CN1276955C - 微生物性能提高的涂料 - Google Patents

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    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins

Abstract

可将微生物性能提高的涂料施涂到任何会生长有害或不希望有的生物体的表面上。所述多层制件的各层可以包含有助于所述多层制件和各层的微生物性能的微生物、酶、营养物和其它成分。

Description

微生物性能提高的涂料
本申请要求于2002年7月12日提交的美国临时申请No.60/395330的优先权，其内容参考引用于此。
本领域技术人员熟知在许多环境中存在和繁衍微生物、酶和孢子。一种这样的环境就是油漆和涂料的环境。微生物在储罐中潮湿或未固化的表面以及施涂到各种结构、墙壁、内衬和基材上的干燥或固化态上繁衍活跃。而且，在浸没在水中、埋在土里或者浸在其它营养源如血液系统中的结构和容器上会形成微生物层。至今，本领域技术人员已经努力克服了微生物的一些负面影响，如发霉、腐蚀、毁损和其它恶化现象。克服这一问题的最常见方法就是使用缓冲剂和生物杀灭剂来灭杀所含的微生物组分。
控制微生物影响的另一方面涉及在涂料中使用接种的孢子、微生物和酶。弄脏或污染表面的过程开始于形成一种膜，它提高了侵入生物或微生物污损种群的沉积。因此，起始步骤就是确定要灭杀的目标生物体。下一步就是选择和基底相容的涂料，提供合适的粘附和耐久性。对候选作为接种加入涂料中的微生物和酶而言，所述涂料也必须是无毒的。因此，生物体的选择是所述方法的基础。已经确定要灭除的目标污染物之后，确定所述污染物的化学组成。根据所述污染物以及作为粘合剂将其粘结到表面上的分泌物的化学组成，选择微生物和酶的组合，使粘合剂的效用降低。
本发明的一个目的包括制造天然薄膜或膜，或自维持群落，这是一种对目标生物体沉积或生长来说不易接受的基底。可以制造薄膜或膜，确保其比可能存在于油漆或涂料材料中的其它微生物点优势。这种实施方式可以影响易于改变所述沉积表面即受保护的表面和环境之间的界面的附着生物。
而且，在结构、导管、容器或制件具有浸没在营养物或从中露出的表面的情况下，常开始生长有效地成为新基底的薄膜。这种新基底能沉积各种生物体。本发明的另一作用是影响这种基底。本领域最新的进展(如美国专利No.598200、5919689、6342386B1，其内容参考引用于此)将微生物、孢子和酶作为添加剂用在涂料、油漆和建筑材料中(单独使用或混合使用)。根据所得微生物的生长特征进行选择，由此不断消除会对基底不利的其它微生物的不良影响。
根据美国专利No.5919689，例如涂料组合物可以包含粘合剂中的微生物和/或水解酶，它们施涂到表面上，减少污垢、表面腐蚀和不希望有的微生物生长。发现可用于这种涂料组合物中的微生物是产生至少一种淀粉分解酶和/或蛋白质水解酶的微生物。该专利所述的组合物可以包含聚合物树脂基料(虽然也可以在没有这种基的条件下操作)或者不同材料的基料。所述组合物可以作为单层涂层或多层涂层施涂。
本发明包括确认涂料可以提高微生物性能，此时使用层铺技术。本发明的结构和美国专利5919689所述的多层涂层不同，本发明多层结构的不同点在于：例如，尺寸、各层中的成分或者各层中相同成分量的差异。虽然认识到即使施涂相同的涂料多次也偶然会存在一些微小差异，但是本发明预期的差异比这种偶然差异大。虽然本申请所述层铺技术的优点是固有的(若使用相同组合物的多层涂层)，但是在‘689专利中并未提及那些优点。
本领域技术人员也意识到微生物和酶具有温度依赖性活性等级。见“DynamicAspects of Biochemistry”Baldwin，Ernest，Cambridge University Press，1967，第15-17页。“大多数的化学反应均受温度的影响，反应速度随着温度升高而增大，随温度降低而减慢。酶催化反应对这一普遍规律也是如此，但是由于酶很容易受热失活，温度越高，催化性质就越快破坏。”Baldwin，Ernest，Sc.D.F.I.Biol.Dynamic Aspects of Biochemistry，第5版，CambridgeUniversity Press，1967，第15-18页。“酶的催化性质通常仅在稍受限制的pH范围内发挥。在这一范围内，所述活性经过某些具体pH的最大值，然后再次降低。在其一般形式中，典型的酶的pH/活性曲线和绘制简单两性电解质如氨基乙酸对pH的离子化程度所得的曲线很类似。也回想到两性电解质如蛋白质和氨基酸的溶液的大多数物理性质，如溶解性、渗透压、电导率、粘度等均在某一具体pH处经过最大值或最小值(同前)。Id。
本发明一个实施方式涉及层铺具有微生物和酶添加剂的涂料的方法。所述层铺方式使基底和环境之间的界面处的微生物活性增大。所述有微生物添加剂的分层材料不一定是相同材料例如涂料或油漆的多层，但是所述层常常单独或组合包含细胞、孢子或酶，和/或营养源。这些成分本身可以加到涂料中，或者以吸收到基底如碳酸钙、粘土、滑石或硬脂酸铝的这些成分的形式加入。分层结构的一个好处是不是所有用在分层复合物中的成分均要求相容。不相容的材料或者对形成层过程中使用的不同溶剂敏感的材料通常以单独的层分离。所述层也可以不同厚度施涂。
层铺法对保护酶和微生物的活性提供多个优点。这包括层中的微生物营养源不与环境(即海水)接触，使形成“天然”薄膜的生物体不能得到营养源，而仍能使加入另一层例如最外层中的保护接种物得到该营养源用于生长和保持活性。营养源的代表性例子包括糖、糖醇、多肽、酵母提取物、多糖和复杂有机材料的水解产物(hydrolsate)。此外，可以任选地将对细胞和酶活性有利的小分子盐(即NaCl)作为助剂加入下层中。
营养源仅是一种备选物，但是当使用时，它通常是整个涂料基底的内层，而不是在接触环境的界面上。本发明的另一实施方式涉及在硬化液体(即固化树脂、油漆、涂料和水性涂料)中埋入或溶解的微生物材料，它们可以从一层向另一层转移或迁移，仍保持其反应活性。
而且，本发明实施方式提供如下的效果：若将各层接种添加剂的活性加合，微生物和酶活性大于预期的活性。换句话说，所述微生物和酶活性可以是协同的，即整个活性的总和大于所述部分的活性之和。这可以通过各自连续加入所述接种的涂层之后测定酶活性水平来测量。这种效果可以用分层的材料来获得。至于这种层铺法的例子，在游船的结构中，可以将微生物和孢子加入船体的凝胶涂层而漆中。将营养物加到接种的凝胶涂层上的阻隔底涂层中形成第二层。所述最终步骤用酶和植物细胞接种各连续面涂层，完成所述工艺。
虽然设法优化施加作为水下表面的防污剂的微生物和酶，但是已经发现综合使用细胞和酶尤其成功(Bacillus Subtilis，Pseudomonas and Alpha Amylase)。这种组合能很好起作用是因为它分解附着生物分泌物中的蛋白质和多糖。表面上的沉积首先开始于，由多糖、蛋白质和蛋白质粒子组成的分子污损。这种调节薄膜确立了包括细菌、微藻类和真菌的微小污损的判断标准。之后不久，大污损沉积开始于大的藻类和无脊椎动物(invertabrate)。使用微生物和酶常常形成优良的保护涂层，在其中的分层界面形成扩散，产生比预期的各层中接种材料组合更大的活性水平。在这种系统中，生物体和/或酶的群落可以和另一群落物理分隔，且仍旧保持生理联系。通过选择相容的涂料基质、使用pH范围、温度、副产物以及对目标生物体的影响作为依据，可以构建对涂料及其微生物/酶抑制剂之间可靠的群落关系如水解活性有利的系统，由此增强涂料对污损群落侵蚀的保护作用。
在使用涂料时，要一直关注流变性。此处一个主要因素就是涂料中固体的百分数。相反，当我们研究涂料时，要求将固体加入涂料中，它不会最终显著改变涂料的流变性能。涂料中微生物和酶添加剂的浓度可以降低，以提高其流变性，但是通过层铺法，所述涂料活性会更大。所述目的是使涂料一般更容易施涂、性能更好且更有效。
本发明另一实施方式是将营养物加入下层中，为支持微生物提供食物源，而不会促进竞争或破坏性污损群落的生长。这种方法显著减轻了将足量微生物、酶和孢子，加到外部充分竞争的其它细菌(偶然引入或者所述涂料、基底或材料所在或操作的环境中存在的)中所带来的问题。这可以通过层铺来完成，这样可保持所述涂层的活性，或者使由于上层中浓度降低而导致的损失最小。营养细胞可以获得的恒定营养源使群落以持续速率生长，而与所述环境无关。而且，添加剂量的减少拓宽了本观念中可以使用的材料范围。涂料中添加剂的空间量(以固体％表示和计算)由涂料或基底材料的化学特性以及所需的流变性来确定。之前，认为由于化学结构中空间不足，有时会排除用于添加剂的备选载体，由此直接控制来自添加剂的活性程度。
所述涂料可以包含一种或多种微生物，虽然用这种微生物可以实施本发明。合适的微生物类属包括：芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、酵母(例如，saccharonyce)、真菌(例如，曲霉属)或其它本领域已知的微生物。所选的微生物应在所需环境中防止或者减少有害或不希望有的生物体附着。所选微生物应能在其将要接触的环境中生存和繁衍。
所述涂料可以包含各种水解酶，虽然不用这种水解酶可以实施本发明。合适酶的例子包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、裂解酶、水解酶以及其它本领域已知的水解酶。所选水解酶应防止或者减少有害或不希望有的生物体附着。所选水解酶应能在其将要接触的环境中生存和繁衍。
各层涂料可以包含能影响所述层的性质和/或涂有多层的制件特性的任选成分。例如，所述涂料可以包含粘结剂，它是聚合物或其它涂料，如环氧树脂、聚氨酯、聚酯、丙烯酸类、硅氧烷、丙烯酸和其它单体的共聚物或纤维玻璃。应理解，所述涂料可以是各种形式，包括油漆、糊剂、天然漆、层压片、蜡、凝胶和胶水，以及本领域技术人员已知的其它形式。所述涂料可以是聚合物、低聚物、单体(nonomeric)，且可以包含交联剂或固化促进剂(若需要的话)。如本领域技术人员已知的，可以加入催化有效量的无机盐，如NaCl、CaCl2、MgSO4、铵盐和磷酸钾。可以加入包括防腐剂、颜料、染料、表面活性剂的添加剂和其它添加剂，以实现已知的目的。
本发明的涂料和多层可以施涂到任意表面上，防止或延缓有害或不希望有的生物体在所述表面上生长或积聚。所述方法和组合物可以用在各种表面上，包括但不限于在海洋环境、血液系统或者暴露在空气中的各种表面，如船体、海洋标志器、围堰、桩基、入水口、地面、屋顶、屋面板、框架材料、栅栏、水泥结构以及用于医用移植器具的基材或结构材料。可以任意所需的厚度施涂各层涂料，但是层通常为76.2-101.6微米(3-4密耳)厚。由于任意层的厚度取决于几种因素，如层的成分、层数、所得效果以及效果的预期耐久性，这些尺寸也仅仅是用于示例说明的。
在分层结构中，当涂料层置于或浸没在流体组合物中时，生物添加剂会扩散，由此提高指定浓度的细胞的活性，而不会提高污损生物体的生长。由于大多数材料均具有一些孔隙，所述流体会渗透到层材料和基底中，由此利于扩散。但是，所述方法并不仅取决于扩散。即使在底涂层包含添加剂且面涂层没有任何微生物添加剂的涂料中，在所述表面上也有强的活性。很明显，离子效应很类似于“生物电效应”，即使没有流体物质，它也会加强生物添加剂的方向性分散。见Khoury，A.E.Lam，K.，Ellis，B.&Costerton，J.W.(1992)，Prevention andControl of Bacterial Infections Associated with Medical Devices，ASA10Journal，38，M174-M178。这种通过扩散或生物电影响的移动在基底和外部环境之间的界面处形成生物添加剂浓度。相对于来自外部环境的外部更快竞争的生物性，所述浓度使所述添加剂生物，由此，避免多数情况下对基底性能的破坏影响。
发明的实施方式
本发明的方法适于许多环境，在这些环境中，使用涂层来保护基底，使之不会附着有害的微生物。船舶涂料的耐久性和最小渗透率提出了根本的问题：生物材底在受保护基材和可能附着微生物的环境之间的界面迅速扩散。
这些实施例证明了使用多层微生物富集防污涂层的好处。掺有作为防污添加剂的微生物的涂布表面取决于来自海水的支持微生物生长和繁殖的营养物的侵入。在涂层中可以包含增强保护性微生物群生长的营养物。但是，由于因有海洋生物群落和保护性微生物受益于所加入的营养物，将它们加入到水下表面涂料中并不能获得什么好处。这并不意味着不应往所述表面中加入微生物材料，但是它提示不能用对固有土生物体(它在环境界面处竞争占优势)有利的材料来接种所述层。
虽然作为不透海水的阻隔层出现，但是用作水下表面涂料的某些油漆具有足够的可渗透性，使可溶于水的营养物和微生物进入涂层结构中。观察到蛋白质及盐进入基底并不罕见，这并不一定仅通过水进行传递，也可以通过泥土、空气和活生物体的血液系统进行传递。这种方法也有助于添加剂材料从下涂层扩散到置于所述环境中的罩面表层上。同样，扩散速率足以支持加入置于所述环境的涂层中的微生物生长，由此增大生物群落的大小和活性。在有些实施方式中，所述和环境邻接的表面暴露层因此富含来自内层的酶，保护表面，使之不被环境生物群弄脏。除非另有所述，实施例中所示的成分比例为重量份。
实施例1
所用的材料：
涂料---  New Nautical Coatings
         2181 24th Way
         Largo，FL 33771
         One-Cukote and Monterey
酶  ---  Genecor International
         200 Meridian Centre Blvd.
         Rochester，NY 14618-3916
         α-淀粉酶15000L
细胞---  Sybron Chemicals Inc.
         P.O.Box 66
         Birmingham，NJ 08011
         SB Concentrate
         Genesis Technologies International
         696 Winer Industrial Way
         Lawrenceville，GA 30045-7600
         20XNF(孢子悬浮液)
         BEC 106(吸收到碳酸钙上的细胞)
用New Nautical Cukoto(一种丙烯酸类共聚物)涂料或富含0.5％σ营养肉汤粉末的涂料刷涂约76.2微米(3密耳)的湿厚，由此底涂所述纤维玻璃棒。所述棒在空气中干燥，并用包含2.0％α-淀粉酶和2.0％吸收到碳酸钙上的营养细胞的Cukoto涂料罩面涂布。所述罩面层刷涂约76.2微米(3密耳)的湿厚。所述双层涂布的棒在空气中干燥，并在预热淀粉悬浮液中浸没45分钟之后通过碘量滴定来确定其淀粉分解的活性水平。除去所测涂料中所有的氧化亚铜，并用无毒填料代替。试验使用碘(作为本方法的指示剂)来量化淀粉的水解，确定扩散到和环境相接的表面上的酶。而且，水解的量化证实了下层的活性更高。所述活性列于下表1中。
表1：
  水解％
  面涂层底涂层   CUKOTE+2.0％α-淀粉酶+2.0％营养细胞CUKOTE 50
  面涂层底涂层   CUKOTE+2.0％α-淀粉酶+2.0％营养细胞CUKOTE+0.5％有营养的肉汤 90
实施例2
用New Nautical Monterey涂料或富含0.2％σ营养肉汤的Monterey涂料刷涂约76.2微米(3密耳)的湿厚，由此底涂所述纤维玻璃棒。所述棒在空气中干燥，并用包含14％孢子和2％营养细胞的Monterey涂料面刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚。所述双层涂布的棒在空气中干燥，并在预热淀粉悬浮液中浸没45分钟之后通过碘量滴定来确定其淀粉分解的活性水平。再除去涂料中所有的生物杀灭剂，并用无毒填料代替。所得试验结果列于下表2中，并清楚显示下层中营养物明显增大了各单独涂布的面层中微生物添加剂的活性。
表2：
  水解％
  面涂层底涂层   MONTEREY涂料+14％孢子+2.0％营养细胞MONTEREY涂料 50
  面涂层底涂层   MONTEREY涂料+14％孢子+2.0％营养细胞MONTEREY涂料+0.5％营养肉汤 95
实施例3
用没有生物杀灭剂但加入和未加入2.5％σ营养肉汤粉末的Monterey油漆刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚，由此底涂所述纤维玻璃棒。所述棒在空气中干燥，并用富含1.0％营养细胞和孢子(BEC110和106VBEC)混合物(由GenesisTechnologies International提供)的Cukoto涂料罩面刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚。所述双层涂布的棒在空气中干燥，并在预热淀粉悬浮液中浸没30分钟之后通过碘量滴定来确定其淀粉分解的活性水平。所得试验结果列于下表3中，并再次清楚证实下层中营养源的存在提高了活性。
表3：
  水解％
  面涂层底涂层   CUKOTE涂料+7.0％α-淀粉酶+7.0％孢子+1.0％营养细胞MONTEREY涂料 20
  面涂层底涂层   CUKOTE涂料+7.0％α-淀粉酶+7.0％孢子+1.0％营养细胞MONTEREY涂料+2.5％营养肉汤 100
实施例4
所用材料
涂料---  New Noutieat Inc.
         Cukote and Monterey油漆
酶  ---  Genecor International
         α-淀粉酶(15000L)
细胞---  Genesis Technologies International
         BEC 106(吸收到碳酸钙上的营养细胞)
         BEC 110(吸收到碳酸钙上的孢子)
用Monterey油漆或富含营养肉汤(2.5％)、营养细胞(1％)和孢子(1.0％)的Monterey油漆刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚，由此底涂所述纤维玻璃棒。所述底涂的棒用富含7.0％α-淀粉酶、7.0％孢子和1.0％营养细胞的Cukoto油漆罩面刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚。所述双层涂布的棒在空气中干燥，并在预热淀粉悬浮液中浸没45分钟之后通过碘量滴定来确定其淀粉分解的活性水平。所得试验结果列于下表4中，并表明用微生物材料接种的下层的加入值。
表4：
  水解％
  面涂层底涂层   CUKOTE涂料+7.0％α-淀粉酶+7.0％孢子+1.0％营养细胞MONTEREY涂料 20
  面涂层底涂层   CUKOTE油漆+7.0％α-淀粉酶+7.0％孢子+1.0％营养细胞MONTEREY油漆+2.5％营养肉汤+10％营养细胞+1.0％孢子 100
实施例5
所用材料
涂料---  U.S.油漆
         底涂层-Primer Hull-Guard WB
         面涂层-G.L.A.F
酶  ---  Genecor International
         α-淀粉酶15000L
细胞---  Genesis Technologies International
         BEC 106(吸收到碳酸钙上的细胞)
         BEC 110(吸收到碳酸钙上的孢子)
用加入或未加入营养肉汤粉末(6％)的U.S.Paint Hull-Guard WB涂料(一种改性环氧树脂)刷涂约76.2微米(3密耳)的湿厚，由此底涂所述纤维玻璃棒。所述棒在空气中干燥，并用包含6％α-淀粉酶、3％BEC 106V(营养细胞)和3％BEC 110(孢子)的U.S.涂料G.L.A.F罩面刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚，并通过碘量滴定来确定其一淀粉分解酶的活性水平。
开始时，在下层中具有和没有营养肉汤的制剂中细胞和酶的活性相等。但是，72小时之后，相比下层中没有营养肉汤粉末的细胞，和富含营养肉汤的层接触的细胞和酶的活性显著增大。所得试验结果列于下表5中。
表5
  水解％
  面涂层底涂层   U.S.涂料G.L.A.F+6％α-淀粉酶+3％BEC 106V+3％BEC 110U.S.涂料HULL-Guard WB 20
  面涂层底涂层   U.S.涂料G.L.A.F+6％α-淀粉酶+3％BEC 106V+3％BEC 110U.S.涂料HULL-Guard WB+6％营养肉汤粉末 100
实施例6
所用材料
涂料---  U.S.油漆
         底涂层-Primer Hull-Guard WB
         面涂层-除去所有铜的U.S.防污油漆
酶  ---  Genecor International
         α-淀粉酶15000L
         Genesis Technology-纤维素酶
细胞---  Genesis Technologies International
         BEC 106(吸收到碳酸钙上的细胞)
         BEC 110(吸收到碳酸钙上的孢子)
         20×NF(孢子悬浮液)
用包含各40％的营养细胞(BEC 106V)、孢子(BEC 110)和20xNF，α-淀粉酶和纤维素酶的U.S.Paint环氧底漆Hull-Gard ER刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚，由此底涂所述纤维玻璃棒。所述油漆混合物在空气中干燥18小时，并用除去铜(使之对海洋生物体呈惰性)来改性的U.S.防污油漆罩面刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚。在淀粉悬浮液中浸没30分钟之后，检查所述棒，确定其水解活性。所得结果列于下表6中。
表6
  水解％
  面涂层底涂层   无铜的U.S.涂料HULL-Guard+孢子，细胞和酶 85
  面涂层底涂层   无铜的U.S.涂料+孢子，细胞和酶HULL-Guard 100
实施例7
所用材料
涂料---  NeoCAR(TM)Acrylic Latex 850
         Union Carbide Corporation
         Dow Chemical Corporation的子公司
         39Old Ridgebury Road Danbury，CT 06817-0001
酶  ---  Genesis Technology International-α-淀粉酶
         Genesis Technology International-纤维素酶
细胞---  Genesis Technologies International
         20×NF(孢子悬浮液)
         BEC 106V液体(来自干的106V)
用包含20％的α-淀粉酶∶20×NF∶等价于106V的106V液体∶液体纤维素酶的30∶30∶30∶15的混合物的Dow Acrylic涂料刷涂76.2微米(3密耳)的湿厚，由此涂布所述纤维玻璃棒。将2-5层湿膜厚度为76.2微米(3密耳)的连续刷涂涂层施加到4个纤维玻璃棒上，在各次施涂之间的干燥时间为30分钟。然后，在各次涂布之后，使用作为基底的玉米淀粉悬浮液(2TBL/100ML水)，测试所述棒，评价其水解活性。在沸腾过的淀粉悬浮液中浸没之后测量水解活性，并以粘度表示。通过将标准重量加到加热的淀粉悬浮液表面上来测量所述粘度，并表示为从淀粉悬浮液表面移动通过所测距离所需时间的倒数。所述接种的涂层的活性随各连续层增大。在第四层之后，所述加热的淀粉悬浮液的粘度并没有显示降低，这是因为它接近水的粘度。所述动力学提示，当所述酶用其基底(淀粉)饱和时水解反应的速度增大，当基底变得有限时，活性较差。而且，所得生物薄膜基本上在两个方向上扩展(在此，如果使熟化的时间在第三方向上)，由此增大表面积，人们可以进一步预计第4层上的层铺效果。
表7
  涂层数   水解活性
  0   0
  2   0.14
  3   0.49
  4   1.9
  5   1.9
实施例8
所用的材料
涂料---  U.S.油漆
         底涂层-Primer Hull-Guard WB
         面涂层防污基料
         METS添加剂
酶  ---  Genesis International
         α-淀粉酶
         纤维素酶
细胞---  Genesis Technologies International
         20×NF(孢子浓缩物)
         BEC 106(吸收到碳酸钙上的细胞)
         BEC 110(吸收到碳酸钙上的细胞)
纤维玻璃棒用U.S.Hull Guard底漆刷涂，湿膜厚度为76.2微米(3密耳)。用未改性的底漆涂布两组棒。用加有5％无菌水的底漆施涂另外两组棒。用包含5％无菌水并用NaCl饱和的底漆涂布最后一组棒。所有底漆涂层的湿膜厚度为76.2微米(3密耳)。接着使用U.S.Paints防污基料(无生物杀灭剂和海藻杀灭剂)罩面刷涂两组棒，湿厚为76.2微米(3密耳)。选择用于这种处理的两组包括仅上底漆的一组和上了加有5％无菌水的底漆的另一组。剩余的三组棒用U.S.防污基料罩面涂布，所述基料加有20％MET’s制剂。在这种情况下，所述20％由35％的α-淀粉酶、35％20xNF、5％106V、5％110和20％纤维素酶组成。所有底漆和面涂层均进行空气干燥。所述刷涂的湿膜厚度为76.2微米(3密耳)。我们的观察清楚揭示了底漆涂层单独增加水时没有差异，但是在底漆涂层中增加NaCl(氯化钠)的这些棒中正向增大2.5倍。
表8
  底涂层   面涂层   水解％
  1HGWB   USAF基料   0
  2HGWB   USAF基料+20％“MET’S”   20
  3HGWB+5％H2O   USAF基料+20％“MET’S”   20
  4HGWB+5％H2O，用NaCl饱和   USAF基料+20％“MET’S”   50
  5HGWB+50％H2O   USAF基料   0
实施例9
所用的材料
涂料---  Akzo Nobel丙烯酸树脂17-1267
         Akzo Nobel Resins
         4730 Crittenden Drive Louisville，KY 40209
酶  ---  Genesis Technologies International
         696 Winer Industrial Way Lawrenceville，GA 30045-7600
         α-淀粉酶
用Akzo Nobel丙烯酸树脂刷涂两组纤维玻璃棒，其湿厚为76.2微米(3密耳)。所述丙烯酸树脂具有10重量％的α-淀粉酶添加剂。一组棒上施涂两涂层树脂，另一组的棒上施涂四涂层树脂。在空气干燥之后，测定所述棒，量化其水解活性。表9中的结果清楚证实当和双层涂层比较时，四层涂层的水解活性水平大两倍以上。多层层铺是提高活性且不增大生物技术材料浓度的有效方法。当涂料配方的固体含量对施涂前、施涂过程中以及施涂之后的涂层性能影响很强时，这一点极其重要。
表9
  涂层数   水解％
  2×   30
  4×   90
实施例10
所用的材料
涂料---    Akzo Nobel丙烯酸树脂17-1267
           Akzo Nobel Resins
           4730 Crittenden Drive Louisville，KY 40209
酶  ---    α-淀粉酶
           Genesis Technologies International
           696 Winer Industrial Way Lawrenceville，GA 30045-7600
细胞-106V  (吸收在碳酸钙上的营养细胞)
           20×CW(悬浮液中的孢子)
           Genesis Technologies International
           696 Winer Industrial Way Lawrenceville，GA 30045-7600
将木质压舌板刷涂至湿膜厚度76.2微米(3密耳)。所述底涂层和两组具有10重量％α-淀粉酶添加剂，第三组没有任何添加剂。所有组均空气干燥过夜。刷涂丙烯酸树脂的面涂层至湿膜厚度76.2微米(3密耳)。底涂层中具有添加剂的一组仅涂布树脂面涂层。底涂层中具有添加剂的第二且用20重量％添加剂涂布面涂层。所述添加剂的一半是106V，另一半是20xCW。在底涂层中没有添加剂的第三组也施涂具有20％添加剂的面层。而且，所述添加剂的一半是106V，另一半是20xCW。在将压舌板空气干燥之后，测定量化它们的淀粉分解活性。通过将刮刀浸没在加热的淀粉悬浮液中，并通过粘度计观察粘度降低时悬浮液中的淀粉损失测量值来完成。
表10
  水解％
  面涂层   AN-17-1267   30
  底涂层   AN-17-1267+10％α-淀粉酶
  水解％
  面涂层   AN-17-1267+10％106V+10％20×CW   69
  底涂层   AN-17-1267+10％α-淀粉酶
  水解％
  面涂层   AN-17-1267+10％106V+10％20×CW   49
  底涂层   AN-17-1267
实施例11
所用的材料
涂料---  α-淀粉酶
         Genesis Technologies International
         696 Winer Industrial Way Lawrenceville，GA 30045-7600
细胞---  106V(吸收在碳酸钙上的营养细胞)
         20×CW(悬浮液中的孢子)
         Genesis Technologies International
         Lawrenceville，GA 30045-7600
通过将多层MET’s直接施加到表面上而未利用粘结剂的防污活性
浸没和排干α-淀粉酶和20xCW(Genesis液体冷水孢子悬浮液)的50∶50混合物来施涂纤维玻璃棒。所述棒在120-140的温度下的烘箱中干燥30分钟。取出所述棒，将一根棒(单一涂层)放在旁边，如上所述再涂布其它四根棒并加热。重复这一方法，在各次加热循环之后取出一根棒，直至制得5根棒。在各加热循环中，使用没有加入MET’s的第6根棒作为对照物。在制得的所有5根涂布的棒中，各自比其前一根棒多一层MET’s(1-5涂层)。然后使用包含2大汤匙淀粉/100ml水的淀粉悬浮液测定所述棒的淀粉分解活性。当涂层数增多时，在刚沸的水中加热所述涂布的棒2分钟，可以产生水解更多的淀粉混合物。在没有MET’s时不存在水解，单层MET’s涂层也基本上不存在水解。通过将水解混合物的液滴加到垂直放置的板上来确定所述粘度，并表示为在给定时间内移动的速率。除了层铺过程中随各连续增加所观察到的增大以外，看来，似乎即使在加热时所述涂层也不容易再受水性淀粉悬浮液影响，所述无粘结剂的制剂很稳定，并抵抗因熔化淀粉悬浮所需温度而引起的降解。
表11
在没有粘结剂时细胞和酶悬浮液使水解活性增大
  层   水解％*
  1   12
  2   36
  3   50
  4   71
  5   82
*熔化玉米淀粉在水中的30％悬浮液
所述层铺的概念也同样适用于设计具有特定功能(和营养材料大致相同)的涂层。例如，可以接种阻隔层或粘结底漆的涂层，然后用设计用于美观或所需操作性能的涂料进行罩面涂布。本发明可以除去大量接种物扰，且仍旧能获得较高浓度所产生的相同效果。
本发明的实施方式能设计具有能更好耐受苛刻环境的物理性质的材料，且无需主要关注涂料提供防腐蚀、腐烂、防海藻和真菌，尤其是非可估算面积中霉菌的能力。当配制的涂料长期提供上述保护时，我们所指的限制是空间和环境因素的限制。就是如下这些要素：降低涂料中重金属含量，且仍可以提高涂料性能，这在住房建筑工业和商业建筑中常常遇到困难。本发明具体有如下的性质：可以更容易涂布，提供有效防止有害微生物影响有关的损毁和恶化的性能。
实施例12
确认涂层分层的好处
Akzo Nobel Resin
2904 Missouri Avenue East St.Louis，IL 62205
产品：丙烯酸树脂Setalux 17-1267
Genesis α-淀粉酶
Genesis Technologies International
696Winer Industrial Way Lawrenceville，GA 30045-7600
Genesis细胞和孢子-Blend 20×NF CW
通过层铺相互作用的微生物酶细胞和孢子来优化淀粉分解的活性
制备纤维玻璃棒来接受丙烯酸树脂涂料。所述棒的表面用60粒度的砂纸打磨，并用溶剂丙酮擦拭，制得用于涂布的表面。所述涂料用刷子施涂，湿厚约为152.4微米(6密耳)，得到的干涂层厚度为76.2微米(3密耳)。在施涂第二涂层或面涂层(76.2微米(3密耳)干厚)之前约18小时，所述涂布的棒空气干燥过夜。再将面涂层空气干燥过夜。所述棒的表面的活性通过制备淀粉溶液来评价，我们通过粘度计将其粘度作为基线。将所制得的棒浸没在单独的溶液中30分钟。在时间期满后，取出所述棒，再次测量溶液的粘度。然后，将粘度换算成水解％，记录在表12中。
微生物酶和细胞在支持其活性和生长中是相互作用的。除了一组分相对另一组分的相对浓度以外，也会影响相互作用。但是，很难预测什么比率是最佳的，尤其是在不一致的环境中。酶与细胞和孢子的混合物的层铺层是相互作用的。酶会从固化涂层的一层迁移到另一层中，这种迁移会在第二最上层中形成梯度。具有该梯度的相互作用有时会使细胞表达的活性最佳。这在防污涂层中是有显著优势的，在此，淀粉分解活性会提供更高的保护。
表12
  水解％
  面涂层   AN-17-1267   67
  底涂层   AN-17-1267+10％α-淀粉酶
 水解％*
  面涂层   AN-17-1267+10％106V+10％20×NF CW  100
  底涂层   AN-17-1267+10％α-淀粉酶
  水解％
  面涂层   AN-17-1267+10％106V+10％20×NF CW   0
  底涂层   AN-17-1267
虽然已经结合某些实施方式说明了本发明，这样能更全面地理解和了解其各方面，但是并不能将本发明限于这些具体的实施方式。相反，所附权利要求书所限定的本发明范围包括所有的替换方式、修改和等价方式。

Claims (30)

1.一种制件，其至少部分表面上具有涂层，所述涂层包括至少两层，其中，第一层包含至少一种微生物，它产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶；第二层不同于所述第一层，它包含至少一种成分，所述成分选自产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶的微生物、淀粉分解酶或蛋白质水解酶以及用于第一层的所述微生物的营养物。
2.权利要求1所述的制件，其特征在于，所述第二层包含至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶。
3.权利要求2所述的制件，其特征在于，所述第二层中的酶不同于微生物产生的酶。
4.权利要求2所述的制件，其特征在于，所述第二层中的酶和微生物产生的酶相同。
5.权利要求1所述的制件，其特征在于，所述第二层包含产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶的微生物。
6.权利要求5所述的制件，其特征在于，所述第二层不包含粘结剂。
7.权利要求5所述的制件，其特征在于，第一和第二层中的微生物相同。
8.权利要求7所述的制件，其特征在于，所述微生物产生至少一种延缓表面上有害物生长的酶。
9.权利要求1所述的制件，其特征在于，第二层包含至少一种用于第一层的所述微生物的营养物。
10.权利要求9所述的制件，其特征在于，基本上所有用于微生物的营养物在所述第二层中。
11.权利要求1所述的制件，其特征在于，所述第二层在制件的表面和所述第一层之间。
12.权利要求1所述的制件，其特征在于，所述第一层还包含至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶。
13.权利要求1所述的制件，其特征在于，至少一层包含无机盐。
14.权利要求1所述的制件，其特征在于，至少一层包含表面活性剂。
15.权利要求1所述的制件，其特征在于，至少一层包含丙烯酸粘结剂。
16.权利要求1所述的制件，其特征在于，它具有船舶表面。
17.权利要求1所述的制件，其特征在于，至少一层包含吸收到碳酸钙、粘土、滑石或硬脂酸铝上的营养细胞。
18.权利要求1所述的制件，其特征在于，至少一层包含吸收到碳酸钙、粘土、滑石或硬脂酸铝上的酶。
19.权利要求1所述的制件，其特征在于，所述制件在海洋环境、血液系统或暴露在空气中。
20.一种制件，其至少部分表面上具有涂层，所述涂层包括至少两层，其中，第一层包含至少一种微生物，它产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶；第二层包含用于所述微生物的营养物。
21.权利要求20所述的制件，其特征在于，至少一层包含至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶。
22.权利要求20所述的制件，其特征在于，至少一层包含粘结剂。
23.权利要求20所述的制件，其特征在于，所述粘结剂是丙烯酸粘结剂。
24.权利要求20所述的制件，其特征在于，所述第二层在所述制件和所述第一层之间。
25.权利要求20所述的制件，所述制件具有第三层，其中，第一层和第二层在制件表面和第三层之间。
26.一种减少表面上生物体生长的方法，所述方法包括：将具有至少两层的涂层施涂到至少部分表面上，其中，第一层包含至少一种微生物，它产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶；并施涂不同于所述第一层的第二层，所述第二层包含至少一种成分，所述成分选自产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶的微生物、淀粉分解酶或蛋白质水解酶以及用于第一层的所述微生物的营养物。
27.权利要求26所述的方法，其特征在于，至少一层包含粘结剂。
28.一种保护表面的方法，所述方法包括用第一组合物涂布所述表面，在所述表面上形成第一层，所述第一组合物包含至少一种用于至少一种微生物的营养物，所述微生物产生至少一种淀粉分解酶或蛋白质水解酶；并用第二组合物涂布第一层，所述第二组合物包含所述至少一种微生物。
29.权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一或第二组合物中至少一种包含粘结剂。
30.权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一和第二组合物均包含粘结剂。
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