区主要的致敏花粉种类。再根据这些致敏花粉的“抗原交叉性”，进行分类组合，确定有代表性的几种花粉过敏原。
也可根据各地最常见的有代表性的致敏花粉所鉴定出的过敏原蛋白质或抗原成份，如豚草、艾草为Hrt VI(学名)、鸭茅为Arab aI(学名)、垂枝桦木为Dac gI(学名)、扁柏为Bet VI(学名)、杉木为Cry IC(学名)等等有代表性的、最常见的过敏原蛋白质或抗原成份作为这部分致敏花粉的代表性过敏原。
还可以根据筛选出的致敏花粉种类，选用已商品化的若干种致敏花粉浸出液或萃取剂作为有代表性的花粉过敏原。
B、尘螨过敏原
与过敏性疾病关系最密切的螨有4种，即屋尘螨、粉尘螨、宇尘螨和多毛螨。这4种螨之间具有共同抗原成份。其中屋尘螨是导致尘螨过敏性疾病的最重要的过敏原。屋尘螨有I、II、III、Ⅳ、V等五种抗原决定簇。
可根据本地大多数过敏症患者“特异性皮肤试验”的统计结果，从目前最常用的、已商品化的各种尘螨过敏原的“抗原交叉性”，进行分类组合。市面上的“粉尘螨注射液”也可直接选用。
C、霉菌过敏原
将空气中最常见、孢子播散数量最大和致敏性最强的真菌进行分离和筛选，保留纯菌种，进行实验室培养，可制成各种真菌过敏原浸出液。然后，根据这些有代表性的致敏真菌的“抗原交叉性”进行分类组合。
D、蟑螂过敏原
采用已商品化的蟑螂抗原成份或蟑螂浸出液(如“黑胸大蠊”萃取液)，也可用当地蟑螂自制浸出液，或将蟑螂剪去翅膀后，放入高速匀浆机搅成浆汁，作为制备抗原的基础原材料。
E、宠物过敏原
可采用宠物的皮脂腺分泌物、唾液或尿蛋白的萃取液制作过敏原。
也可选用这些宠物有代表性过敏原蛋白质直接作抗原的原材料。如猫的主要过敏原蛋白质为Fel dI，狗唾液的过敏原蛋白质为Ca dI。
2、在筛选和分类组合各种过敏原的基础上，分别制备单一或复合的过敏原抗原。
将各组别单一或混合的过敏原提取液或制剂，按1-10∶1-10比例加入福氏佐剂，再放入高速匀浆机中，高速搅拌形成油包水乳液，即制成单一或复合过敏原抗原；
也可以直接将花粉、尘螨、霉菌、蟑螂碎片、宠物皮毛屑等加入福氏佐剂混合后放入高速匀浆机中，以10000～30000rpm转速进行高速粉碎匀化，形成油包水液；制得含全菌和菌体成份或含全部致敏蛋白质成份的复合抗原；
3、制备免疫球蛋白IgE抗原
可以从人体特别是过敏症患者的血清中提取IgE，也可购买现成的IgE免疫球蛋白作为抗原原料。
将IgE免疫球蛋白按1-10∶1-10比例配以福氏佐剂，放入高速匀浆机中，高速粉碎匀化，即制成IgE抗原；
4、制备免疫蛋：应用本公司已申请的专利技术(专利申请号：00101270.3和02121244.9)，用各种单一或复合过敏原抗原以及IgE抗原，分别对产蛋鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取鸡所产免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；
以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；
也可应用上述同样的免疫技术，用各种单一或复合过敏原抗原以及IgE抗原，分别对产蛋鸭进行免疫；
5、抗各种过敏原特异性IgY特异性IgY粗提物的制备：
流动水逐个洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水稀释，搅拌均匀，用1.0N的Hcl调整PH至5.5-6.0，2-6℃静置12-24小时，虹吸得取上清液，称A液；将以上沉淀液以8000rpm离心20分种，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得到超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌直至浑浊沉淀，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rpm离心30分种，取上清液，进而通过细菌过滤器除菌，得到无菌滤液，冷冻干燥，即为IgY粗提物，最后把所制备的抗各种不同抗原的IgY粗提物进行编码标记。
6、抗各种过敏原特异性IgY粗提物和抗IgE特异性IgY粗提物的纯化：将以上工艺所制取的抗各种过敏原特异性IgY和抗IgE特异性IgY粗提物分别先后过离子交换柱和凝胶层析柱，即得纯IgY；
7、制备抗某一种特定过敏原的特异性复合IgY：
不同抗原制得的纯IgY，同样按照以上述各自不同的编码标记严格标记以便区分，将一种抗过敏特异性IgY或多种抗过敏特异性IgY混合物与抗IgE特异性IgY按1-10∶1-10的比例混合均匀，然后加入一定比例蒸馏水或生理盐水配制成溶剂；
也可将抗IgE特异性IgY干粉和抗某一种过敏原的特异性IgY或多种抗过敏特异性IgY混合物干粉按1-10∶1-10比例混合直接制成粉剂；
上述多种抗过敏特异性IgY混合物是选用多种抗相应的不同过敏原的特异性IgY，先将它们按1-10∶1-10(2种)或1-10∶1-10∶1-10(3种)或1-10∶1-10∶1-10∶1-10(4种)或依此类推的比例均匀混合制成；
本发明制备的一系列抗过敏原特异性复合IgY溶剂或粉剂直接加入各种雾化器(Nebulizers)中，经雾化器雾化形成雾状微粒，供患者吸入气管、肺部或者鼻咽部就可产生有效的治疗和预防作用。这种雾化器可以是喷射式气动雾化器(有电动泵式、压缩气泵式、脚踏气泵或压缩氧气等形式)或者超声波雾化器，也可以是其他任何形式的雾化装置。
本发明制备的一系列抗过敏原特异性复合IgY干粉也可直接装入多种干粉吸入器(Dry Powder inhalers)内供患者使用。干粉吸入器有单剂量和多剂量两种，单剂量型干粉吸入器又分成旋转式吸入器(Spinhaler)和转动式吸入器(Rotahaler)两种，多剂量型干粉吸入器又分碟式吸入器(DisKhaler)和涡流式吸入器(Turbuhaler)两种。患者只要操作这种干粉吸入器就可很方便地将抗过敏原复合IgY组合制剂吸入气管、肺部或者吸入鼻咽部。
同样，也可将所制取的一系列抗过敏原复合IgY溶剂或者粉剂加水(蒸馏水或生理盐水等)稀释后加入各种喷雾罐中制成各种喷雾剂。为使喷雾药物微粒足够细小，灌装时必须加入助推剂，常用的助推剂为氟里昂(Chlorofluorocarbon，CFC)或者氮气(N2)等。把本发明制备的抗过敏原复合IgY以一定压力保存于喷雾罐中，制成一种轻便的压力式定量吸入产品。当手压驱动定量活瓣时，就可喷出充分雾化的IgY溶液。患者只要含住这种喷雾罐的出口，配合掀压喷头吸气，或者借助“储雾罐”吸气，就可以将这种抗过敏原复合IgY吸入气管或肺部。
对于过敏性鼻炎和咽喉炎患者，喷雾剂在灌装时可加“助推剂”，也可不加“助推剂”，只需将所制得的抗过敏原复合IgY加水稀释在常压条件下灌入罐内，装上普通定量喷头就可制成喷雾剂。使用时，只要将这种常压定量喷雾罐出口对准鼻子往鼻子内喷入雾状液体即可。
本发明在大部分特异性IgY中都复合了抗IgE特异IgY样，既使对某个过敏原直接抑制作用不强，成份中的抗IgE特异性IgY亦可与肥大细胞表面的IgE结合，因而使过敏原无法与IgE用，照样避免了肥大细胞的激活和炎症介质的释放，防止支气管哮喘的发作；故而可确保万无一失。这也是本发明的精髓所在。为了降低成本，在一些专供轻度患者使用或预防使用的品种中可不加入“抗IgE特异性IgY”。在实际应用中，可以预先在前述的对各种常见过敏原进行筛选和分类胆合的基础上，科学制订生产品种和数量，每个序列都制备一组抗不同过敏原的特异性IgY。各组合的抗过敏IgY产品分别赋予不同的商品名(可用中文和英文字母以及代码表示)，并按不同序列和组别给予编码，可以很方便地识别和检索，如“抗粉尘螨IgY”(anti-Der i-igY)、“抗莠草花粉IgY″(allti-AgE-IgY)，“抗真菌tgYI号”(anti-AT-IgY)、“抗真菌IgY II号”(anti-AF-IgY)等等。再将这些不同组合的抗过敏IgY如前所述制成各种不同的剂型和标准化包装，形成系列化和标准化，便于根据需要随意选用。
系列化和标准化后，医生和患者只需根据“皮试”结果，就可以简单地直接选择一样或几样“抗过敏IgY”现成产品作治疗或预防之用。如某个患者，通过“皮肤点刺试验”确定是对“粉尘螨”和“豚草花粉”过敏，则只需在标准化的“抗过敏IgY”的产品系列中选用“抗尘螨IgY”(如：抗螨I号anti-Der I-IgY)和“抗莠草IgY”(抗花I号或anti-AgE-IgY)二种喷雾剂或者选用一种“抗(螨+花)IgY”[anti-(D+A)-IgY]复合型的喷雾剂就解决问题了。
本发明在深入研究哮喘等过敏疾病的免疫学发生机制的基础上，准确地抓住外因致敏原和内因特异性IgE两大最关键的影响因素，并且创造性地应用被动免疫技术，制备一系列抗过敏原特异性IgY和一种抗IgE特异性IgY。一方面清除和抑制了进入气道的致敏原，另一方面又直接抑制并减少了特异性IgE水平有效地阻止了过敏症状的发生。同时，本发明所制备的抗过敏原特异性复合IgY和抗IgE特异性IgY是一种独特的纯天然生物制剂，将这种天然成份直接喷施于呼吸道，而不是注射或口服进入人体循环系统，作用直接，安全无害，见效又快。由于这是一种相当于食品的天然物质，甘甜可口，即使长期经常喷雾吸入体内，也不产生任何毒副作用和不良反应。哮喘等过敏症患者以及有过敏体质的人只要随身带一支用本发明的成份制作的轻巧喷雾剂，经常喷一喷，就既可有效抑制症状发作，又可完全预防新的过敏现象的出现，达到既治疗又预防的双重目的。
实验例1：分别用粉尘螨和屋尘螨加入福氏佐剂混匀制作粉尘螨抗原和屋尘螨抗原。以ELISA法(酶联免疫吸附实验)检测所制得的抗粉尘螨特异性IgY对这两种抗原的结合效价。结果如下：
  IgY   检测用抗原   抗体效价
  纯鸡抗粉尘螨IgY   粉尘螨抗原   1∶256
  纯鸡抗粉尘螨IgY   屋尘螨抗原   1∶128
从检测结果可以看出，用本发明的方法所制备的抗粉尘螨特异性IgY对粉尘螨过敏原有较高的抗体结合效价。同时，本发明的抗原制作方法和强化免疫方式，所制得的抗粉尘螨IgY具有一定的广谱性，除了对所免疫的粉尘螨有较高的效价外，对同属的有“抗原交叉”的其他尘螨(如“屋尘螨”)同样有较高的效价。
试验结果提示我们：只要用一种有代表性的尘螨(如“粉尘螨”)制作抗原免疫母鸡，所制备的抗粉尘螨特异性IgY对常见的几种尘螨都有抗原交叉反应。这样，就可以精简抗尘螨特异性IgY的品种，降低成本。
实验例2：分别用粉尘螨和屋尘螨加入福氏佐剂混匀制作粉尘螨抗原和屋尘螨抗原。以ELISA法检测所制得的鸭抗粉尘螨IgY对这两种抗原的结合效价。
结果加下：
  IgY   检测用抗原   抗体效价
  纯鸭抗粉尘螨IgY   粉尘螨   1∶256
  纯鸭抗粉尘螨IgY   屋尘螨   1∶128
检测结果说明采用本发明的方法免疫产蛋鸭，所制备的鸭抗粉尘螨特异性IgY完全可以达到与免疫鸡一样的效果。所得的鸭抗粉尘螨特异性IgY照样有很高的效价并具有一定的广谱性。
实验例3：以ELISA法分别检测所制备的抗蒿草花粉特异性IgY对这四种花粉抗原的结合效价。结果如下表：
  IgY   检测用抗原   抗体效价
  纯抗蒿草花粉IgY   蒿草花粉蛋白   1∶216
  纯抗蒿草花粉IgY   豚草花粉蛋白   1∶128
  纯抗蒿草花粉IgY   藜草花粉蛋白   1∶128
  纯抗蒿草花粉IgY   律草花粉蛋白   1∶128
从表中可以看出，采用本发明的方法免疫母鸡所制得的抗蒿草花粉特异性IgY对免疫的过敏原蒿草花粉的蛋白抗原结合效价较高，同时具有一定的广谱性；对于有“抗原交叉”的同属莠草类花粉都同样有很高的效价。这样就提示我们，用本发明的方法制备的抗蒿草花粉特异性IgY可用于凡是对莠草类花粉过敏的患者作预防和治疗之用。
由于同科同属的植物花粉之间有抗原交叉，因此，本草类植物花粉也只需以有代表性的几种树花粉(如法国梧桐花粉、柳树花粉、松树花粉等)制备几种抗相对应花粉的特异性IgY，每种抗某属花粉特异性IgY对同一属树花粉引致的过敏症都可通用。禾木植物花粉也只需以有代表性的狗尾草、梯牧草、黑麦等作抗原分别制备抗狗尾草等花粉的特异性IgY，对各自同一属的有“抗原交叉”的禾木植物花粉过敏症都可适用。
实验例4：以ELISA法分别检测所制得的抗烟曲霉菌特异性IgY对烟曲霉菌、土曲霉菌、棒曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌5种抗原的抗体结合效价。结果如下表所示：
  IgY   检测用抗原   抗体效价
  纯抗烟曲霉菌特异性IgY   烟曲霉菌   1∶512
  纯抗烟曲霉菌特异性IgY   土曲霉菌   1∶256
  纯抗烟曲霉菌特异性IgY   棒曲霉菌   1∶256
  纯抗烟曲霉菌特异性IgY   黑曲霉菌   1∶256
  纯抗烟曲霉菌特异性IgY   黄曲霉菌   1∶256
从表中看出，采用本发明的抗原制作方法所制得的烟曲霉菌特异性IgY抗体结合效价相当高，对同属的其他霉菌的结合效价也较高；从而，进一步验证了这五种霉菌之间有抗原交叉性。本发明制备的抗霉菌特异性IgY广谱性也很强，这表明只要制备抗某种霉菌的特异性IgY，对凡有“抗原交叉性”的其他霉菌引发的过敏症也都会有很好的作用。
实验例5：以ELISA法，用所制取的检测抗原检测抗猫过敏特异性IgY对该猫过敏原的抗体结合效价，检测结果效价为1∶128。证明按本发明的方法制得的抗猫过敏特异性IgY对猫过敏原抑制效果相当理想。
实验例6：以ELISA法，采用本例(1)项中所列方法制作的蟑螂蛋白抗原作检测抗原，检测所制备的抗蟑螂过敏特异性IgY对蟑螂过敏原的抗体结合效价，检测结果效价为1∶256。验证了按本发明的方法制备的抗宠物过敏特异性IgY效果十分理想。
实验例7：以ELISA法，采用本例(1)项中所制得的IgE抗原作检测抗原，检测所制备的抗IgE特异性IgY对IgE的抗体结合效价，检测结果效价为1∶512。实验证明，采用本发明的方法制备的抗IgE特异性IgY具有很高的活性，完全达到预期的效果。
实验例8：哮喘患者使用抗哮喘组合雾化剂的临床观察
(1)在患中度哮喘的住院成年患者中，挑选经过“皮肤点刺试验”诊断为对尘螨过敏或莠草类花粉过敏，或二者皆过敏的患者共计20名。
(2)采用本发明制备的“抗哮喘组合雾化剂”，药液瓶打开后，把药液倒入PARI型压缩雾化气泵中，经雾化供患者吸入。每天吸二次，每次持续吸入5-10分钟。
(3)每天观察试验患者的症状变化情况。
(4)经吸用“抗哮喘组合雾化剂”2周后，15名患者哮喘音基本消失，喘息症状减轻。有5名患者夜间仍有阵发性喘息，给予补充吸入“抗哮喘组合雾化剂”，吸入10分钟后，喘息即停止。
(5)连续吸入2个月后，其中17名患者的喘息症状消失，另3名患者喘息症状也明显改善，由每日有发作，变为每周1-2次偶发性发作。
实验例10：过敏性鼻炎患者使用手揿常压喷雾剂型的“抗过敏特异性IgY”的临床观察结果：
(1)通过“皮肤点刺试验”诊断，选择对尘螨或蟑螂过敏的慢性鼻炎患者50名作临床试验。
(2)将50名患者随时分为二组，治疗组使用抗过敏“常压定量喷雾罐”，对照组使用装有安慰剂的“常压定量喷雾罐”。
治疗前，2组患者都患有较严重的过敏性鼻炎持续鼻塞鼻痒和阵发性喷嚏，流大量浆液性鼻涕，嗅觉减退。治疗组有3人嗅觉减退，对照组2人嗅觉减退。
(3)两组患者分别使用手揿喷雾罐往鼻部喷入雾状溶剂，每天喷3次。观察并严格记录两组患者症状。
(4)治疗2周后，治疗组25人中有19人鼻塞和鼻痒症状基本消除，鼻涕量明显减少；有4人症状有改善，有2人没有明显感觉。
对照组中25人，症状基本维持不变。
(5)连续治疗12周后，治疗组25人中，有22人鼻塞和鼻痒症状完全消除，流鼻涕情况也基本恢复正常；原嗅觉减退的3人已恢复正常嗅觉：有2人症状明显减轻，有1人无改善。对照组中25人，症状反复，没有改善。
实施例1：制备抗粉尘螨特异性IgY将市面上购得的现成的粉尘螨注射液按1∶1比例与福氏佐剂混匀，置于高速匀浆机，以20000rpm进行高速匀化，制得乳状匀质抗原；用所制得的粉尘螨抗原对良种蛋鸡进行免疫，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法，每只鸡每次注射1-2ml抗原，相当于约5000-10000只尘螨；每隔二周再强化注射一次，计免疫3次；第一次免疫20天后，检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水稀释，搅拌均匀，用0.1N的Hcl调整ph5.5-6.0，2-6℃，静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得取超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅伴，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅伴均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，即为抗粉尘螨物异性IgY粗提物；将以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，得到纯抗粉尘螨物异性IgY。
实施例2：免疫产蛋鸭，制备抗尘螨特异性鸭IgY
将粉尘螨注射液按3∶2比例与福氏佐剂混匀，加入高速匀浆机，以20000rpm进行高速匀化，制得乳状匀质抗原；用所制得的粉尘螨抗原对良种蛋鸭进行免疫，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法，每只鸭每次注射1-2ml抗原，相当于约5000-10000只尘螨；每隔二周再注射一次，计免疫3次；第一次免疫20天后，检取鸭所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水稀释，搅拌均匀，用0.1N的Hcl调整pH5.5-6.0，2-6℃静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得取超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅伴，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅伴均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，即为抗粉尘螨特异性鸭IgY；将以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，经KEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，得到纯抗粉尘螨特特异性鸭IgY。
实施例3：制备抗蒿草花粉、豚草花粉、藜草花粉和藻草花粉特异性IgY
分别用蒿草花粉、豚草花粉、藜草花粉和藻草花粉制备抗原，首先将所采集的四种花粉分别用高速匀浆机以10000rpm转速高速粉碎，然后按5∶4比例分别加入福氏佐剂，再在高速匀浆机中以20000rpm高速匀化，分别制得四种乳状花粉蛋白抗原；用所制得的蒿草花粉等抗原分别对良种蛋鸡进行免疫，同样采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法，每只鸡每次注射1.5ml抗原，相当于约50-100g花粉蛋白质；每隔二周再强化注射一次，一个月内计免疫3次；第一次免疫20天后，分别检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水，静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得到超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，分别制得抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉特异性IgY粗提物干粉成品；将以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，经KEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，把粗提物纯化，即得抗蒿草花粉、抗豚草花粉、抗藜草花粉和抗藻草花粉特异性纯IgY。
实施例4：制备抗霉菌过敏原特异性IgY
用烟曲霉菌、土曲霉菌、棒曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌混合制作抗原：将以上4种霉菌分别按常规培养后，制取菌液；各菌液以1∶1∶1∶1比例混合，制成混合菌液；将此混合菌液按6∶7比例加入福氏佐剂，然后置高速匀浆机以20000rpm高速匀化，制得4种霉菌混合抗原；用此混合抗原对良种蛋鸡进行免疫，同样采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法，每只鸡每次注射1.0ml抗原，相当于约200μg蛋白质抗原；每隔二周再强化注射一次，计免疫3次；第一次免疫后20天后，检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得到超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，即制得抗烟曲霉菌、抗土曲霉菌、抗棒曲霉菌、抗黑曲霉菌、抗黄曲霉菌特异性IgY粗提物干粉成品；将以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，即得抗霉菌过敏原特异性纯IgY。
实施例5：制备抗宠物过敏的特异性IgY
取猫唾液和尿液按1∶1比例混合，取混合物按7∶8比例加入福氏佐剂，放置入高速匀浆机以20000rpm高速混匀，制得乳状猫抗原；用所制得的乳状猫抗原对良种蛋鸡进行免疫，同样采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法，每只鸡每次注射1-2ml抗原，相当于约50-100μg蛋白质抗原；每隔二周再强化注射一次，计免疫3次；第一次免疫20天后，检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水，静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得到超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，即制得抗宠物过敏的特异性IgY粗提物成品；将以上IgY粗提取物溶解于PH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，即得抗宠物过敏的特异性纯IgY。
实施例6：制备抗蟑螂过敏特异性IgY
收集30-50只的蟑螂，剪去其翅膀，将其躯干集中置入高速匀浆机以10000rpm进行粉碎；然后按蟑螂碎屑的重量，以6∶8的重量比加入福氏佐剂，再在高速匀浆机中以20000rpm高速粉碎匀化，制得乳状蟑螂蛋白抗原；用所制得的蟑螂抗原对良种蛋鸡进行免疫，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，每只鸡每次注射1-2ml抗原，相当于50-100微克蛋白质；每隔二周再强化注射一次，一个月内计免疫3次；第一次免疫20天后，检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水稀释，搅拌均匀，用0.1N的Hcl调整ph5.5-6.0，2-6℃，静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得取超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，即为抗蟑螂过敏特异性IgY粗提物；将以上IgY粗提物溶解于PH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，得纯抗蟑螂过敏特异性纯IgY。
实施例7：抗IgE特异性IgY的制备
将免疫球蛋白IgE按3∶5比例与福氏佐剂混合，然后加入高速匀浆机以10000rpm高速匀化，制得IgE抗原；用所制得的IgE抗原对良种蛋鸡进行免疫，采用皮下注射和翅静脉注射相结合的强化免疫法，每只鸡每次注射量达到1-2ml抗原，相当于50-100微克蛋白质；每隔二周再强化注射一次，一个月内计免疫3次；第一次免疫20天后，检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄，搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水稀释，搅拌均匀，用0.1N的Hcl调整ph5.5-6.0，2-6℃，静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得取超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，即为抗IgE特异性IgY粗提取物；将以上IgY粗提取物溶解于pH7.0、0.01MPB，经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，得抗IgE特异性纯IgY。
实施例8：抗哮喘组合雾化剂的制备
抗粉尘螨特异性IgY干粉100g和抗蒿草花粉特异性IgY100g以及抗IgE特异性IgY干粉100g加入小型搅拌机中充分混和，得到抗哮喘特异性复合IgY300g；
按以下配方调配30升抗哮喘复合IgY组合溶液
抗哮喘特异性复合IgY             300g
阿斯巴甜                        36g
香橙香精                        90g
水蜜桃香精                      30g
生理盐水加至                    30升
先调制生理盐水25升，然后加入阿斯巴甜和香精，搅拌均匀后，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着，加生理盐水至30升，充分搅拌均匀；测量溶液的pH值，用1.0NNaOH溶液调pH至6.5-7.5；经细菌过滤除菌，然后采用无菌瓶灌装抗哮喘复合喷雾剂。每支装20ml。
实施例9：制备抗过敏手揿定量压力喷雾罐
抗粉尘螨特异性IgY干粉100g和抗蟑螂过敏原特异性IgY干粉100g以及抗IgE特异性IgY干粉100g加入小型搅拌机中充分混和，制成抗过敏特异性复合IgY干粉300g；
按以下配方调配200升抗过敏复合IgY组合溶液；
抗过敏特异性复合IgY                300g
阿斯巴甜                           240g
香橙香精                           600g
水蜜桃香精                         200g
薄荷香精                           1400g
蒸馏水                             加至200升
先取蒸馏水180升，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200升，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.oN NaOH溶液调节pH至6.5-7.5；
溶液调配好后，必须在压力罐生产线上灌装手动定量压力喷雾罐20000支，每支喷雾罐灌足10ml后，必须再充入压力氮气或者氟里昂作为助推剂(抛射剂)，装上定量阀门，密封，即得。
实施例10：制备抗过敏定量常压喷雾罐
抗霉菌过敏原特异性纯IgY干粉100重量份，抗宠物过敏特异性纯IgY干粉100重量份，，抗IgE特异性IgY干粉100重量份，加入小型搅拌机中充分混和，制成抗过敏特异性复合IgY干粉300重量份，；
按以下配方调配200重量份抗过敏复合IgY组合溶液；
抗过敏特异性复合IgY            300重量份，
阿斯巴甜                       240重量份，
香橙香精                       600重量份，
水蜜桃香精                     200重量份，
薄荷香精                       1400重量份，
蒸馏水                         加至200体积份
先取蒸馏水180体积份，然后分别加入阿斯巴甜、香精，搅拌均匀，再边搅拌边缓缓加入复合IgY；接着加蒸馏水至200体积份，充分搅拌均匀，测量溶液pH值，根据所测的pH值用1.0N NaOH溶液调节pH至6.5-7.5间；经细菌过滤除菌，灌装手揿定量常压喷雾罐20000支，每支10ml，每支灌装满10ml。

Claims (1)

1、一种抗蒿草花粉特异性IgY的制备方法，其特征在于该方法为：
用蒿草花粉制备抗原，首先将所采集的蒿草花粉用高速匀浆机以10000rpm转速高速粉碎，然后按5∶4比例加入福氏佐剂，再在高速匀浆机中以20000rpm高速匀化，制得蒿草的乳状花粉蛋白抗原；用所制得的蒿草花粉抗原对良种蛋鸡进行免疫，同样采用皮下注射和翅静脉注射相结合的免疫法，每只鸡每次注射1.5ml抗原，相当于50-100μg花粉蛋白质；每隔二周再强化注射一次，一个月内计免疫3次；第一次免疫20天后，分别检取鸡所产免疫蛋；用酒精擦洗消毒免疫蛋，用打蛋机击破蛋，蛋黄筛取出蛋黄；搅打蛋黄均匀，按蛋黄液量加入4-6倍蒸馏水，静置过夜，虹吸得取上清液，称A液；以上沉淀液以8000rpm离心20分钟，得取上清液，称B液；将A液和B液混和均匀，超滤，得到超滤浓缩液，加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为1.0‰，搅拌，加入2.0％氯化钙液，至终浓度1.0‰，搅拌均匀，2-6℃静置过夜，8000rmp离心30分钟，取上清液，细菌过滤器过滤，得到无菌滤液，冷冻干燥，制得抗蒿草花粉特异性IgY粗提物干粉；将上述IgY粗提取物溶解于pH7.0、0.01MPB，先后经DEAE-SephadexA50柱层析和SephadexG200凝胶柱层析，把粗提物纯化，即得抗蒿草花粉特异性纯IgY。
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