CN1279807C - 一种提高杂交水稻产量潜力的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高杂交水稻产量潜力的方法，它采用杂交和连续回交的方法将马来西亚普通野生稻(O.rufipogon)的高产基因yld1.1和(或)yld2.1导入杂交水稻亲本，借助于分子标记辅助选择(MAS)技术鉴定携带野生稻高产基因的植株，结合考察农艺性状和测交分析，筛选产量性状有所改善并杂种优势明显提高的植株，培育强优恢复系和创制育种新资源，并配制高产杂交水稻新组合。
Description
技术领域
本发明涉及植物新品种选育技术。
背景技术
我国现有人口超过12.5亿，人均耕地面积不足1.3亩，人口逐年增加和耕地逐年减少在近期内已成为不可逆转的趋势，预计本世纪30年代，我国人口将增加到16亿，人均耕地将减少到1亩左右，粮食自给仍然是摆在我们面前的紧迫问题。解决这一问题行之有效的措施，就是通过农作物品种改良继续提高粮食单产。实践证明：每次育种方法的革新和新材料的应用都将带来农作物产量潜力的大幅度提高。始于50年代中期的我国水稻品种矮秆化育种和70年代杂交水稻的大面积应用，主要由于利用了矮秆基因sd-1和野败雄性不育基因资源，带来了我国水稻产量的两次飞跃。与此并行不悖的是，随着水稻产量潜力的不断提高，水稻栽培种遗传资源的利用也日趋饱和，从而导致近年来新培育品种(组合)的单产出现徘徊局面。要进一步大幅度提高水稻产量潜力，必须拓宽遗传资源利用范围，这有赖于从远缘种群中引入高产基因资源。因此，转移远缘物种有利性状基因创新作物种质将成为21世纪作物遗传育种领域的研究热点。
栽培水稻有20多个野生近缘种，包含极其丰富的遗传变异。为了拓宽现有品种的遗传多样性，许多育种家都试图发掘这一重要的遗传资源宝库，并为此作出了不懈努力，在质量性状方面已经取得了显著成效。如利用来源于O.nivana的水稻矮缩病持久抗性(Khush等，1977；Plucknett等，1987)和来源于O.spontanea的野败细胞质雄性不育性(Li and Zhu，1988)等。但直接利用野生资源中某一特定基因来改良水稻产量等数量性状，尚无先例。究其原因主要存在两大障碍：一是在野生稻中存在大量对产量不利的基因的干扰，使野生稻中蕴藏的高产基因难以被发现；二是连锁累赘，即目的基因与不利基因的紧密连锁是远缘杂交中难以解决的问题。近年来迅速发展的分子生物学技术，如分子标记和作图技术，使鉴定数量性状基因位点成为可能。1995年，国家杂交水稻工程技术研究中心与美国康奈尔大学(Cornell)合作，尝试鉴定和利用蕴藏在野生稻中的有利基因，结果在马来西亚普通野生稻(O.rufipogon)与V20B的回交群体中发现了两个高产数量性状基因(QTL)yld1.1和yld2.1，分别位于第1和第2染色体上，每个基因具有在现有三系杂交稻基础上增产18％左右的效应(Xiao等，1996)。这一发现后来得到其他一些野生稻产量QTL分析群体的进一步证实，如CIAT的群体(Pilar Moncada等，2001)和韩国的群体，其高产基因的定位结果都在第一染色体上与yld1.1基本相同的位置。因此，野生稻O.rufipogon中存在高产QTL的事实已毋庸置疑。
迄今为止，在番茄的果重和可溶性固相物含量的改良方面，应用RFLP图谱技术定向转移微效数量性状基因已经获得成功。在已构建的RFLP图谱中定位了6个控制果重的QTL，每一位点的作用幅度为3.5-6.0克。另外还定位了4个控制可溶性固相物含量的QTL，每个位点的作用幅度为0.83％-1.89％(Paterson等，1988)。采用远缘杂交、回交手段，借助图谱分析技术，已成功地将野生种中一些有用的QTL位点转移到商用番茄杂交种的染色体中，增产幅度超过20％。但在应用野生稻高产QTL改良杂交水稻产量潜力方面目前尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种提高杂交水稻产量潜力的方法，利用该方法可培育出强优恢复系和创制育种新资源，并配制成高产杂交水稻新组合，从而提高杂交水稻产量潜力。
本发明的技术解决方案，所述提高杂交水稻产量潜力之方法的步骤为：
(1)野栽杂交：以三系或两系杂交水稻亲本(简称A)为母本、马来西
亚普通野生稻(O.rufipogon)(简称B)为父本进行杂交，获得杂交F1种子；
(2)首次回交：以上述杂交F1为亲本之一与亲本A进行回交，获得200粒以上的回交1代种子(即BC1F1)；首轮回交前无需选择；
(3)首轮分子标记选择：田间种植BC1F1，分蘖期按单株取样提取基因组总DNA，以与yld1.1和yld2.1紧密连锁的分子标记RM9和RM166为引物进行PCR扩增，电泳分离分析，筛选含有野生稻扩增带型的单株10株以上；
(4)继续回交：田间淘汰上述分子标记筛选的中选单株中农艺性状差的单株，选择农艺性状优良的单株继续与亲本A回交，获得回交2代植株(即BC2F1)；
(5)继续分子标记筛选：田间种植BC2F1植株200株以上，先后用RM166、RM9、RM208和RM306等4个SSR标记进行4轮分子标记分析，筛选在这4个标记位点均具有马来西亚普通野生稻扩增带型的单株，再根据田间农艺性状选择优良单株继续与亲本A回交，获得回交3代种子(BC3F1)；并依次类推，直至回交3～6代，获得BC3F1至BC6F1种子；
(6)自交筛选：将上述获得的BC3F1至BC6F1种子种植于大田，每群体种植500株以上，选择农艺性状优良单株100株以上进行上述4对引物的分子标记筛选，并以中选单株为亲本与三系或两系不育系进行广泛测交。获得若干测交组合，根据组合杂种优势表现，决选亲本株系，即为新选育的携带野生稻高产基因的强优恢复系。以下对本发明做出进一步说明：
本发明所述提高杂交水稻产量潜力的方法属于植物新品种选育技术，它采用杂交和连续回交的方法将马来西亚普通野生稻(O.rufipogon)的高产基因yld1.1和(或)yld2.1导入杂交水稻亲本，借助于分子标记辅助选择(MAS)技术鉴定携带野生稻高产基因的植株，结合考察农艺性状和测交分析，筛选产量性状有所改善并杂种优势明显提高的植株，借以培育强优恢复系和创制育种新资源，并配制高产杂交水稻新组合。所述杂交和回交方法，以及高产基因yld1.1和(或)yld2.1导入杂交水稻亲本、分子标记辅助选择(MAS)技术、农艺性状考察和测交分析、筛选产量性状有所改善并杂种优势明显提高的植株等均采用已有技术方法。
本发明用于分子标记分析的4对引物序列组成如下表所示：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 退火温度(℃) | 染色体位置 |
| RM166 | GGTCCTGGGTCAATAATTGGGTTACCTTGCTGCATGATCCTAAACCGG | 60 | 2 |
| RM9 | GGTGCCATTGTCGTCCTCACGGCCCTCATCACCTTC | 60 | 1 |
| RM208 | TCTGCAAGCCTTGTCTGATGTAAGTCGATGATTGTGTGGACC | 55 | 2 |
| RM306 | CAAGGTCAAGAATGCAATGGGCCACTTTAATCATTGCATC | 55 | 1 |
本发明方法中，所述回交代数的确定是：向杂交稻亲本转移野生稻高产基因一般只需回交3～6代即可；具体回交代数与分子标记筛选时使用的分子标记数目有关，如果在回交2代(BC2F1)以上增加使用的分子标记数目，并有条件对中选单株进行DNA指纹分析，则可降低回交代数至BC3F1～BC4F1，否则，应回交至BC5F1～BC6F1以上。
由以上可知，本发明为一种提高杂交水稻产量潜力的方法，它采用杂交和连续回交的方法将马来西亚普通野生稻(O.rufipogon)的高产基因yld1.1和(或)yld2.1导入杂交水稻亲本，借助于分子标记辅助选择(MAS)技术鉴定携带野生稻高产基因的植株，结合考察农艺性状和测交分析，筛选产量性状有所改善并杂种优势明显提高的植株，培育强优恢复系和创制育种新资源，并配制高产杂交水稻新组合。
具体实施方式
实施例1：以三系杂交稻恢复系测64-7为受体和轮回亲本，与野生稻高产基因供体材料杂交和回交。在每一个回交世代分单株提取基因组DNA，利用紧密连锁的分子标记进行分析，跟踪野生稻高产基因yld1.1和yld2.1，筛选含有野生稻扩增带型的杂合基因型单株，再以受体亲本为轮回亲本连续回交至BC3F1。然后自交多代，并主要根据农艺性状进行田间选择，筛选优良单株与V20A、金23A等三系不育系进行测交，根据大量测交F1的产量表现再决选恢复系株系。结果从BC3F7中选育出强优恢复系远恢611(简称Q611)，其生育期与测64-7相当，每穗总粒数却比对照增加80％以上。其测交组合均表现出强大的杂种优势。用该恢复系与金23A配制的强优杂交组合“金优611”单位面积产量比同熟期对照V77高出20％以上，现已进入大面积生产示范。金优611品比实验考种结果列于下表1，金优611百亩示范栽培产量结构列于下表2。
详细技术说明如下：
①上述供体材料来源于马来西亚普通野生稻与V20B的回交系，再与测64-7的测交后代群体，即20A/O.rufipogon//V20B///V20B////Ce64之后代。
②分子标记辅助选择技术：对回交、自交后代按单株提取基因组总DNA，以各单株总DNA为模板，以与yld1.1和yld2.1紧密迩锁的SSR标记RM9、RM166等为引物进行PCR扩增。扩增反应总体积为20ul，其中含pH8.4的Tris-HCl10mM、KCl50mM、MgCl21.5mM、每种dNTP0.25mM、每种引物0.2uM、基因组模板DNA30ng以及1单位Taq DNA聚合酶。PCR反应文件为：首先94℃ 4分钟；然后32个以下温度循环：即94℃ 1分钟、55～60℃1分钟15秒、72℃ 2分钟；最后，72℃ 5分钟。RM166、RM9和RM306的PCR扩增产物采用3％琼脂糖凝胶电泳进行分离，RM208的PCR扩增产物则需采用6％聚丙烯酰胺序列胶(polyacylamide sequencing gel)进行电泳分离，然后在紫外灯显带分析并读取数据。
③农艺性状考察：在田间一般栽培管理条件下，主要根据株型、株高、分蘖力、有效穗数、穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、千粒重、后期落色等性状进行考察，根据综合农艺性状的优劣进行取舍，淘汰在上述标记位点虽含野生带扩增带但综合农艺性状差的单株。
④测交鉴定杂种优势：以中选的优良恢复系单株材料为父本与生产上大面积应用的三系和两系不育系杂交，配制成若干杂交组合，每个组合种植50株以上，重复2次，并每隔10个组合设置一个对照(V77，同样50株)，田间按高产栽培要求统一管理，记载各组合杂种优势表现和各主要生育期，成熟期取样考种并测产。
表1：金优611品比试验考种结果
| 田间编号 | 株高(cm) | 穗长(cm) | 实粒数 | 总粒数 | 结实率/％ | 千粒重(克) | 有效穗(万/亩) | 理论产量(kg/mu) | 比CK+％ |
| 金优611 | 96.8 | 25.0 | 196.4 | 242.2 | 81.1 | 25.7 | 17.6 | 889.2 | 43.36 |
| V77(对照) | 85.1 | 22.4 | 97.9 | 105.6 | 92.7 | 31.7 | 20.0 | 620.3 |
表2金优611百亩示范栽培产量结构
| 示范户主 | 面积(亩) | 播种期(月/日) | 有效穗(万/亩) | 每穗总粒数 | 结实率/％ | 千粒重/克 | 理论产量(kg/亩) | 实际产量(kg/亩) | 比CK±％ |
| 蒋德龙 | 1.2 | 6/19 | 17.18 | 200.2 | 83.2 | 25.8 | 738.3 | 668.5 | 33.6 |
| 蒋雪阶 | 1.5 | 6/20 | 16.64 | 199.8 | 85.2 | 26.3 | 745.1 | 625.2 | 25.0 |
| 熊国辉 | 2.0 | 6/20 | 17.16 | 186.0 | 84.9 | 26.0 | 704.6 | 650.8 | 30.1 |
| 蒋德虎 | 1.5 | 6/20 | 17.02 | 207.9 | 81.2 | 25.9 | 744.2 | 657.1 | 31.3 |
| V/46(CK) | 0.16 | 6/18 | 17.92 | 113.1 | 89.9 | 31.2 | 568.5 | 500.3 |
实施例2：以超级杂交稻恢复系9311为受体和轮回亲本与马来西亚普通野生稻杂交、回交，并借助于分子标记辅助选择技术跟踪野生稻高产基因yld1.1和yld2.1，从BC4F2开始选出携带野生稻高产基因的植株，其生育期与受体亲本9311相当。经与培矮64S测交，表现出强大的杂种优势，测交组合单位面积产量比对照增产20％以上(表3)。
表3 9311近等基因系与培矮64S测交组合考种结果
| 编号 | 株高(cm) | 穗长(cm) | 总粒数 | 结实率％ | 有效穗数(万/亩) | 千粒重(克) | 理论产量(公斤/亩) | 实际产量(公斤/亩) | 比CK±％ |
| 培矮64S/H9311 | 124.6 | 26.2 | 208.2 | 86.2 | 17.8 | 24.0 | 766.3 | 678.9 | +26.4 |
| 两优培九(对照) | 121.0 | 24.3 | 175.7 | 75.3 | 17.5 | 24.5 | 567.2 | 537.2 |
具体技术说明：本例是以9311为母本，以马来西亚普通野生稻为父本(高产基因供体)杂交，再以9311为父本进行回交。回交1代(即BC1F1)提取400株单株的基因组总DNA，采用分子标记RM9和RM166进行分析，再结合考察田间农艺性状，筛选30多个优良单株继续与9311回交。从回交2代开始每个世代分子标记分析200个以上单株，同样筛选农艺性状优良，并同时在上述标记位点含野生稻扩增带的单株继续与9311回交，直至BC4F1以上，然后自交，并继续筛选单株与两系不育系培矮64S进行测交，再根据测交后代的杂种优势表现决选携带野生稻高产基因的强优恢复系。分子标记分析、农艺性状考察以及测交鉴定方法与实施例1相同。
Claims (1)
1.一种提高杂交水稻产量潜力的方法，其特征是，它的步骤为：
(1)野栽杂交：以三系或两系杂交水稻亲本A为母本、马来西亚普通野生稻B为父本进行杂交，获得杂交F1种子；
(2)首次回交：以上述杂交F1为亲本之一与亲本A进行回交，获得200粒以上的回交F1种子BC1F1，首轮回交前无需选择；
(3)首轮分子标记选择：田间种植BC1F1，分蘖期按单株取样提取基因组总DNA，以与yld1.1和yld2.1紧密连锁的分子标记RM9和RM166为引物进行分子标记分析，筛选含有马来西亚普通野生稻扩增带的单株10株以上；
(4)继续回交：田间淘汰上述分子标记筛选中选的农艺性状差的单株，这些农艺性状为：株型、株高、分蘖力、有效穗数、穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、千粒重、后期落色，选择上述农艺性状优良的单株继续与亲本A回交，获得回交2代植株BC2F1；
(5)继续分子标记筛选：田间种植BC2F1植株200株以上，先后用RM166、RM9、RM208和RM306为引物进行4轮分子标记筛选，选择在这4个标记位点均具有马来西亚普通野生稻扩增带型的单株，再根据步骤(4)所述的农艺性状选择优良单株继续与亲本A回交，获得回交3代种子BC3F1，并依次类推，直至回交3～6代，获得BC3F1至BC6F1；
(6)自交筛选：将上述获得的BC3F1至BC6F1种子种植于大田，每群体种植500株以上，选择农艺性状优良单株100株以上进行上述RM166、RM9、RM208和RM306四对引物的分子标记筛选，并以中选单株为亲本与三系或两系不育系进行广泛测交，获得测交组合，根据组合杂种优势表现，决选亲本株系，即为新选育的携带野生稻高产基因的强优恢复系。
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