CN1269954C - 一种促进甲烷氧化菌生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进甲烷氧化菌生长的方法，涉及微生物发酵领域。本发明所提供的促进甲烷氧化菌生长的方法，是在培养基中培养甲烷氧化菌，其中，所述培养基中添加有浓度为5-400mmol/L的三羧酸循环中的有机酸。本发明采用向培养基中添加三羧酸循环中有机酸的方式，巧妙地通过对甲烷氧化菌生长代谢流的调控，强化其三羧酸循环过程，促进甲烷氧化菌的生长代谢，从而提高细胞的比生长速率和培养液中细胞密度，细胞密度一般可以达到相同条件下不加有机酸的3～4倍。本发明方法简单，适于进行甲烷氧化菌大规模高密度培养，能达到甲烷生物转化制甲醇的要求，也可用于催化C₁～C₂₀烷烃化合物羟基化和C₂～C₁₀烯烃化合物的环氧化，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种促进甲烷氧化菌生长的方法

技术领域

本发明涉及微生物培养方法，特别是涉及一种促进甲烷氧化菌生长的方法。

背景技术

随着石油资源的日趋短缺，储量丰富的天然气的开发利用越来越受到人们的重视。甲烷是天然气的主要组分，也可以再生资源为原料通过发酵获得廉价的甲烷，甲烷的资源化利用技术的研发具有重要的工业应用价值。甲醇是天然气主要的化工产品之一，它既是一种清洁的能源，又是重要的基础化工原料，将气态的甲烷转化成液态的甲醇，不仅可以降低输送成本，而且通过甲醇可以实现甲烷的更广泛应用。

传统的两步法甲烷转化制备甲醇，设备投资高、工艺复杂、能耗大、单程转化率低，将甲烷直接转化生成甲醇则是最理想的方式，一直受到国际上的关注。但甲烷分子结构稳定，C-H键能很高，活化甲烷需要较高的温度，在高温下甲醇又极易深度氧化，很难找到一种化学催化剂既能高效转化甲烷，又具有高的甲醇选择性。如果能在温和条件下将甲烷直接转化为含氧化合物，特别是甲醇，就可大大提高甲烷作为原材料的利用率。因此，找寻适宜的转化方法已成为多年来学术界、工业上以及各政府部门全面展开的全球性研究课题。

自然界中分布广泛的甲烷氧化菌以甲烷作为唯一的生长碳源和能源，到目前为止，还没有发现甲烷氧化菌能利用多碳化合物作为碳源。甲烷氧化菌利用甲烷的第一步是在甲烷单加氧酶(Methane monooxgenase，MMO)的作用下将甲烷直接转化为甲醇，再在其它酶的作用下氧化甲醇为甲醛，甲酸及二氧化碳和水，其代谢途径如图1所示。甲烷单加氧酶是生物体系中唯一能够在常温常压下选择性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有转化效率高，选择性好的优点，并且能在常温常压下进行，具有广阔的应用前景。因此，生物催化甲烷制甲醇是实现天然气生产甲醇的一种理想的工业化生产方式。

甲烷单加氧酶是甲烷氧化菌利用甲烷的关键酶，能够利用空气作为氧化剂将甲烷直接氧化为甲醇。MMO不仅可以催化甲烷部分氧化合成甲醇，也可以催化C1～C20烷烃化合物羟基化和C2～C10烯烃化合物的环氧化。生物催化甲烷制甲醇可以采用纯酶MMO或用含酶细胞两种形式进行催化。由于甲烷单加氧酶氧化甲烷成甲醇的过程需要NADH，其价格昂贵，体外再生技术不成熟，并且，MMO酶的纯化过程复杂，纯酶稳定性极差，而利用含酶细胞催化反应可以避免纯酶MMO体系稳定性差的缺点，并且容易实现辅因子NADH在胞内的再生循环。在甲烷氧化菌中，MMO以两种形式存在，一种是以可溶性形式存在于细胞质中，称为可溶性甲烷单加氧酶(Solublemethane monooxgenase，sMMO)；另一种是以颗粒形式存在于细胞膜上，称为颗粒性甲烷单加氧酶(Particle methane monooxygenase，pMMO)。其中，在所有的甲烷氧化菌中都存在pMMO基因，少数菌如Methylosinus trichosporium OB3b，Methylococcuscapsulatus Bath等中pMMO和sMMO基因都存在。铜离子浓度是调控pMMO和sMMO基因的表达的开关，高铜离子浓度条件下，pMMO基因表达；低铜离子浓度下sMMO基因表达。

甲烷氧化菌氧化甲烷合成甲醇是一个非常复杂的微生物代谢过程，而且生成的甲醇会被甲烷氧化菌中的甲醇脱氢酶(Methanol dehydrogenase，MDH)进一步氧化为甲醛，再在其它酶系的作用下最终转化为CO₂和H₂O。研究表明，EDTA、环丙醇、高浓度磷酸盐等能抑制甲醇脱氢酶的活性，甲酸钠可作为外源电子给体，又可作为产物反馈抑制甲醇的继续氧化，通过以上物质的添加可以实现甲醇的胞外积累。

在甲烷氧化菌的生长繁殖过程中，一方面由于生成的甲醇会被甲醇脱氢酶进一步氧化为甲醛，而且高浓度的甲醇会对细胞的生长产生抑制作用；另一方面，如果在细胞生长过程中加入环丙醇或高浓度的磷酸盐抑制甲醇脱氢酶活性，合成细胞物质包括甲烷单加氧酶的途径被阻断，酶量有限，不能得到大量的甲醇。因此，甲烷生物转化制甲醇一般需要两步进行：首先进行甲烷氧化菌的高密度培养，然后在培养液中加入环丙醇或高浓度的磷酸盐抑制甲醇脱氢酶的活性，使甲烷氧化成的甲醇得到最大限度的积累，从而实现甲烷的生物转化生产甲醇。

甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低是限制甲烷氧化菌工业化使用的主要因素，实现甲烷氧化菌的大规模高效培养技术是甲烷生物催化制甲醇的前提，其重要性在于：1)可以采用整细胞快速进行甲烷、烷烃及烯烃的部分氧化生产醇和环氧化物；2)利用天然气快速生产单细胞蛋白；3)生产高表达MMO用于结构与功能的研究(ParkS.，Shah N.N.，Taylor R.T.，and Droege M.W.，Biotechnol.Bioeng.1992，40：151-157)。

研究表明，增加铁离子、减少铜离子和改变培养气体(甲烷/空气)的比例能促进甲烷氧化菌的比生长速率；添加维生素类外源生长因子可较大地提高MMO酶活性和sMMO的生成量。其中，Shah等采用间歇式和连续式的细胞培养方式在5L普通发酵罐中对II型甲烷氧化菌(M.trichosporium OB3b)进行细胞培养生产sMMO或pMMO，对生长温度、pH，及磷酸盐、硝酸盐和亚铁离子浓度等培养成分条件进行了优化，最大细胞浓度可以达到18g干细胞/L发酵液，最大比生长速率为0.08h^-1(Park S.，HannaM.L.，Taylor R.T.，Droege M.L.，Biotechnol.Bioeng.，1991，38：423-433；Shah N.N.，Hanna M.L.，Taylor R.T.，Biotechnol.Bioeng.，1996，49：161-171)。尉迟力等(尉迟力，沈润南，夏春谷，李树本，外源生长因子对甲烷单加氧酶活性和稳定性的影响，分子催化，1997，11(2)：89-93)研究了添加维生素B₁₂等不同外源生长因子后，甲烷氧化细菌M.trichosporium 3011的MMO活性和稳定性的变化，以及sMMO生成量的影响。另外，Park等研究表明，在气相中加入少量的二氧化碳(CO₂)或在液相中加入碳酸氢钠(NaHCO₃)可以缩短甲烷氧化菌M.trichosporium OB3b的生长迟滞期，提高细胞浓度(Park S.，Hanna M.L.，Taylor R.T.，Droege M.L.，Batch cultivation ofMethylosinus trichosporium OB3b.I：Production of soluble methane monooxygenase.Biotechnol.Bioeng.，1991，38：423-433)。这些方法虽然在一定程度上能提高细胞生长的比生长速率和培养液中的细胞浓度，但是细胞浓度仍然较低，一般在10g细胞/L发酵液以下。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进甲烷氧化菌生长的方法。

本发明所提供的促进甲烷氧化菌生长的方法，是在培养基中培养甲烷氧化菌，其中，所述培养基中添加有浓度为5-400mmol/L的三羧酸循环中的有机酸。

所述三羧酸循环中的有机酸通常为，如苹果酸、柠檬酸、丁二酸、顺丁烯二酸、草酰乙酸、丙酮酸或异柠檬酸等中的一种或几种。

有机酸在培养基中的浓度优选为10-130mmol/L。

有机酸可以先直接加入到培养基中然后培养细胞，也可以在甲烷氧化菌的培养过程中添加到培养液中，其添加方式有一次添加到初始培养基、补料分批添加或连续添加等。

所述甲烷氧化菌以II型甲烷氧化菌为佳，如甲烷氧化菌(Methylosinustrichosporium)OB3b等。

应用本发明培养甲烷氧化菌可以采用分批培养、补料分批培养或连续培养等方式，均可以提高培养液中甲烷氧化菌的细胞密度。

本发明采用向培养基中添加三羧酸循环中有机酸的方式，巧妙地通过对甲烷氧化菌生长代谢流的调控，强化其三羧酸循环过程，促进甲烷氧化菌的生长代谢，从而提高细胞的比生长速率和培养液中细胞密度，细胞密度一般可以达到相同条件下不加有机酸的3～4倍。本发明方法简单，适于进行甲烷氧化菌大规模高密度培养，能达到甲烷生物转化制甲醇的要求，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为甲烷氧化菌的甲烷代谢图；

图2为不同有机酸的加入对M.trichosporium OB3b细胞浓度的影响；

图3为柠檬酸和苹果酸的添加对M.trichosporium OB3b生长的影响；

图4为柠檬酸添加时间对M.trichosporium OB3b生长的影响。

具体实施方式

本发明进行甲烷氧化菌细胞培养所用培养基为NMS培养基，其组成如下(g/L)：

KH₂PO₄ 0.58；Na₂HPO₄·12H₂O 2.17；NaNO₃ 0.85；K₂SO₄ 0.17；MgSO₄·7H₂O 0.037；FeSO₄·7H₂O 0.012；微量元素溶液2ml，pH7.0。

微量元素溶液组成如下(mg/L)：

ZnSO₄·7H₂O 0.287；MnSO₄·7H₂O 0.223；H₃BO₃ 0.062；Na₂MoO₄·2H₂O 0.048；CoCl₂·6H₂O 0.048；KI 0.083；CaCl₂·2H₂O 3.5，pH7.0。

实施例1、在初始培养基中添加有机酸对M.trichosporium OB3b细胞浓度的影响

在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入浓度为130mmol/L的顺丁烯二酸，丁二酸，柠檬酸和苹果酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。以相同条件下不加有机酸培养作为对照。接种4d后测定细胞浓度，细胞浓度以660nm波长下的光吸收表示(OD₆₆₀)，结果如图1所示。结果表明，加入顺丁烯二酸，琥珀酸，柠檬酸和苹果酸对于M.trichosporium OB3b的细胞生长具有明显的促进作用，其中以添加柠檬酸效果最好，其OD₆₆₀为0.523，是对照(OD₆₆₀为0.207)的2.5倍。

实施例2、在初始培养基中添加柠檬酸和苹果酸对M.trichosporium OB3b生长的影响

在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入130mmol/L柠檬酸和0.13mol/L苹果酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。以相同条件下不加有机酸培养作为对照。测定细胞浓度随时间的变化曲线，结果如图2所示。结果表明，培养基中添加柠檬酸和苹果酸可以显著促进M.trichosporium OB3b的细胞生长，当添加柠檬酸时，最大比生长速率和细胞浓度(OD₆₆₀)分别为0.24h^-1和0.698，为对照的3倍。

实施例3、在初始培养基中添加不同浓度柠檬酸对M.trichosporium OB3b生长的影响

在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入0、5和400mmol/L柠檬酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。培养5天后测定细胞浓度，其OD₆₆₀分别为0.207、0.567和0.54，结果表明，柠檬酸浓度在5-400mmol/L均可以促进甲烷氧化菌的生长。

实施例4、在不同对数生长期添加柠檬酸对M.trichosporium OB3b生长的影响

在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。在不同对数生长期向培养液中加入柠檬酸(30mmol/L)，考察柠檬酸的加入时间对M.trichosporium OB3b生长的影响。以不加柠檬酸作为对照。测定细胞浓度，结果如图3所示。结果表明，在对数生长期添加柠檬酸对该菌生长的促进作用均优于在初始培养基中添加。

实施例5、添加草酰乙酸和异柠檬酸对M.trichosporium OB3b的影响

在70ml的玻璃培养瓶分装10ml NMS培养基，分别加入浓度为133mmol/L的草酰乙酸和异柠檬酸，用1M NaOH调节pH值为7.0，接入M.trichosporium OB3b种子培养液，接种量为10％(v/v)，在30℃、130rpm水浴旋转摇床培养。以相同条件下不加有机酸培养作为对照。接种4d后测定细胞浓度，OD₆₆₀值分别为0.365和0.420，对照OD₆₆₀值为0.207，结果表明，草酰乙酸和异柠檬酸的添加能促进该菌的生长。

Claims (6)

1、一种促进甲烷氧化菌生长的方法，是在培养基中培养甲烷氧化菌，其特征在于：所述培养基中添加有浓度为5-400mmol/L的三羧酸循环中的有机酸。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机酸为苹果酸、柠檬酸、丁二酸、顺丁烯二酸、草酰乙酸或异柠檬酸中的一种或几种。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机酸在所述培养基中浓度为10-130mmol/L。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述有机酸的添加方式为一次添加到初始培养基、补料分批添加或连续添加。

5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述甲烷氧化菌为II型甲烷氧化菌。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述II型甲烷氧化菌为甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b。

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