CN1269954C - 一种促进甲烷氧化菌生长的方法 - Google Patents
一种促进甲烷氧化菌生长的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1269954C CN1269954C CN 200410077987 CN200410077987A CN1269954C CN 1269954 C CN1269954 C CN 1269954C CN 200410077987 CN200410077987 CN 200410077987 CN 200410077987 A CN200410077987 A CN 200410077987A CN 1269954 C CN1269954 C CN 1269954C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methane
- oxidizing bacteria
- acid
- growth
- methane oxidizing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 98
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 47
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title abstract 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 claims abstract description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N D-threo-isocitric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N 0.000 claims description 5
- ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N Isocitric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N 0.000 claims description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N threo-D-isocitric acid Natural products OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000589351 Methylosinus trichosporium Species 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 93
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 5
- -1 C20 alkane compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000006735 epoxidation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 241000322541 Methylosinus trichosporium OB3b Species 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108010009977 methane monooxygenase Proteins 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010048916 alcohol dehydrogenase (acceptor) Proteins 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 5
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 241001003008 Methylococcus capsulatus str. Bath Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010748 Photoabsorption Effects 0.000 description 1
- 240000005049 Prunus salicina Species 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001722 carbon compounds Chemical class 0.000 description 1
- JYYOBHFYCIDXHH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;hydrate Chemical compound O.OC(O)=O JYYOBHFYCIDXHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012826 global research Methods 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 235000009018 li Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000007269 microbial metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种促进甲烷氧化菌生长的方法，涉及微生物发酵领域。本发明所提供的促进甲烷氧化菌生长的方法，是在培养基中培养甲烷氧化菌，其中，所述培养基中添加有浓度为5-400mmol/L的三羧酸循环中的有机酸。本发明采用向培养基中添加三羧酸循环中有机酸的方式，巧妙地通过对甲烷氧化菌生长代谢流的调控，强化其三羧酸循环过程，促进甲烷氧化菌的生长代谢，从而提高细胞的比生长速率和培养液中细胞密度，细胞密度一般可以达到相同条件下不加有机酸的3～4倍。本发明方法简单，适于进行甲烷氧化菌大规模高密度培养，能达到甲烷生物转化制甲醇的要求，也可用于催化C1～C20烷烃化合物羟基化和C2～C10烯烃化合物的环氧化，具有广阔的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养方法，特别是涉及一种促进甲烷氧化菌生长的方法。
背景技术
随着石油资源的日趋短缺，储量丰富的天然气的开发利用越来越受到人们的重视。甲烷是天然气的主要组分，也可以再生资源为原料通过发酵获得廉价的甲烷，甲烷的资源化利用技术的研发具有重要的工业应用价值。甲醇是天然气主要的化工产品之一，它既是一种清洁的能源，又是重要的基础化工原料，将气态的甲烷转化成液态的甲醇，不仅可以降低输送成本，而且通过甲醇可以实现甲烷的更广泛应用。
传统的两步法甲烷转化制备甲醇，设备投资高、工艺复杂、能耗大、单程转化率低，将甲烷直接转化生成甲醇则是最理想的方式，一直受到国际上的关注。但甲烷分子结构稳定，C-H键能很高，活化甲烷需要较高的温度，在高温下甲醇又极易深度氧化，很难找到一种化学催化剂既能高效转化甲烷，又具有高的甲醇选择性。如果能在温和条件下将甲烷直接转化为含氧化合物，特别是甲醇，就可大大提高甲烷作为原材料的利用率。因此，找寻适宜的转化方法已成为多年来学术界、工业上以及各政府部门全面展开的全球性研究课题。
自然界中分布广泛的甲烷氧化菌以甲烷作为唯一的生长碳源和能源，到目前为止，还没有发现甲烷氧化菌能利用多碳化合物作为碳源。甲烷氧化菌利用甲烷的第一步是在甲烷单加氧酶(Methane monooxgenase，MMO)的作用下将甲烷直接转化为甲醇，再在其它酶的作用下氧化甲醇为甲醛，甲酸及二氧化碳和水，其代谢途径如图1所示。甲烷单加氧酶是生物体系中唯一能够在常温常压下选择性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有转化效率高，选择性好的优点，并且能在常温常压下进行，具有广阔的应用前景。因此，生物催化甲烷制甲醇是实现天然气生产甲醇的一种理想的工业化生产方式。
甲烷单加氧酶是甲烷氧化菌利用甲烷的关键酶，能够利用空气作为氧化剂将甲烷直接氧化为甲醇。MMO不仅可以催化甲烷部分氧化合成甲醇，也可以催化C1～C20烷烃化合物羟基化和C2～C10烯烃化合物的环氧化。生物催化甲烷制甲醇可以采用纯酶MMO或用含酶细胞两种形式进行催化。由于甲烷单加氧酶氧化甲烷成甲醇的过程需要NADH，其价格昂贵，体外再生技术不成熟，并且，MMO酶的纯化过程复杂，纯酶稳定性极差，而利用含酶细胞催化反应可以避免纯酶MMO体系稳定性差的缺点，并且容易实现辅因子NADH在胞内的再生循环。在甲烷氧化菌中，MMO以两种形式存在，一种是以可溶性形式存在于细胞质中，称为可溶性甲烷单加氧酶(Solublemethane monooxgenase，sMMO)；另一种是以颗粒形式存在于细胞膜上，称为颗粒性甲烷单加氧酶(Particle methane monooxygenase，pMMO)。其中，在所有的甲烷氧化菌中都存在pMMO基因，少数菌如Methylosinus trichosporium OB3b，Methylococcuscapsulatus Bath等中pMMO和sMMO基因都存在。铜离子浓度是调控pMMO和sMMO基因的表达的开关，高铜离子浓度条件下，pMMO基因表达；低铜离子浓度下sMMO基因表达。
甲烷氧化菌氧化甲烷合成甲醇是一个非常复杂的微生物代谢过程，而且生成的甲醇会被甲烷氧化菌中的甲醇脱氢酶(Methanol dehydrogenase，MDH)进一步氧化为甲醛，再在其它酶系的作用下最终转化为CO2和H2O。研究表明，EDTA、环丙醇、高浓度磷酸盐等能抑制甲醇脱氢酶的活性，甲酸钠可作为外源电子给体，又可作为产物反馈抑制甲醇的继续氧化，通过以上物质的添加可以实现甲醇的胞外积累。
在甲烷氧化菌的生长繁殖过程中，一方面由于生成的甲醇会被甲醇脱氢酶进一步氧化为甲醛，而且高浓度的甲醇会对细胞的生长产生抑制作用；另一方面，如果在细胞生长过程中加入环丙醇或高浓度的磷酸盐抑制甲醇脱氢酶活性，合成细胞物质包括甲烷单加氧酶的途径被阻断，酶量有限，不能得到大量的甲醇。因此，甲烷生物转化制甲醇一般需要两步进行：首先进行甲烷氧化菌的高密度培养，然后在培养液中加入环丙醇或高浓度的磷酸盐抑制甲醇脱氢酶的活性，使甲烷氧化成的甲醇得到最大限度的积累，从而实现甲烷的生物转化生产甲醇。
甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低是限制甲烷氧化菌工业化使用的主要因素，实现甲烷氧化菌的大规模高效培养技术是甲烷生物催化制甲醇的前提，其重要性在于：1)可以采用整细胞快速进行甲烷、烷烃及烯烃的部分氧化生产醇和环氧化物；2)利用天然气快速生产单细胞蛋白；3)生产高表达MMO用于结构与功能的研究(ParkS.，Shah N.N.，Taylor R.T.，and Droege M.W.，Biotechnol.Bioeng.1992，40：151-157)。
研究表明，增加铁离子、减少铜离子和改变培养气体(甲烷/空气)的比例能促进甲烷氧化菌的比生长速率；添加维生素类外源生长因子可较大地提高MMO酶活性和sMMO的生成量。其中，Shah等采用间歇式和连续式的细胞培养方式在5L普通发酵罐中对II型甲烷氧化菌(M.trichosporium OB3b)进行细胞培养生产sMMO或pMMO，对生长温度、pH，及磷酸盐、硝酸盐和亚铁离子浓度等培养成分条件进行了优化，最大细胞浓度可以达到18g干细胞/L发酵液，最大比生长速率为0.08h-1(Park S.，HannaM.L.，Taylor R.T.，Droege M.L.，Biotechnol.Bioeng.，1991，38：423-433；Shah N.N.，Hanna M.L.，Taylor R.T.，Biotechnol.Bioeng.，1996，49：161-171)。尉迟力等(尉迟力，沈润南，夏春谷，李树本，外源生长因子对甲烷单加氧酶活性和稳定性的影响，分子催化，1997，11(2)：89-93)研究了添加维生素B12等不同外源生长因子后，甲烷氧化细菌M.trichosporium 3011的MMO活性和稳定性的变化，以及sMMO生成量的影响。另外，Park等研究表明，在气相中加入少量的二氧化碳(CO2)或在液相中加入碳酸氢钠(NaHCO3)可以缩短甲烷氧化菌M.trichosporium OB3b的生长迟滞期，提高细胞浓度(Park S.，Hanna M.L.，Taylor R.T.，Droege M.L.，Batch cultivation ofMethylosinus trichosporium OB3b.I：Production of soluble methane monooxygenase.Biotechnol.Bioeng.，1991，38：423-433)。这些方法虽然在一定程度上能提高细胞生长的比生长速率和培养液中的细胞浓度，但是细胞浓度仍然较低，一般在10g细胞/L发酵液以下。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进甲烷氧化菌生长的方法。
本发明所提供的促进甲烷氧化菌生长的方法，是在培养基中培养甲烷氧化菌，其中，所述培养基中添加有浓度为5-400mmol/L的三羧酸循环中的有机酸。
所述三羧酸循环中的有机酸通常为，如苹果酸、柠檬酸、丁二酸、顺丁烯二酸、草酰乙酸、丙酮酸或异柠檬酸等中的一种或几种。
有机酸在培养基中的浓度优选为10-130mmol/L。
有机酸可以先直接加入到培养基中然后培养细胞，也可以在甲烷氧化菌的培养过程中添加到培养液中，其添加方式有一次添加到初始培养基、补料分批添加或连续添加等。
所述甲烷氧化菌以II型甲烷氧化菌为佳，如甲烷氧化菌(Methylosinustrichosporium)OB3b等。
应用本发明培养甲烷氧化菌可以采用分批培养、补料分批培养或连续培养等方式，均可以提高培养液中甲烷氧化菌的细胞密度。
本发明采用向培养基中添加三羧酸循环中有机酸的方式，巧妙地通过对甲烷氧化菌生长代谢流的调控，强化其三羧酸循环过程，促进甲烷氧化菌的生长代谢，从而提高细胞的比生长速率和培养液中细胞密度，细胞密度一般可以达到相同条件下不加有机酸的3～4倍。本发明方法简单，适于进行甲烷氧化菌大规模高密度培养，能达到甲烷生物转化制甲醇的要求，具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为甲烷氧化菌的甲烷代谢图；
图2为不同有机酸的加入对M.trichosporium OB3b细胞浓度的影响；
图3为柠檬酸和苹果酸的添加对M.trichosporium OB3b生长的影响；
图4为柠檬酸添加时间对M.trichosporium OB3b生长的影响。
具体实施方式
本发明进行甲烷氧化菌细胞培养所用培养基为NMS培养基，其组成如下(g/L)：
KH2PO4 0.58；Na2HPO4·12H2O 2.17；NaNO3 0.85；K2SO4 0.17；MgSO4·7H2O 0.037；FeSO4·7H2O 0.012；微量元素溶液2ml，pH7.0。
微量元素溶液组成如下(mg/L)：
ZnSO4·7H2O 0.287；MnSO4·7H2O 0.223；H3BO3 0.062；Na2MoO4·2H2O 0.048；CoCl2·6H2O 0.048；KI 0.083；CaCl2·2H2O 3.5，pH7.0。
实施例1、在初始培养基中添加有机酸对M.trichosporium OB3b细胞浓度的影响
在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入浓度为130mmol/L的顺丁烯二酸，丁二酸，柠檬酸和苹果酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。以相同条件下不加有机酸培养作为对照。接种4d后测定细胞浓度，细胞浓度以660nm波长下的光吸收表示(OD660)，结果如图1所示。结果表明，加入顺丁烯二酸，琥珀酸，柠檬酸和苹果酸对于M.trichosporium OB3b的细胞生长具有明显的促进作用，其中以添加柠檬酸效果最好，其OD660为0.523，是对照(OD660为0.207)的2.5倍。
实施例2、在初始培养基中添加柠檬酸和苹果酸对M.trichosporium OB3b生长的影响
在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入130mmol/L柠檬酸和0.13mol/L苹果酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。以相同条件下不加有机酸培养作为对照。测定细胞浓度随时间的变化曲线，结果如图2所示。结果表明，培养基中添加柠檬酸和苹果酸可以显著促进M.trichosporium OB3b的细胞生长，当添加柠檬酸时，最大比生长速率和细胞浓度(OD660)分别为0.24h-1和0.698，为对照的3倍。
实施例3、在初始培养基中添加不同浓度柠檬酸对M.trichosporium OB3b生长的影响
在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入0、5和400mmol/L柠檬酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。培养5天后测定细胞浓度，其OD660分别为0.207、0.567和0.54，结果表明，柠檬酸浓度在5-400mmol/L均可以促进甲烷氧化菌的生长。
实施例4、在不同对数生长期添加柠檬酸对M.trichosporium OB3b生长的影响
在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。在不同对数生长期向培养液中加入柠檬酸(30mmol/L)，考察柠檬酸的加入时间对M.trichosporium OB3b生长的影响。以不加柠檬酸作为对照。测定细胞浓度，结果如图3所示。结果表明，在对数生长期添加柠檬酸对该菌生长的促进作用均优于在初始培养基中添加。
实施例5、添加草酰乙酸和异柠檬酸对M.trichosporium OB3b的影响
在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入浓度为133mmol/L的草酰乙酸和异柠檬酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。以相同条件下不加有机酸培养作为对照。接种4d后测定细胞浓度，OD660值分别为0.365和0.420，对照OD660值为0.207，结果表明，草酰乙酸和异柠檬酸的添加能促进该菌的生长。
Claims (6)
1、一种促进甲烷氧化菌生长的方法，是在培养基中培养甲烷氧化菌，其特征在于：所述培养基中添加有浓度为5-400mmol/L的三羧酸循环中的有机酸。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机酸为苹果酸、柠檬酸、丁二酸、顺丁烯二酸、草酰乙酸或异柠檬酸中的一种或几种。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机酸在所述培养基中浓度为10-130mmol/L。
4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机酸的添加方式为一次添加到初始培养基、补料分批添加或连续添加。
5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述甲烷氧化菌为II型甲烷氧化菌。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述II型甲烷氧化菌为甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410077987 CN1269954C (zh) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | 一种促进甲烷氧化菌生长的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410077987 CN1269954C (zh) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | 一种促进甲烷氧化菌生长的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1587382A CN1587382A (zh) | 2005-03-02 |
| CN1269954C true CN1269954C (zh) | 2006-08-16 |
Family
ID=34604938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200410077987 Expired - Fee Related CN1269954C (zh) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | 一种促进甲烷氧化菌生长的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1269954C (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1329506C (zh) * | 2005-09-06 | 2007-08-01 | 清华大学 | 一种具有颗粒状甲烷单加氧酶活性的重组菌及其应用 |
| CN100392072C (zh) * | 2005-12-30 | 2008-06-04 | 清华大学 | 甲烷氧化菌的培养方法 |
| CN102154441B (zh) * | 2011-02-24 | 2012-12-26 | 广州安能特化学科技有限公司 | 一种甲烷氧化菌的定量检测方法 |
| CN105219672A (zh) * | 2015-09-24 | 2016-01-06 | 曹晨 | 一种大规模制备甲烷氧化菌的方法 |
| CN106554927A (zh) * | 2015-09-28 | 2017-04-05 | 曹晨 | 一种制备甲烷氧化菌的方法 |
| CN106554975A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-04-05 | 沈阳化工大学 | 一种甲烷连续生物降解的工艺方法 |
| CN114045235B (zh) * | 2021-11-04 | 2022-11-08 | 西安交通大学 | 一种利用嗜甲烷菌生产单细胞蛋白和可发酵糖的方法 |
-
2004
- 2004-09-22 CN CN 200410077987 patent/CN1269954C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1587382A (zh) | 2005-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kawaguchi et al. | H2 production from algal biomass by a mixed culture of Rhodobium marinum A-501 and Lactobacillus amylovorus | |
| Ghose et al. | Rapid ethanol fermentation of cellulose hydrolysate. II. Product and substrate inhibition and optimization of fermentor design | |
| Lee et al. | Fermentative production of succinic acid from glucose and corn steep liquor by Anaerobiospirillum succiniciproducens | |
| Dong et al. | In situ carbon dioxide fixation in the process of natural astaxanthin production by a mixed culture of Haematococcus pluvialis and Phaffia rhodozyma | |
| CN106520580B (zh) | 一株酵母菌及其在催化2,5-二羟甲基呋喃合成中的应用 | |
| CN104357496A (zh) | 一种通过微生物催化乳酸合成己酸的方法 | |
| JP2002525070A (ja) | α，ω−アルカンジカルボン酸を製造するための発酵培地および方法 | |
| CN1269954C (zh) | 一种促进甲烷氧化菌生长的方法 | |
| CN103627740B (zh) | 一种微生物细胞转化法生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法 | |
| CN102199632B (zh) | 一种转化dl-乳酸制备丙酮酸的方法 | |
| CN116333948B (zh) | 一种食气梭菌增菌培养基及其制备方法 | |
| CN101440382A (zh) | 一种生物防腐剂4-羟基苯乳酸的制备方法 | |
| CN102586343A (zh) | 一种从l-丙氨酸制备丙酮酸的生物催化方法 | |
| CN1952164A (zh) | 组合发酵生产d－乳酸工艺 | |
| CN101497871B (zh) | 乙醇发酵厌氧高温菌培养基,其制备方法和其应用 | |
| CN101054597A (zh) | 一种微生物转化生产胱氨酸的方法 | |
| CN109988784B (zh) | 一种固定化甘醇酸氧化酶催化合成丙酮酸的方法 | |
| CN102199651A (zh) | 一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法 | |
| KR102550049B1 (ko) | 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법 | |
| CN113699081B (zh) | 一株发酵生产(2r,3r)-丁二醇和乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114540404B (zh) | 一种乙醇发酵过程中二氧化碳原位固定的方法 | |
| CN107723314B (zh) | 一种提高天然混合菌源nadh途径产氢量的方法 | |
| CN118389393B (zh) | 一种利用甲烷转化乙醇的工程菌株及其构建方法、用途 | |
| JP2000166584A (ja) | アルカノール製造リアクター | |
| CN107937327B (zh) | 一种菌藻复合制剂及其在制备氢气中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060816 Termination date: 20110922 |