CN1269831A

CN1269831A - 通过分析y染色体dna序列确定马物种遗传性别

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Publication number: CN1269831A
Application number: CN98808991A
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·迈克尔·韦德; 布鲁斯·托马斯·哈里森; 布赖恩·威廉·金; 肯尼思·克利福德·里德; 凯瑟琳·玛格丽特·墨菲
Original assignee: Wu Li Dance Co Pty Ltd
Current assignee: Wu Li Dance Co Pty Ltd
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2000-10-11
Also published as: NZ502716A; AUPO780297A0; JP2001509381A; US6455252B1; EP1019498A1; US20020102541A1; ZA986044B; WO1999002672A1

Abstract

本发明涉及特异于Equus caballus的Y染色体的DNA序列、探针和引物,本发明还涉及确定马、胎马、马胚胎或马细胞的性别的方法,本发明进一步涉及分离Y染色体DNA序列的方法。

Description

通过分析Y染色体DNA序列确定马物种遗传性别

发明领域

本发明涉及与马Y染色体相关的多核苷酸序列以及鉴定这类多核苷酸序列的方法。本发明还涉及确定个体及从个体获得的细胞样品的原初(即遗传)性别的方法，特别涉及马性别的确定。

发明背景

各种马工业的许多方面优选一种性别的动物占优势，这可以出于繁殖潜力、特定性状的可遗传性、温顺性、行为、身材和体格、外观及其它考虑。

有利的是能确定胎儿的性别，因为它可以使得妊娠得到最佳控制和评价。

当通过胚胎转移(经或不经诱导的多次排卵)或通过从供体取出并返回或通过体外受精而进行辅助繁殖方法时，有利的是能确定胚胎的性别，因为它能使得潜在的后代的性别得以预先确定。如果与经胚胎二分法(1，2)而人工孪生方法结合时，其还能增加繁育所需性别，而不降低潜在后代的总数。

特别有利的是通过用包括具有一种或另一种性基因组成，即X染色体(这种精子产生雌性后代)或Y染色体(这种精子产生雄性后代)，的精子占优势的精子群，对母马受精而预先确定后代的性别。这种富集的精子群还可有利地用于体外受精。在另一个特别有利的应用中，已知性基因组成的单个精细胞可被体外注射进成熟卵母细胞的细胞质中(ICSI：细胞质内精子注射)，导致受精以产生已知性别的受精卵。确定精细胞群及单个精细胞的性基因组成的能力是这种应用的必要前提条件。

马物种的原初性别与大多数哺乳动物物种一样是由存在或不存在完整的Y染色体或其功能部分而确定的(3-8)。所述的必需部分是已知为SRY的基因，该基因负责起始精巢分化(9-11)。所产生的精液的分泌对第二性征的发育有决定性影响(12)。

个体马的性别或预计的性别因此可通过与马Y染色体独特相关的DNA序列的分析而确定。

前期报道的与马Y染色体相关的DNA序列(11，13，14)均为假定序列，其通过从引物寡核苷酸经聚合酶链反应(PCR；15，16)而扩增，所述引物寡核苷酸的序列衍生自己知在其它哺乳动物中是Y连锁的基因，例如ZFY(13，14)和SRY(11，13)。关于与马Y染色体相关的DNA序列没有发表的DNA序列资料。ZFY和SRY在所检测的所有哺乳动物物种中仅以单拷贝存在(除了已知Mus物种，已有描述其中存在两个类似的Zfy基因；17)，因此在马中预计也是如此。在确定活胚胎的遗传性别时，由于仅从显微活检中获得少数细胞，所以检测的灵敏性需非常高。测试重复存在于Y染色体上的DNA序列以进行胚胎性别测定的优点在现有技术中已有描述(18，19)。

已报道的在马Y染色体上发现的一个重复DNA序列(20)是已知为Bkm(5′-G·A·C/T·A-3′；21-23)的一个短DNA序列元件，其已报道存在于许多脊椎动物物种中。考虑到Y染色体上的代表包括总数的一小部分，其在基因组其它处也丰富。这种序列本身对于检测显微活检样品的遗传性别没有用途。

发明概述

本发明现已鉴别了在马Y染色体中重复存在的特异DNA序列。所述核酸分离物相应于在Equus caballus的Y染色体上发现的一种DNA序列的全部或部分。本发明因此提供了能特异地与含有Y染色体DNA序列的来自马的核酸样品杂交的一些多核苷酸分离物。

与本发明的第一部分所用的基本相似的程序以前已用于动物，但是其是用于观察而非分离或以其它方式确定与鸡(24)、牛(25)和绵羊(26)的生成两种胚细胞的性别相关的DNA片段。

因此，本发明的第一个方面提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸具有SEQ ID NOS：1-4或8-11任一种所示的序列，或者与其杂交的序列。

本发明的多核苷酸序列特异地与马Y染色体杂交。“与马Y染色体特异地杂交”是指多核苷酸与存在于马Y染色体上的重复序列杂交，所述重复序列以比存在于马基因组其它处显著多拷贝数存在于马Y染色体上。优选地，所述序列以少于6个拷贝存在于单倍体雌性基因组中，更优选地仅以1个拷贝存在于单倍体雌性基因组中。

在一个优选的实施方案中，所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO：3所示的序列或者与其杂交的序列。

本发明的多核苷酸序列优选地与SEQ ID NOS：1-4或8-11所示序列在高严格性下杂交。当用于本文时，“高严格性”是指如下条件：(i)杂交后采用低离子强度和高温度冲洗，例如0.1×SSC和0.1％(w/v)SDS，50℃；(ii)杂交中采用的条件例如杂交温度比杂交的多核苷酸的解链温度低25℃，例如1.5×SSPE，10％(w/v)聚乙二醇6000(27)，7％(w/v)SDS(28)，0.25mg/ml鲱精DNA，65℃；或者(iii)例如0.5M磷酸钠，pH7.2，5mM EDTA，7％(w/v)SDS(28)和0.5％(w/v)BLOTTO(29，30)，70℃；或者(iv)杂交中采用变性剂如甲酰胺(31)，例如50％(v/v)甲酰胺，5×SSC，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％(w/v)焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液(32)，超声裂解的鲑精DNA(50μg/ml)以及10％硫酸葡聚糖(33)，42℃。参见参考文献34-36。

在另一个优选的实施方案中，在严格条件下杂交的多核苷酸长度少于500个核苷酸，更优选少于200个核苷酸，更优选少于100个核苷酸。

在另一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸序列与SEQ IDNOS：1-4或8-11所示的任一序列共享至少40％的同源性、更优选至少60％的同源性、更优选至少80％的同源性、更优选至少90％的同源性、更优选至少95％的同源性，其中同源性是根据Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.(1997)″间隔BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序″，核酸研究25(17)：3389-3402中所述的BLAST程序blastn计算的。

在另一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸序列在严格条件下与特征在于SEQ ID NO：8的核苷酸990-2497、SEQ ID NO：9的核苷酸421-1920、SEQ ID NO：10的核苷酸421-1930或SEQ IDNO：11的核苷酸1502-2996的序列杂交。

本发明的多核苷酸可以包括DNA或RNA序列。

本发明还提供了包括本发明第一方面的多核苷酸序列的载体以及用这种载体转化的宿主细胞。

在第二个方面，本发明提供了具有至少8个核苷酸的寡核苷酸探针或引物，所述的寡核苷酸具有与本发明第一方面的多核苷酸杂交的序列。

在一个优选的实施方案中，所述的寡核苷酸的长度至少为10个、优选为至少15个、更优选为至少18个核苷酸。

在一个优选的实施方案中，所述的寡核苷酸衍生自SEQ ID NO：3的序列。在一个优选的实施方案中，所述的寡核苷酸包括如下序列：

AGCGGAGAAAGGAATCTCTGG(SEQ ID NO：12)，或

TACCTAGCGCTTCGTCCTCTAT(SEQ ID NO：13)，其分别衍生自SEQ ID NO：7所示的马雄性基因组DNA序列的核苷酸6-26以及核苷酸184-205的反向互补序列。

应理解的是本发明的探针或引物可以经体外或体内合成产生。体外探针合成方法包括有机化学合成方法或酶介导的合成，例如通过SP6 RNA聚合酶和含有在SP6特异性启动子的转录控制下的本发明的第一方面的多核苷酸序列的质粒。

在另一个优选的实施方案中，所述的寡核苷酸探针与一种标记例如放射性同位素、酶、生物素、荧光剂或化学发光剂缀合。

在第三方面，本发明提供了确定马、胎马、马胚胎或马细胞的性别的方法，所述方法包括分析来自马、胎马、马胚胎或细胞群的生物学样品中是否存在本发明第一方面的多核苷酸。

马细胞可以是例如马的精细胞。在一个优选的实施方案中，它们可以是精细胞群或在用荧光DNA结合染料Hoechst 33342(37，38)染色后经流式细胞计数分辨的单个的精细胞。

马细胞还可以是例如具细胞核的胎细胞。这种细胞可以经羊膜腔穿刺或绒毛膜绒毛取样收集。在一优选的实施方案中，它们可在怀孕的母马的外周血中取样(参见引入本文作参考的参考文献39)。

为了使假阴性降至最低，所述方法优选用一或多个合适的阳性对照进行。例如，可以同时分析所述生物学样品中是否存在在雄性和雌性马中以大约相等拷贝数存在的序列。例如可以分析生物学样品中是否存在分散常染色体重复序列。

本领域技术人员应理解的是可以以各种方式确定样品中是否存在本发明的多核苷酸序列。例如，所述分析可以涉及使用本发明的探针的Southern印迹杂交、斑点印迹杂交或原位杂交试验，或者，所述分析可以涉及使用本发明的寡核苷酸引物和探针的聚合酶链反应(PCR；16)或连接扩增反应(LAR；40，41)。

术语“聚合酶链反应”或称“PCR”当用于本文时，通常是指根据参考文献42和43所述扩增微量特异核酸，RNA和/或DNA的程序。通常，需要感兴趣区域末端或之外的序列信息，从而可设计寡核苷酸引物；这些引物可以与待扩增模板的相反链的序列相同或相似。两个引物的5′末端核苷酸可以与扩增物质的末端匹配。PCR可以用于扩增特异的RNA序列、来自基因组DNA的特异的DNA序列以及从总细胞RNA转录的cDNA序列、噬菌体或质粒序列，等等。参见参考文献16和44。

如本文所用，PCR被认为是扩增核酸试验样品的核酸聚合酶反应方法的一种但不是唯一的例子，所述方法包括使用已知的核酸(DNA或RNA)作为引物，并用核酸聚合酶扩增或产生特异的核酸，或者扩增或产生与特定核酸互补的特异核酸(例如参见参考文献45和46)。

术语“连接链反应”或称“LCR”或称“连接扩增反应”或称“LAR”当用于本文时，通常是指根据参考文献40和41所述扩增微量特异核酸，RNA和/或DNA的程序。通常，需要感兴趣区域的序列信息，从而可以设计与合适核酸模板上相邻位点互补的寡核苷酸对。寡核苷酸对经连接酶作用连接在一起。连接产物的量可通过用几轮这种模板依赖性连接的线性或指数扩增而增加。在线性扩增时，一对寡核苷酸被连接，将反应加热以使连接产物与其模板解离，并进行额外的类似的连接循环。指数扩增使用两对寡核苷酸，其中一对寡核苷酸与靶序列的一条链互补，另一对寡核苷酸与靶序列的另一条链互补。在这种情况下，连接产物互相作为互补模板以进行后续的连接循环，中间间隔加热以将连接产物从模板链分离。在退火的寡核苷酸和模板间的一个碱基对的错配会阻止连接，由此使得DNA模板间的单碱基对差异可以区分开来。LAR可被用于扩增特异特异的RNA序列、来自基因组DNA的特异的DNA序列以及从总细胞RNA转录的cDNA序列、噬菌体或质粒序列，等等。参见参考文献40和41。如本文所用，LAR被认为是扩增核酸试验样品的核酸连接酶反应方法的一种但不是唯一的例子，所述方法包括使用已知的核酸(DNA或RNA)作为引物/探针，并用核酸连接酶扩增或产生特异的核酸，或者扩增或产生与特定核酸互补的特异核酸(例如参见参考文献47和48)。

在第四方面，本发明提供了用于确定马、胎马、马胚胎或马细胞的性别的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面的多核苷酸或本发明第二方面的寡核苷酸探针或引物。

用于本文的术语“EY.AC6”、“EY.AD11”、“EY.AI5”、“EY.AM7”分别指SEQ ID NOS：1-4所示的特异DNA序列。这些术语也包括SEQ ID NOS：1-4的相关序列有核苷酸的取代、添加或缺失的变体，只要所述变体特异于马Y染色体杂交。

这种变体包括天然存在的变体，其可经DNA序列的点突变、缺失或插入、经重组、基因转变、缺陷复制或重排而在个体和群体中发生。或者这种变体可以人工产生，例如经定点诱变、“基因改组”、使用外切核酸酶和/或内切核酸酶、或经将DNA部分连接在一起而添加DNA序列、或经模板依赖性和/或模板不依赖性DNA聚合酶添加DNA序列而产生。

EY.AC6 DNA序列如SEQ ID NO：1中所示。该序列包括432个核苷酸碱基对，可以使用克隆到质粒pGEM-T(Promega的商标)的DNA片段来检测。采用Operon(商标)引物OPAC.06对雄性马基因组DNA的RAPD PCR产物进行电泳和染色，用聚丙烯酰胺凝胶回收克隆片段。选择该片段是因为其作为雄性基因组DNA的RAPD PCR产物可见，而雌性基因组DNA的RAPD PCR无该产物。经与雄性和雌性Equus caballus基因组DNA的Southern印迹杂交，可见EY.AC6克隆片段的同源物在两性中都存在，但是在雄性中其被大量地重复，而单倍体雌性基因组仅含有一个或者少量拷贝。已经确定的EY.AC6的序列似乎与存在于马的Y染色体中的EY.AM7序列相似，因为这两个测序分离物共享128bp重叠区，达91％的相似性。

所述的EY.AD11 DNA序列见SEQ ID NO：2。该序列包括600个核苷酸碱基对，可以使用克隆到质粒pGEM-T(Promega的商标)的DNA片段来检测。采用Operon(商标)引物OPAD.11对雄性马基因组DNA的RAPD PCR产物进行电泳和染色，用聚丙烯酰胺凝胶回收克隆片段。选择该片段是因为其作为雄性基因组DNA的RAPDPCR产物可见，而雌性基因组DNA的RAPD PCR无该产物。经与雄性和雌性Equus caballus基因组DNA的Southern印迹杂交，可见EY.AD11克隆片段的同源物在两性中都存在，但是在雄性中其被大量地重复，而单倍体雌性基因组仅含有一个或者少量拷贝。

EY.AI5 DNA序列见SEQ ID NO：3。该序列包括230个核苷酸碱基对，可以使用克隆到质粒pGEM-3Z(Promega的商标)的DNA片段来检测。采用Operon(商标)引物OPAI.05对雄性马基因组DNA的RAPD PCR产物进行电泳和染色，用聚丙烯酰胺凝胶回收克隆片段。选择该片段是因为其作为雄性基因组DNA的RAPD PCR产物可见，而雌性基因组DNA的RAPD PCR无该产物。经与雄性和雌性Equus caballus基因组DNA的Southern印迹杂交，可见EY.AI5克隆片段的同源物在两性中都存在，但是在雄性中其被大量地重复，而单倍体雌性基因组仅含有一个或者少量拷贝。

EY.AM7 DNA序列见SEQ ID NO：4。该序列包括285个核苷酸碱基对，可以使用克隆到质粒pGEM-T(Promega的商标)的DNA片段来检测。采用Operon(商标)引物OPAM.07对雄性马基因组DNA的RAPD PCR产物进行电泳和染色，用聚丙烯酰胺凝胶回收克隆片段。选择该片段是因为其作为雄性基因组DNA的RAPD PCR产物可见，而雌性基因组DNA的RAPD PCR无该产物。经与雄性和雌性Equus caballus基因组DNA的Southern印迹杂交，可见EY.AM7克隆片段的同源物在两性中都存在，但是在雄性中其被大量地重复，而单倍体雌性基因组仅含有一个或者少量拷贝。已经确定的EY.AM7的序列似乎与存在于马的Y染色体中的EY.AC6序列相似，因为这两个测序分离物共享128bp重叠区，达91％的相似性。

使用荧光标记的二脱氧核苷酸(50-53)，链终止DNA测序技术(49)测定SEQ ID NO：1-4描述的DNA序列。

本领域技术人员熟知本发明的多核苷酸序列具有许多优点，它们以多拷贝存在于对于Y染色体中，从而，在检测单一拷贝DNA序列的分析中尽可能增加Y染色体分析的敏感性。因此这样可以用于测定非常少量的样品，例如，从活胚胎(2)中得到的少量细胞，或者在妊娠母马(39)的外周血得到的胎源细胞，或者由荧光激活的细胞分拣(38)而分离得到的精细胞。

本发明的多核苷酸序列和寡核苷酸引物以及探针可以应用在，例如，胚胎活检的性别鉴定，胎儿的性别测定，即经过羊膜穿刺术，绒毛膜取样，妊娠母马外周血液中循环的胎细胞；单个精细胞或者精细胞群的性基因组成分析，；性表型含混不清的分辨；马来源的组织(活马或死马的肉、皮、毛、骨等)的性别分析；同样也可以用于其他相关马种类，包括灭绝的或濒危的种类。

本发明的多核苷酸序列和寡核苷酸引物以及探针除了用于性别鉴定之外，还有大量的其他用途。例如，该序列可以用于筛选各种哺乳动物种类制得的重组DNA文库。所述DNA序列也可以用做推定相似序列或者具有功能相似性的遗传连锁序列。该序列也可以用于染色体步查或染色体跳查技术，以分离本发明核苷酸序列近侧的编码和非编码序列。

本发明的其他方面是，它还提供一种分离Y染色体DNA序列的方法，它包括：

合并来自大量的单一种的雄性动物的等量基因组DNA，合并相同数量的同种雌性动物，优选为与该雄性动物紧密相关，例如，同胞，的雌性动物的等量基因组DNA；

使雄雌性合并的等量样品DNA混合物与任意寡核苷酸引物混合进行PCR(聚合酶链反应)，凝胶电泳处理得到的片段；

测定染色的产物是否存在由雄性的DNA，而不是由雌性动物的DNA扩增而得到的片段；

从电泳凝胶中回收所述的片段，经分子克隆分离每一个片段；并且，

用来自所述分离出的片段的序列的寡核苷酸引物对雄雌两性的基因组DNA样品进行PCR分析。

其优选的实施方案涉及的方法包括在第(iii)步之后加入一步骤，经PCR和电泳分析大量单一雄性和雌性动物的相等的基因组DNA样品证实片段的雄性关联性。优选的方法也可以包括在步骤(iv)以后加入另一步骤，即经标记的所述的片段与雌性和雄性基因组DNA杂交，证实每一个与雄性相关的片段的分离。

本说明书中使用的术语“包括”表示包含所描述的成分，或特征，或者一组成分或特征，它伴有或者不伴有其他成分，或特征，或者一组成分或特征。

以下将结合实施例和附图进一步非限定性地解释本发明。

附图简要说明

图1表示用雄性相关序列EY.AI5对马、驴和骆驼的杂交分析结果。样品基因组DNA(2.5μg)来自各种雄性(m)马和雌性(f)马，(马科：Equus caballus)，以及蒙古野马(E.Przewalskii)，驴(E.asinus)，和骆驼(骆驼科：Camelus dromedarius)，被Sau3AI消化。用琼脂糖凝胶电泳分辨片段。将其转移到带正电的尼龙薄膜上，并如本文所述的用洋地黄毒苷标记的探针EY.AI5杂交之。M泳道含有DNA标准，以碱基对显示它的大小。

图2为从雌雄马的基因组DNA，用引物EQYL1和EQYR1直接扩增得到的片段序列。用·表示从雌雄基因组DNA测定出的序列间的差异；用*表示雄性基因组DNA序列与克隆EY.AI5序列(SEQ IDNO：3)的差异。从nt6至26的划线区为性别鉴定引物EQYL2序列；划线区nt184至205为性别鉴定引物EQYR5(见本文)的反向互补序列。

图3可见重组噬菌体DNA与克隆的雄性相关序列杂交分析结果。含马基因组插入片段的Lambda FixII载体的DNA(10μg)样品，被所示的限制性内切酶EcoRI和HindIII消化。68℃处理消化物15分钟。然后在转移到带正电的尼龙薄膜以前用琼脂糖凝胶电泳分辨。用洋地黄毒苷标记的探针杂交该薄膜，所述的探针是用旁侧质粒引物SP6和T7对克隆插入物的PCR扩增得到的。在进行第二个探针杂交之前，用本文方法从薄膜上洗脱第一探针。作为探针的插入物是：(1)EY.AI5；(b)EY.AD11。示出在DNA转移前，在紫外照射下拍摄的凝胶照片。标有M的泳道含有DNA标准，其大小如碱基对所示。

图4a可见用限制性内切酶NotI从Lambda FixII载体将马基因组DNA插入物32.3与其旁侧T3和T7启动子序列一道切下以后，该插入物中限制性内切酶EcoRI的位点。表示出4.7kb亚克隆EcoRI片段32.3E5的位置，32.E5的完整序列被测定；图4b中示出在该亚克隆中如本文限定的截短的LINE的重复序列EY.LINE的相对位置，还示出在该亚克隆中先前描述的序列EY.AC6，EY.AD11，EY.AI5，EY.AM7的位置。在亚克隆32.3E5与亚克隆33.1H7间存在一种密切的关系(见图5)，因此使得如图所示33.1H7被叠加在32.3E5上。

图5a可见用限制性内切酶NotI从Lambda FixII载体将马基因组DNA插入物33.1与其旁侧T3和T7启动子序列一道切下以后，该插入物中限制性内切酶HindIII的位点。表示出两个3.4kb的亚克隆重复HindIII片段33.1H7和33.1H2的位置，但是不能确定哪个重复序列占据两个可能的位置中的哪一个位置。两个片段的完整序列被测定并发现具有88-90％的相同性；图5b中示出在亚克隆33.1H7中如本文限定的截短的LINE的重复序列EY.LINE的相对位置，还示出在该亚克隆中先前描述的序列EY.AC6，EY.AD11，EY.AI5，EY.AM7的位置。在亚克隆32.3E5与亚克隆33.1H7间存在一种密切的关系，因此使得如图4b所示33.1H7(和33.1H2)被叠加在32.3E5上。

图6a可见用限制性内切酶NotI从Lambda FixII载体将马基因组DNA插入物36.1与其旁侧T3和T7启动子序列一道切下以后，该插入物中限制性内切酶EcoRI和HindIII的位点。表示出6.0kb亚克隆EcoRI片段36.1E2的位置以及4.4kb亚克隆HindIII片段36.1H7的位置，36.1H7的完整序列被测定；图6b中示出在该亚克隆中如本文限定的截短的LINE的重复序列EY.LINE的相对位置，还示出在该亚克隆中先前描述的序列EY.AC6，EY.AD11，EY.AI5，EY.AM7的位置。在亚克隆36.31H7的碱基1378至4355的DNA序列与亚克隆32.3E5(见图4b)以及亚克隆33.1H7和33.1H2(见图5b)间存在一种密切的关系。亚克隆36.1H7序列位于这一同源区编码的EY.AC6，EY.AD11的反向和直接重复序列以及间插序列的5’。

序列表的简要描述

SEQ ID NO：1显示了包括432个互补碱基对的马重复单位EY.AC6的一条链的序列。该序列根据标准实践以单字母从5′-末端至3′-末端表示。

SEQ ID NO：2显示了包括600个互补碱基对的马重复单位EY.AD11的一条链的序列。

SEQ ID NO：3显示了包括230个互补碱基对的马重复单位EY.AI5的一条链的序列。

SEQ ID NO：4显示了包括285个互补碱基对的马重复单位EY.AM7的一条链的序列。

SEQ ID NO：5显示了克隆的EY.AI5序列的序列。

SEQ ID NO：6显示了用引物EQYL1和EQYR1直接从雌性马的基因组DNA中扩增的片段序列。

SEQ ID NO：7显示了用引物EQYL1和EQYR1直接从雄性马的基因组DNA中扩增的片段序列。

SEQ ID NO：8显示了包括马基因组DNA的4693个互补碱基对的亚克隆32.3E5的一条链的序列。亚克隆32.3E5是重组噬菌体32.3的一个EcoRI片段。该片段位于噬菌体插入物中的位置示于图4a。

SEQ ID NO：9显示了包括马基因组DNA的3430个互补碱基对的亚克隆33.1H7的一条链的序列。亚克隆33.1H7是重组噬菌体33.1的两个重复HindIII片段中的一个，并与第2个HindIII片段33.1H2(见SEQ ID NO：10)有88-90％的同源性。该重复片段位于噬菌体插入物中的位置示于图5a。

SEQ ID NO：10显示了包括马基因组DNA的3230个互补碱基对的亚克隆33.1H2的一条链的不完全序列，即从亚克隆的核苷酸1-2122以及从2342-3450的序列。亚克隆33.1H2是重组噬菌体33.1的两个重复HindIII片段中的第2个，并与HindIII片段33.1H7(见SEQID NO：9)有88-90％的同源性。该重复片段位于噬菌体插入物中的位置示于图5a。

SEQ ID NO：11显示了包括马基因组DNA的4355个互补碱基对的亚克隆36.1H7的一条链的序列。亚克隆36.1H7是噬菌体36.1的一个HindIII片段。该片段位于噬菌体插入物中的位置示于图6a。

SEQ ID NO：12显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸探针(EQYL2)。

SEQ ID NO：13显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸探针(EQYR5)。

SEQ ID NO：14显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(EQYR4)。

SEQ ID NO：15显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(EQYL1)。

SEQ ID NO：16显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(EQYR1)。

SEQ ID NO：17显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(EQSIN8)。

SEQ ID NO：18显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(EQSIN9)。

SEQ ID NO：19显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(mEQYL2)。

SEQ ID NO：20显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(mEQYR5)。

SEQ ID NO：21显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(mEQSIN8)。

SEQ ID NO：22显示了衍生自SEQ ID NO：3的一个寡核苷酸引物(mEQSIN9)。

定义和缩写

ATP 腺苷-5′-三磷酸

BLOTTO 脱脂奶粉

bp 碱基对

ccc 共价闭合环状

cfu 菌落(集落)形成单位

BSA 牛血清白蛋白

Denhardt′s溶液 0.02％(w/v)BSA，0.02％(w/v)Ficoll 400，0.02％(w/v)PVP

DIG 洋地黄毒苷

DNA 脱氧核糖核酸

dNTP 脱氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)

DTT 二硫苏糖醇

EDTA 乙二胺四乙酸

g 重力

h 小时

LAR 连接扩增反应

LB Luria-Bertani

mg 毫克＝10^-3克

min 分钟

ml 毫升＝10^-3升

μg 微克＝10^-6克

μl 微升＝10^-6升

ng 纳克＝10^-9克

nm 纳米＝10^-9米(参考光的波长)

nt(s)核苷酸

寡核苷酸单链DNA＜30nts

PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

PBS磷酸缓冲的盐溶液＝100mM NaCl，2.7mM KCl，1.75mMKH₂PO₄，4.3mM Na₂HPO₄，pH7.4

PCR 聚合酶链反应

pg 皮克＝10^-12克

多核苷酸单股或双股DNA或RNA

引物用于引导PCR的寡核苷酸

探针杂交到特定靶序列的(标记)核酸

PVP 聚乙烯吡咯烷酮

RAPD多形DNA的随机扩增

RNA 核糖核酸

rpm 每分钟转数

SDS 十二烷基硫酸钠

SINE 短散布重复单位

SSC 标准盐水-柠檬酸盐＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸三钠

SSPE 标准盐水-磷酸盐-EDTA＝0.18M NaCl，10mM NaH₂PO₄，1mM EDTA，pH7.7

TAE tris-醋酸盐-EDTA＝40mM tris-醋酸盐，20mM醋酸，10mMEDTA，pH 8.4

Taq 栖热水生菌(Thermus aquaticus)

TBE tris-硼酸盐-EDTA＝89mM tris-HCl，0.89M硼酸钠，2mMEDTA，pH 8.4

TE tris-EDTA＝10mM tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5

TEMED N，N，N′，N′-四甲基乙二胺

temp 温度

tris tris(羟甲基)-氨基甲烷

uv 紫外

V 伏特

vol 体积当量

v/v 体积/体积当量

本发明的详细描述

实施例1：

从马血样品制备基因组DNA：

将马血样品收集在10ml EDTA Vacutainers^中，立即置于冰上并在2天内送入实验室。发现样品可以存放在Vacutainer中达6个月，而不显著丧失从其中获得的DNA的收率和质量。

将25ml冷的溶胞缓冲液(lysis buffer)(0.32M蔗糖，10mM tris-HCl，pH7.5，5mM MgCl₂，10％(v/v)Triton X-100)加入10ml全血中。悬浮液在4℃、4000xg离心20分钟，沉淀细胞重新悬浮于PBS中并重新离心。然后，细胞悬浮于9ml TE中。将悬浮液调整至25mM EDTA，0.5％(w/v)SDS和0.1mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim公司)，并将溶胞的混合物在37℃下培养过夜，同时缓缓搅动。消化样品用5ml苯酚/氯仿(等体积的用tris-HCl/EDTA平衡的苯酚(Sigma)和24∶1(v/v)氯仿/异戊醇)提取60分钟，将混合物在25℃、4000xg下离心25分钟。从各管中移出水相，并转移至清洁的管中。

通过加入2.5vol乙醇或1vol丙醇使DNA沉淀，滗析出上清，并将DNA用0.5ml 70％(v/v)乙醇洗涤，空气干燥。最后将DNA溶解在2ml 0.1×TE中，并存放于-20℃下。

用Pharmacia Gene Quant RNA/DNA计算器确定DNA的浓度。收率一般为50-250μg高分子量DNA(在琼脂糖凝胶电泳分析之后用溴乙锭染色来估算)。

用于鉴定雄性相关DNA的概念基础

Y染色体是雄性和雌性马在遗传上的唯一差别，存在于正常雄性的所有带核细胞(nucleated cells)中，而在正常雌性的细胞中不存在。这个遗传上的差别必须在雄性基因组中存在的而在雌性基因组中不存在的Y-染色体中反应出来。可以预料，Y-染色体的、雄性特异的DNA序列可以通过一种技术被鉴定出来，即随机调查多重基因组DNA序列(54)，通过比较在其他方面都是相同的正常雄性和雌性基因组的调查数据来进行。

获得等基因的雄性和雌性马，即除了雄性的Y染色体外，个体的基因组相同(cf.近亲交配的小鼠品系)，是不可能的。在没有遗传同源性的情况下，用统计技术和遗传技术的组合来产生雄性和雌性马DNA的假等基因样本(pseudo-isogenic samples)。

从9个兄妹胞亲对的白细胞中提取DNA，并将9个雄性中每一个的等量DNA混合起来，提供一种雄性DNA样本。将每一个雌性的DNA等量混合起来，提供一个假等基因雌性DNA的平行样本。

混合DNA样本的RAPD PCR

雄性和雌性DNA的混合物被用来通过PCR扩增调查雄性相关序列的差别，采用已知作为RAPD引物的十核苷酸引物，该引物可以从Operon Technologies购得。

用于RAPD PCR的方法由以前所描述的方法稍作修饰(55)。每一个PCR反应含有25ng马基因组DNA，5μM RAPD引物(OperonTechnologies)，3个单位的Taq DNA聚合酶Stoffel片段(Perkin-Elmer)，200μM四种dNTPs(Promega)中的每一种，10mM tris-HCl，pH8.0，10mM KCl和5mM MgCl₂，总体积20μl。

反应在Corbett Research公司的PC-960型气冷热循环仪中循环，其起始步骤是94℃下5分钟，然后35个循环的94℃下30秒及在57℃、56℃、55℃、54℃和53℃下各1分钟；循环完成时，该样品被加热到72℃5分钟。

RAPD PCR产物的电泳分析：

用聚丙烯酰胺凝胶电泳来解析RAPD PCR的产物，与用琼脂糖凝胶电泳所获得的相比，将大大地提高片段的分辨率。与用溴化乙锭的UV荧光相比，银染色增强了检测的灵敏度。

DNA扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳在Bio-Rad Mini-Protean II中被解析。该聚丙烯酰胺凝胶是在TBE缓冲液中的10％(w/v)的丙烯酰胺和2％(w/v)双丙烯酰胺，该缓冲液中含有10％(w/v)尿素和5％(v/v)甘油。过硫酸铵(0.15％w/v)和TEMED(0.15％v/v)用来引发和催化聚合反应。

该0.5mm凝胶用Gel Bond PAG反转片照相(FMC；56)。PCR反应产物的样品(2μl)与1μl加样缓冲液(40％(w/v)尿素、3％(w/v)Ficoll400，10mM tris-HCl，pH8.0，3mM EDTA，0.02％(w/v)二甲苯腈蓝，0.02％(w/v)溴酚蓝)混合，装入预先形成的狭槽中，在TBE缓冲液中于300V下电泳40分钟。解析的DNA片段通过银染色被显现(57)。

总共216个不同的Operon RAPD引物被用来筛选混合的雄性和雌性DNA的假等基因，其90％对两个样品都产生出清楚、可重复的结果。

雄性相关DNA片段的鉴定：

发现216个试验引物中的19个扩增了来自雄性DNA集合体的片段，这个片段或者比雌性DNA集合体的类似大小之片段密度低，或者在雌性DNA集合体的PCR产物中不存在。为了确定候选的片段是否确实由所有雄性并仅由雄性的DNA所扩增，将从混合DNA样品产生候选的雄性相关片段的引物片段用于由一些个体雄性和雌性分离的DNA的RAPD PCR。从混合雄性DNA差异扩增的片段可能起因于在一个或两个个体中常染色体的多态性，其可能性被从混合的雌性DNA样品中偶尔观察到的RAPD PCR片段来证实。

这19个候选的引物被用来扩增来自4个雄性和4个雌性马的每一个DNA样品。雄性相关的片段在下列5个引物的产物中是清楚的：OPAC.06(5′-CCAGAACGGA-3′)，OPAD.11(5′-CAATCGGGTC-3′)，OPAI.05(5′-GTCGTAGCGG-3′)，OPAM.01(5′-TCACGTACGG-3′)和OPAM.07(5′-AACCGCGGCA-3′)。不同片段的大小估计分别为460bp，530bp，240bp，320bp和300bp。

雄性相关DNA片段的分离：

对5个候选的雄性特异性片段中的每一个，从银染色的聚丙烯酰胺凝胶上切下含有此片段的片，并使之静置于室温下的20-50μl 0.1×TE中60分钟。经洗脱的DNA在上述用于RAPD PCR的条件下被再扩增，采用的是相应的RAPD引物和1μl切断的片段的溶液作为模板。反应在Corbett Research公司的PC-960型气冷热循环仪中被循环，初始步骤在94℃下2分钟，然后是35个循环的94℃下30秒，55℃或60℃下1分钟；循环完成时，样品被加热至72℃共2分钟。

有必要确认该被再扩增的样品符合候选的RAPD片段在电泳中的迁移性，并且其每一个都含有雄性相关的DNA片段。因此，对每一个被再扩增的样品在聚丙烯酰胺凝胶上与从雄性和雌性基因组DNA用相应的引物进行RAPD PCR的产物、以及雌性DNA与该再扩增样品混合的RAPD PCR产物进行电泳。

在每一个情况下，该再扩增片段的迁移类似于区别性地与雄性DNA有关的片段。在进一步的证实中，每一个被再扩增的样品用洋地黄毒苷标记，并且所得到的探针与已被限制性酶Sau3AI所消化的雄性和雌性马的基因组DNA的Southern印迹杂交。每一个再扩增的片段均显示明显的与雄性有关的杂交模式(数据未显示；参考″经斑点印迹杂交进行集落筛选″，了解探针制备、杂交和检测的细节)。在每一种情况下，该探针还与雌性基因组DNA进行杂交，暗示这些片段可能不只与Y染色体相关和/或样品包含污染的非Y-染色体的DNA。

再扩增的PCR产物在0.5×TBE缓冲液中的1％(w/v)LMP琼脂糖(Sigma)中电泳。从用OPAI.05引物的PCR中回收的材料在溴化乙锭染色的凝胶于302nm的照射下被显示出来。从马基因组DNA用OPAC.06，OPAC.11，OPAM.01和OPAM.07引物的PCR中回收的材料通过用结晶紫染色被显示出来(58)。

含有所需片段的凝胶的最少一部分被切下，并在70℃下熔融于1.5ml的微型离心管中。熔融的凝胶片用3体积的TE稀释，并用等体积的苯酚(用TE饱和)在70℃下提取2分钟。将管转移至冰中2分钟，然后在Eppendorf 5414C微型离心机中在14,000rpm及室温下离心4分钟，水相被移至清洁的管中。苯酚相用50μl TE反提取，并与初始的提取水相混合起来。

通过加入0.1vol的3M醋酸钠，pH5和2.5vol乙醇沉淀DNA。将管在-20℃下存放过夜，然后在Eppendorf 5414C微型离心机中在13000rpm、4℃下离心30分钟。仔细滗析出上清，用冷的75％(v/v)乙醇洗涤DNA沉淀，并稍加离心。沉淀物在真空干燥器中干燥10分钟，最后将DNA溶解于20μl TE中，于-4℃下存放。

将PCR-扩增的雄性相关片段连接至质粒载体中：

用RAPD引物OPAC.06，OPAD.11，OPAM.01和OPAM.07进行PCR所得的片段被连接到质粒pGEM-T(pGEM-3的一种线化衍生物)中，采用的是pGEM-T载体克隆体系(Promega)，按供应商提供的说明书进行。

由用RAPD引物OPAI.05的PCR所得到的片段通过平端连接至质粒载体pGem-3Z(Promega)而被克隆。该载体因在NEBuffer 4(新英格兰生物实验室)中被限制性内切酶SmaI(新英格兰生物实验室)消化而被线性化，然后用小牛碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理。该被消化的质粒DNA通过在1％(w/v)LMP琼脂糖(Sigma)于0.5×TBE缓冲液中电泳而被纯化。该凝胶用结晶紫染色(58)，切下含有该线性质粒的最少的一部分凝胶，并如上所述回收DNA。

该凝胶纯化的OPAI.05-雄性相关的RAPD材料用T4 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)按供应商的说明进行处理，然后，被加热到65℃持续15分钟。然后，冷却的样品用T4多核苷酸激酶(新英格兰生物实验室)按照供应商的说明进行处理，然后再加热到65℃，15分钟。该凝胶纯化的线性化质粒(大约10ng)和PCR片段(大约5ng)用3Weiss单位的T4 DNA连接酶(Promega)在50μl的Promega DNA连接酶缓冲液(30mM Tris-HCl，pH7.8，10mM MgCl₂，10mM DTT，0.5mM ATP)中，在4℃下连接14-16小时。

重组质粒的转化：

大肠杆菌菌株DH5a的单个菌落(来自用引物OPAC.06，OPAD.11，OPAM.01和OPAM.07进行的RAPD PCR的片段)或菌株XL1-Blue(来自用引物OPAI.05进行的RAPD PCR的片段)被接种到200ml LB肉汤中，使之在37℃下在摇动培养器中生长至在550nm下光吸收值为约0.3(3-4小时)。4℃下，在Eppendorf 5414C微型离心机中离心3000rpm，5分钟收集细胞，并重新悬浮于30毫升冷的0.1M MgCl₂中，放置于冰中持续20分钟。按前述离心收集细胞，并将沉淀物悬浮在1毫升冷的0.1M CaCl₂中。加入甘油至15％(v/v)，将感受态细胞存放于-70℃下。

对于转化，将50μl感受态细胞解冻，与5μl的连接反应混合，置于冰中20分钟，在42℃热激45秒，然后再回到冰中持续5分钟。转化的细胞通过在37℃的SOC培养基(2％(w/v)细菌用胰胨，0.5％(w/v)细菌用酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，10mMMgSO₄，20mM葡萄糖)中保温1小时来复苏，然后，平铺在含有氨苄青霉素(100μg/ml)、X-gal(25μg/ml)和IPTG(10μM)的LB琼脂上，37℃下培养过夜。转化效率为2×10⁷cfu/μg质粒(用ccc pGEM-7)。

由PCR进行菌落筛选：

选择白色菌落并在500μl的LB肉汤中保温过夜。克隆细胞的重组质粒中的插入片段用从位于克隆位点侧翼的引物位点的PCR扩增来分析。1μl的细胞悬浮液与各2.7μM的

SP6(5′-ATTTAGGTCACACTATAGAATAC-3′)和

T7(5′-ATTATGCTGAGTGATATCCCGCT-3′)引物(均来自BresatecGustom Oligos)，各200μM的dNTPs，1.5mM MgCl₂，100mM tris-HCl，pH8.3，500mM KCl和1单位Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim公司)混合，最终的体积为25μl。

通过斑点印迹杂交进行菌落筛选：

通过PCR发现含有适当大小的重组插入片段(即，适合于从基因组DNA通过RAPD PCR而产生的雄性相关片段的大小)的菌落，通过在如上所述的菌落PCR反应中掺入8μM洋地黄毒苷-11-dUTP；Boehringer Mannheim公司)而被标记。

雄性和雌性马基因组DNA样品的一个重复的稀释系列(分别为1μg，250ng，100ng和10ng)在0.2ml的0.4M NaOH，10mM EDTA中变性并被加热到100℃，10分钟。该样品被施加到有Vaccum BlotManifold(Grbco-BRL)的带正电的尼龙膜(Boehringer Mannheim公司；59)上。每个孔用500μl 0.4M NaOH洗涤，并通过在2×SSC中洗3×10分钟而中和膜。

根据用于滤膜杂交的DIG系统用户指南(Boehringer Mannheim公司)进行DNA杂交。膜在50℃下、在10ml DIG Easy Hyb杂交缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1603558)中预杂交至少2小时，所用玻璃杂交瓶(Hybaid)放置在Eurotherm 91E摇动杂交培养器(型号310；Robbins Scientific公司)中。

DIG-标记的探针从重组质粒的插入片段按前述制备，采用的是SP6和T7引物。其每一个被加入到4ml DIG Easy Hyb溶液(BoehringerMannheim公司)中，其浓度为50-100ng/ml，并在68℃下变性10分钟。该预杂交的溶液由探针溶液所替换，并在50℃下在摇动的培养器中进行14-16小时的杂交。

然后将膜取出，在低严格条件下(2×SSC，0.1％(w/v)SDS，25℃)洗涤3×10分钟，然后在高严格条件下(0.2×SSC，0.1％(w/v)SDS，68℃)洗涤2×10分钟。被洗涤的膜在2×封闭溶液(Beohringer Mannheim公司，货号1585762)中旋转保温1小时，其中含有1×马来酸缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)。

用碱性磷酸酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim公司，货号1093274)被加入到封闭溶液中，浓度为0.075单位/ml，再持续旋转培养30分钟。

然后，将膜在1×洗涤缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)中洗涤2×15分钟，再转移至1×检测缓冲液(BoehringerMannheim公司，货号1585762)5分钟。

化学发光底物CDP-Star(Boehringer Mannheim公司，货号1685627)在检测缓冲液中按1∶100稀释，每150cm²的膜加入1ml。该底物溶液在清晰透明的片材间均匀分散，在室温下用X光底片(AGFA Eurix RP1)采用增强屏(Dupont Quanta III-T)检测到信号。

雄性和雌性DNA样品的不同杂交强度指示探针衍生自含有用引物OPAC.06，OPAD.11，OPAI.05和OPAM.07进行RAPD PCR得到的雄性相关片段的克隆(数据未给出)。从用引物OPAM.01进行RAPDPCR中回收克隆的雄性相关片段的努力没有成功。实施例2克隆的雄性相关片段的序列分析

用ABI PRISM^TM染料终止循环测序反应试剂盒(Dye TerminatorCycle-Sequencing-Ready Reaction Kit)(ABI Perkin-Elmer)，用AmpliTaqDNA聚合酶根据厂商指导(ABI Perkin-Elmer)用双脱氧测序化学法进行DNA测序。测序反应产物根据厂商指导在昆士兰大学DNA序列和分析中心的ABI A373测序仪上分析。

衍生自使用引物OPAC.06、OPAD.11、OPAI.05和OPAM.07每一种的RAPD PCR的回收产物的重组质粒的克隆的插入片段的序列如SEQ ID NOS：1、2、3和4所示，所述插入片段分辨与斑点印迹上的雄性DNA差异杂交。这些插入片段因此分别命名为EY.AC6、EY.AD11、EY.AI5和EY.AM7。

克隆的雄性相关片段的杂交分析

来自9个雄性和9个雌性马的基因组DNA(2.5μg)样品用5单位Sau3AI(新英格兰生物实验室)在NEBuffer缓冲液(新英格兰生物实验室；100mM NaCl，10mM bis-tris-丙烷-HCl，pH7.0于25℃，10mMMgCl₂，1mM二硫苏糖醇)和0.1mg/ml BSA中消化，终体积为25μl。

消化的样品与DIG标记的DNA分子量标记混合物(BoehringerMannheim公司，货号1218603)，在1％(w/v)琼脂糖于0.5×TBE中于70V电泳3小时。分离的片段在0.4M NaOH中过夜经毛细作用转移至带正电的尼龙膜(Boehringer Mannheim公司；30)上。转移后，将膜在2×SSC中洗3×10分钟而中和。根据DIG系统的膜杂交用户手册(Boehringer Mannheim公司)进行所有杂交。

膜在置于Eurotherm 91E旋转杂交保温箱(310型；RobbinsScientific)中的玻璃杂交瓶中，在10ml DIG Easy Hyb杂交缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号16103558)中于50℃预杂交至少2小时。

DIG标记的DNA探针如上所述从含有插入片段EY.AC6、EY.AD11、EY.AI5和EY.AM7的4个重组质粒制备。每个探针以50-100mg/ml的浓度加入到4ml DIG Easy Hyb溶液(BoehringerMannheim公司)中并于68℃变性10分钟。预杂交溶液用探针溶液替换，在旋转保温箱中于50℃进行杂交14-16小时。

然后取出膜并在低严格性下洗3×10分钟(2×SSC，0.1％(w/v)SDS，25℃)，随后在高严格性下洗2×10分钟(0.2×SSC，0.1％(w/v)SDS，68℃)。洗涤的膜在含有1×马来酸缓冲液(BoehringerMannheim公司，货号1585762)的2×封闭溶液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)中旋转保温1小时。

将用碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体(Boehringer Mannheim公司，货号1093274)以0.075单位/ml的浓度加入至封闭溶液中并继续旋转保温30分钟。

然后在1×洗涤缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)中洗涤膜2×15分钟并转移至1×检测缓冲液(BoehringerMannheim公司，货号1585762)中5分钟。化学发光底物CDP-Star(Boehringer Mannheim公司，货号1685627)在检测缓冲液中1∶100稀释，并每150cm²膜加1ml。在透明片之间均匀涂布底物溶液，用具有增感屏(Dupont Quanta III-T)的X-光胶片在室温检测信号。

使用EY.AI5得到的雄性差异杂交图提示这一序列以多拷贝存在与所分析的所有雄性马的DNA中。在雌性基因组中存在一同源序列，但是丰度低很多，杂交的相对密度和图案显示只有1或几个拷贝。

为证实克隆片段EY.AI5代表规范的基因组重复单位，用引物EQYL2：5′-AGCGGAGAAAGGAATCTCTGG-3′(SEQ ID NO：12)和EQYR4：5’-TTCGTCCTCTATGTTGAAATCAG-3′(SEQ ID NO：14)经雄性基因组DNA的直接PCR制备DIG标记的探针，所述引物衍生自EY.AI5的序列(SEQ ID NO：3的核苷酸6-26以及核苷酸173-195的反向互补序列；两个引物由Bresatec Custom Oligos提供)。

两种探针的杂交图案是相似的，直接基因组探针似乎与雄性和雌性DNA中的小于900bp的片段相对更强地杂交，提示重复序列的基因组代表物包括不是克隆的EY.AI5片段的一部分的序列。

四个克隆序列EY.AC6，EY.AD11，EY.AI5和EY.AM7依次用DIG标定和用已由9个不同限制性内切酶消化的雄性和雌性基因组DNA的Southern印迹杂交。所有显示的雄性专一杂交模式也被雌性DNA杂交，虽然其程度是相当低的。

这些数据显示，四个序列的每一个在雄性基因组中重复许多次并因此与雌性DNA在Y染色体的杂交比较。

通过具有6碱基识别序列的限制性内切酶分割的所有四种片段(KpnI，EcoRI，HindIII，BamHI)的杂交模式的惊人相似暗示，所有四种克隆片段是马Y染色体中单一长串联重复元件的成分。四个克隆片段的序列分析表明EY.AC6和EY.AM7(SEQ ID NOS：1和4)之间有重叠，这与本解释是一致的。

四个克隆序列中，EY.AI5显示出在雄性和雌性DNA之间具有最大的定量差别。限制性模式暗示，在约230bp(TaqI和RsaI消化)的基因组中具有基本的重复元件，这与序列分离的长度是一致的。

使用上述的条件，克隆序列EY.AI5用DIG标定和用已从不同品种的马分离出来并由Sau3AI(图1)消化的雄性和雌性基因组DNA的Southern印迹杂交。杂交模式类似于已检测的所有品种，包括公知为蒙古野马的亚种。这表明，在整个Equus cabullus种族中，EY.AI5序列发生了性别分化。实施例3关于判别性PCR基性别鉴定的概念基础

所述四个雄性相关的DNA序列的每一种在马的Y染色体中清楚地存在，因为每一个均显示出雄性特异性杂交模式。但没有一个是对于雄性基因组独特的。将所述四个候选物作为马染色体的诊断测试的靶，EY.AI5片段显然提供了最大的可能性，因为它显示出了Y染色体和其它地方的丰富性之间的最大差别。因此，为了试图开发某些PCR条件，进一步的研究集中于这个序列上，所述PCR条件是通过利用Y染色体和在基因组中其它位置的其同源物的序列之间的潜在差异而在雄性和雌性马DNA之间可提供完全的鉴定。

EY.AI5序列在染色体上重复的事实暗示它不能用单一的、可定义的序列表示出来；重复的DNA元件一直显示出序列异质性(例如60)。PCR扩增序列的克隆产生了单一、特定的代表物，其除了固有的序列变化外，由于体内和体外的偶然诱变而可能包含有错误。

此外，必须对在雌性基因组中存在的EY.AI5引导的序列进行分析以使得能够鉴定在它/它们和Y染色体代表物之间的可能的序列差别。雄性和雌件基因组DNA中的EY.AI5序列分析

由于上述原因，将取自个体雄性和雌性马的基因组DNA样品通过特异用于EY.AI5序列的一对引物的PCR进行扩增。将衍生自EY.AI5序列的引物(在SEQ ID NO：3中分别为核苷酸1-21和核苷酸206-205的反向互补序列)：EQTK1：5′-GTCGTAGCGGAGAAAGGAATC-3′(SEQ ID NO：15)和EQYR1：5′-AGCGGACTGTTCCGTTTCGG-3′(SEQ ID NO：16)用于扩增取自雄性和雌性马的基因组DNA靶(两种引物由BresatecCustom Oligos提供)。所得产物直接从这些引物未经克隆而测序，以便能够对重复元件的大群体进行序列分析。

序列数据(图2)显示在雄性马的个体(经克隆的)代表EY.AI5序列和大序列群体之间有较小的差异。

直接衍生自雄性基因组的片段中有两个区域不同于衍生自雌性片段的等同区域(核苷酸1-30和核苷酸162-220)。将序列不同的这些区域选作为设计用于鉴别雄性和雌性基因组DNA的EY.AI5序列的PCR引物的退火靶。实施例4基于PCR的马性别鉴定分析的开发

一种引物对是衍生自图2中的序列资料以用于专门检测马Y染色体DNA。这些引物是：EQYL2：5′-AGCGGAGAAAGGAATCTCTGG-3′(SEQ ID NO：12)和EQYR5：5′-TACCTAGCGCTTCGTCCTCTAT-3′(SEQ ID NO：13)，其分别衍生自图2中(下划线)所示的雄性基因组DNA序列的核苷酸6-26及核苷酸184-205的反向互补序列，在雄性和雌性基因组之间的这两个区域表现出明显的序列差异。

用这些引物(两种引物由Bresatec Custom Oligos提供)对马基因组DNA样品的扩增从雄性DNA样品中产生了约200bp的产物，而在雌性DNA样品中没有检测到有产物产生(数据未示出)。对十个不相关马的基因组DNA样品的分析(数据未示出)证实，这些引物的PCR扩增提供了一种检测Y染色体序列存在的准确方法。

在一个遗传性别的诊断鉴定中，没有检测到雄性特异性引物的PCR扩增产物可能不仅是由于雌性样品，而且也可能由于PCR失败或样品损失造成。假阴性结果的可能性必须最小化。因此，发展了一个二重PCR鉴定，其中将一个常染色体散布重复序列(SINE；61)的121bp(近似值)片段与Y特异性靶同时进行扩增。

用于扩增SINE元件的引物是EQSIN8：5′-GCCCAGTGTTTCGTTGGTTCG-3′(SEQ ID NO：17)和EQSIN9：5′-CATAGTTGTATATTCTTCGTTGTGG-3′(SEQ ID NO：18)，其分别衍生自ERE-1 SINE序列家族(61)的核苷酸53-72和核苷酸148-172的反向互补序列。

通过在所有四种引物(62，63)的5’-末端上引入一共同的m13序列而将二重PCR扩增进行相互优化。用于二重马PCR性别鉴定的两对引物对是：性别鉴定引物：mEQYL25′-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTAGCGGAGAAAGGAATCTCTGG-3′(SEQ ID NO：19)mEQYR55′-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTTACCTAGCGCTTCGTCCTCTAT-3′(SEQ ID NO：20)对照引物：mEQSIN85′-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCCCAGTGTTTCGTTGGTTCG-3′(SEQ ID NO：21)mEQSIN95′-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTCATAGTTGTATATTCTTCGTTGTGG-3′(SEQ ID NO：22)。

用于马遗传性别的内对照鉴定的二重PCR反应在塑料毛细管(同时使用Corbett Research公司的FTS-1型热循环仪)中进行，所述毛细管中含有总体积为10μl的50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，0.001％(w/v)明胶，2mM MgCl₂，100μM dATP，100μM dCTP，100μMdGTP，100μM dTTP，0.2μM mEQSIN8，0.2μM mEQSIN9，0.45μMmEQYL2，0.45μM mEQYR5(所有四种引物由Bresatec Custom Oligos提供)和0.5单位的AmpliTaq(Perkin-Elmer)。

将样品放在Corbett Research公司的FTS-1毛细热循环仪中并对其进行加热步骤：94℃30秒，69℃30秒和72℃30秒，总共6个循环，随后进行20个另外的循环：94℃30秒，和72℃30秒，最后保持在25℃通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

将所述产物在TAE缓冲液(Boehringer Mannheim公司)中于2％(w/v)的琼脂糖凝胶内在100V电泳约30分钟，然后用溴化乙锭染色并用紫外照射显影。由于SINE元件的扩增，马基因组DNA样品的二重PCR扩增从雌性马DNA产生了约160bp的片段。由于Y染色体EY.A15元件的扩增，雄性DNA得到类似的条带以及在约240bp处的另一条带。在无DNA时没有看见产物。

上述的二重DNA性别鉴定分析显然能够鉴别和区分5ng至少至20pg(近似等同于在三个细胞中的DNA量)的雄性和雌性DNA样品。实施例5对不同品种的马进行二重PCR性别鉴定的应用

如上述，通过二重PCR对从不同品种的雄性和雌性马中分离出来的DNA样品进行分析。

使用性别鉴定引物和对照引物的二重PCR能够鉴定和区分所有品种的雄性和雌性马的DNA样品，包括公知为蒙古野马亚种的所有品种得到相似的结果。实施例6对全血细胞进行二重PCR性别鉴定的应用

前述实施例显示了所述二重PCR性别鉴定成功地应用于小DNA样品。为了便于使用，希望在少量细胞上进行所述鉴定而无须将DNA从其中分离出来。将白血细胞用于建立合适的鉴定条件。

血样品吸进具有柠檬酸钠(Becton Dickinson)的VacutainerCPT^TM管中。该管在室温下保持直立并在收集后的2小时内进行处理。

每个管在吊桶式转头(Sigma 3k18，带11133转头)中在24℃以1900g进行离心30分钟。将约60-70％的清澈血浆层移除，然后将凝胶基质上基本上不含有红血球的剩余液体转移至洁净的管中。用PBS将样品稀释至10ml且在24℃以300×离心15分钟。除去上清并将沉淀物轻轻地悬浮于10mlPBS中并在相同条件下离心处理。再次将沉淀物悬浮于10mlPBS中并以100×g离心处理。

将所述细胞沉淀物再悬浮在250μl PBS中且通过血细胞计数器计算悬浮液中具核细胞的浓度。最后用PBS将所述悬浮液稀释至每毫升有10⁶具核细胞的浓度。

将雄性和雌性马的细胞悬浮液样品以含有50mM DTT的PBS系列稀释且将合适的稀释液依次进行两次冻/融的循环：含有样品的试管首先漂浮在液氮上1-2分钟以将其冷冻，然后将其转移至室温下的水浴中以使悬浮液解冻。将所述试管放置在沸水浴中15分钟，然后在冰上冷却。二重PCR反应在塑料毛细管(同时使用CorbettResearch公司的FTS-1型热循环仪)中进行，所述毛细管中含有总体积为10μl的50mM KCl，10mM Tris-HCl，PH8.3，0.001％(w/v)明胶，2mM MgCl₂，100μM dATP，100μM dCTP，100μM dGTP，100μM dTTP，0.2μM mEQSIN8，0.2μM mEQSIN9，0.45μM mEQYL2，0.45μMmEQYR5和0.5单位的AmpliTaq和2μl处理过的细胞悬浮液。

将样品放在Corbett Research公司的FTS-1型毛细热循环仪中并对其进行加热步骤：94℃30秒，69℃30秒和72℃30秒，总共进行6个循环，随后进行20个循环：94℃30秒，和72℃30秒，最后保持在25℃通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

将所述产物在TAE缓冲液(Boehringer Mannheim公司)中于2％(w/v)的琼脂糖凝胶内在100V电泳约30分钟，然后用溴化乙锭染色并用紫外线照射显影。

同前述一样，在无马DNA时没有观察到条带，而用20pg雌性马DNA清晰可见条带(约为160bp的单一条带)，用20pg雄性马DNA也清晰可见条带(约为160bp和240bp的两个条带)。

含有约5-100个细胞的白血细胞样品产生1个(160bp)或2个(160bp和240bp)条带，这分别与它们来自雌性或雄性马一致。实施例7对马胚胎进行二重PCR性别鉴定的应用

从5个妊娠母马中将8个胚胎在受精约8天后分离出来，并且根据胚泡的大小，将每个胚胎立即分成四或更多切片(每个样品含有估计最多为50个细胞)。通过在50μl PBS中经显微操作进行分割。将胚泡的每个切片用2μl的4％(w/v)BSA(Miles Pentes Crystalline，货号81-001-4；1，2)收集并转移至7.5μl去离子水中。将每个切片在-20℃下冷冻储存。

将含有约15-50个细胞的每个胚胎切片的解冻悬浮液在DTT中制成20mM并且随机地分布在编号为8-39的试管中。从这个阶段起，用第二个人对所述32个样品进行“盲”处理，所述第二个人没有参与胚胎的收集、分裂或样品制备。

对雄性和雌性马的细胞悬浮液样品进行两次冻/融的循环：对每个循环而言，将含有样品的试管首先漂浮在液氮上1-2分钟直至将其冷冻，然后将其转移至室温下的水浴中直至悬浮液解冻。最后将所述试管放置在沸水浴中15分钟，然后在冰上冷却。

二重PCR反应在塑料毛细管(使用Corbett Research公司的FTS-1型热循环仪)中进行，所述毛细管中含有总体积为20μl的50mMKCl，10mM Tris-HCl，PH8.3，0.001％(w/v)明胶，2mM MgCl₂，100μMdATP，100μM dCTP，100μM dGTP，100μM dTTP，0.2μM mEQSIN8，0.2μM mEQSIN9，0.6μM mEQYL2，0.6μM mEQYR5和0.5单位的AmpliTaq和9.5μl的胚胎细胞悬浮液。

将样品放在Corbett Research公司FTS-1毛细热循环仪中并对其进行加热步骤：94℃30秒，69℃30秒和72℃30秒，总共进行6个循环，随后进行21个循环的94℃30秒，和72℃30秒，最后保持在25℃通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

将所述产物在TAE缓冲仪(Boehringer Mannheim公司)中于2％(w/v)的琼脂糖凝胶内在100V电泳约30分钟，然后用溴化乙锭染色并用紫外线检测。

在无马DNA时没有观察到条带，而用来自雌马DNA的20pgDNA清晰可见条带(约为160bp的单一条带)，用来自雄马DNA的20pgDNA也清晰可见条带(约为160bp和240bp的两个条带)。用125和5个(近似值)雌马白血细胞清晰可见条带(约为160bp的单一条带)，雄马白血细胞雄清晰可见条带(约为160bp和240bp的两个条带)。

由胚胎切片分析得到的产物表现出较弱的信号，其在强度上是可变的；随后已发现这是产生于在胚胎切片收集过程中所用的BSA引起pH漂移而造成的亚适PCR条件。

未参与早期分析的两个人从鉴定结果各自独立地指出每个胚胎切片的性别。两个人的指示是完全一致的且显示在表1中。

表1显示出通过二重PCR而进行胚胎活体解剖的性别分析。从5个母马中将胚胎在受精约8天后分离出来，并且将胚胎切成四或更多切片并将各切片在-20℃下冷却。如上文所述，将含有约15-50个细胞的每个解冻切片随机地散布在编号为8-39的试管中，并对该32个样品进行“盲”处理。在分析结束时，另外两个人各自独立地指出每个鉴定结果的性别。两个人的指示是完全一致的。F是雌性诊断，M是雄性诊断且NR是无结果。为了清楚，将所得数据进行了重排。

对每个胚胎而言，取自同一胚胎的四个切片均被指为同性，例外的是样品34不产生结果(无雄性特异性条带或对照条带，证实了包括用于内部对照的引物的价值)。此类结果产生的几率是小于10^-7。

这些数据证明了用于胚胎切片的二重PCR性别鉴定的统计学有效性。

表1

胚胎号	估计的细胞数	样品ID	性别
胚胎号	估计的细胞数	样品ID	性别	1111	50505050	12392033	FFFF
2222	45454535	10133024	MMMM	1111	50505050	12392033	FFFF
2222	45454535	10133024	MMMM	3333	30354535	31173719	FFFF
4444	50505050	3682138	MMMM	3333	30354535	31173719	FFFF
4444	50505050	3682138	MMMM	5555	50505050	27163529	FFFF
6666	50505050	25142311	MMMM	5555	50505050	27163529	FFFF
6666	50505050	25142311	MMMM	7777	50505050	3228922	MMMM
8888	15254040	26151834	MMMNR	7777	50505050	3228922	MMMM

实施例8

马的Y染色体的长范围重复序列的识别

为了研究与马的Y染色体相关的这四种所述的序列元件的内在关系、重复、转变和基因环境，这些元件被用作探针鉴别一个马的基因组文库中的重组噬菌体。

马基因文库：

在Lambda Fix^II载体中的雄性马的基因组DNA文库从Stratagene(货号946701)获得。经过一个单轮扩增，这个文库的估计效价为2.0×10⁹噬斑形成单位(pfu/ml)。依照与文库(Stratagene)一起提供的指导手册中的方法，培养噬菌体和宿主细菌。

用EY.AI5探针对马基因组文库的筛选

对于第一轮筛选，生长在宿主大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2)的总数为25,000到30,000的噬斑被放在每一个均为150mm平板的培养基上。依照滤膜杂交DIG体系的用户手册(BoehringerMannheim公司)所列的方案，由每一个平板制得复制噬斑，并且DNA被固定在不带电的尼龙膜上(132mm直径)，该膜是从BoehringerMannheim公司(货号1699083)购买，用于菌落和噬斑的杂交。紫外交联后(Bio-rad GS Gene Linker)，放置在Eurotherm 91E旋转杂交细菌培养器(型号310；Robbins Scientific)中的玻璃杂交瓶内，42℃下，在10mlDIG Easy Hyb杂交缓冲液中(Boehringer Mannheim公司货号1603558)膜被预杂交至少2小时。使用SP6和T7引物，如上所述，从重组质粒的插入物制备出用于散布常染色体重复序列(SINE；61)的121bp(大约)片段的一个DIG标记的EY.AI5探针和一个对照探针。每一个探针以浓度为25-50ng/ml加入到10ml的DIG Easy Hyb溶液(Boehringer Mannheim公司)，并且在68℃条件下变性10分钟。这种预杂交溶液被探针溶液替代，并且在旋转细菌培养器中，42℃条件下杂交14-16小时。

然后膜被取出，进行3×10分钟低严格条件下(2×SSC，0.1％(w/v)SDS，25℃)洗涤和紧跟着的2×10分钟高严格条件洗涤(0.2×SSC，0.1％(w/v)SDS，68℃)。洗涤后的膜在含有1×马来酸缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)的2×封闭溶液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)中旋转培养。

用碱性磷酸酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim公司货号1093274)，以0.075单位/ml的浓度加入封闭溶液并且继续进行30分钟旋转培养。

然后膜在1×洗涤缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)中洗涤2×15分钟，之后转移到1×检测缓冲液(BoehringerMannheim公司，货号1585762)停留5分钟。

化学发光的底物CDP-Star(Boehringer Mannheim公司，货号1685627)以1∶100在探针缓冲液中稀释，并且每150cm²膜添加1ml。在清晰透明的薄片间将底物溶液均匀分散，并且采用X光胶片(AGFAEurix RP1)用增感屏(Dupont Quanta III-T)在室温下探测信号。

复制噬斑发出正信号的大约100个噬斑中的50个噬斑被从所筛选的300,000个噬斑中选出，并且每一个都被以一个小的琼脂柱取出；这些柱在4℃下的SMT缓冲液中保存。

第二轮筛选是在减小噬斑密度(大约3,500pfu)条件下进行，以20个阳性噬斑进行。取噬斑和杂交采用与第一轮筛选相同的方法。对于EY.AI5探针(在复制滤膜上)的16个独立的克隆阳性被选出作进一步的研究。它们是：31.1，31.2，31.3，31.4，31.5(源自在第一轮筛选中平板号31的5个阳性柱)，32.3，33.1，33.2，33.4，34.1，34.2，34.3，34.5，36.1，36.2和36.3(相似地分别选自平板32，33，34和36)。

从重组噬菌体中分离DNA

DNA被从五个阳性克隆中分离出来，在补加0.3％(v/v)甘油和10mM MgSO₄的50ml LB培养基中，使宿主菌株大肠杆菌XL1-Blue MRA在37℃下过夜生长(64)。依照制造商提供的方法，在适宜的盐和pH条件下(QIAGEN Lambda Maxi Kit；货号12562)，使用阴离子交换树脂将DNA(200ug)分离出来。

噬菌体插入物与EY.AI5和EY.AD11探针的Southern杂交：

20ug重组噬菌体DNA与40单位的限制性内切酶EcoRI或HindIII保温过夜。所有限制消化都是用由Boehringer Mannheim公司或新英格兰Biolabs提供的酶和在制造商提供的缓冲液中，依照他们的指示进行的。消化的DNA的10ug的等分试样，与一个DIG标记的DNA分子量标记物(Boehringer Mannheim公司，货号1218603)混合，于0.5×TAE中，在1％(w/v)琼脂糖中，80V条件下电泳。分离的片段在0.4M NaOH中过夜经毛细作用转移到带正电的尼龙膜(Boehringer Mannheim公司；30)。转移之后，膜在2×SSC中用3×10分钟洗涤来中和，然后DNA被紫外交联到这个膜上(Bio-Rad GSGene Linker)。

所有的杂交都是依照滤膜杂交DIG体系的用户手册(BoehringerMannheim公司)进行的。放置在Eurotherm 91E旋转杂交细菌培养器(型号310；Robbins Scientific)中的玻璃杂交瓶内，42℃下，在10mlDIG Easy Hyb杂交缓冲液中(Boehringer Mannheim公司货号1603558)膜被预杂交至少2小时。

依上所述，从含有插入物EY.AI5和EY.AI5(实施例2)的两个重组质粒制备出DIG标记的DNA探针。探针以25-50ng/ml的浓度加入到10mlDIG Easy Hyb溶液(Boehringer Mannheim公司)，并且在68℃变性10分钟。预杂交溶液被探针溶液替代，并且杂交在旋转细菌培养器中在42℃下进行14-16小时。

然后膜被取出，进行3×10分钟低严格条件(2×SSC，0.1％(w/v)SDS，25℃)洗涤和紧跟着的2×10分钟高严格条件洗涤(0.2×SSC，0.1％(w/v)SDS，68℃)。洗涤后的膜在含有1×马来酸缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)的2×封闭溶液(BoehringerMannheim公司，货号1585762)中旋转培养。

用碱性磷酸酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim公司货号1093274)，以0.075单位/ml的浓度加入封闭溶液并且旋转培养继续进行30分钟。

然后膜在1×洗涤缓冲液(Boehringer Mannheim公司，货号1585762)中洗涤2×15分钟，之后转移到1×探针缓冲液(BoehringerMannheim公司，货号1585762)中停留5分钟。

随着EY.AI5探针对正信号的探测(图3a)，利用在0.2MNaOH中的0.1％(w/v)SDS，在68℃处理20分钟，探针被从膜中去除。然后利用上述方法将膜和用于EY.AD11序列的探针杂交(图3b)。对EY.AI5的大部分阳性限制片段也对EY.AD11显示阳性。噬菌体31.1没有显示与任意一种探针的杂交。

基于它们与两种探针的杂交，噬菌体限制片段被选择用于序列分析。这些片段与基因组重复元件具有相近的大小，这些元件是用相同的两个探针对以EcoRI和HindIII消化的马基因组DNA进行Southern分析而鉴别。用于测序的选出的片段是：一个来自噬菌体33.1的3.3kb HindIII片段(大小与雄性和雌性基因组DNA的HindIII片段相似，强度比例约为2∶1)；一个来自噬菌体36.1的4.4kb HindIII片段(大小与雄性和雌性基因组DNA的HindIII片段相似，强度比例约为20∶1)；一个来自噬菌体32.3的4.7kb EcoRI片段(大小都与一个雄性和雌性基因DNA密度比例为大约20∶1的HindIII片段相似)；一个来自噬菌体32.3的4.7kb EcoRI片段(与基因组EcoRI带的大小相似，该基因组EcoRI带在雄性中以低密度同两个探针杂交，在雌性中以刚刚能够检测到的水平同两个探针杂交)；和一个来自噬菌体36.1的6.0kb EcoRI片段(存在于雄性基因组DNA但在雌性中未检测到)。

重组噬菌体插入物的限制绘图

旁侧为与T3和T7启动子位点的马基因组DNA的插入物，用NotI的消化作用，从Lambda Fix^II载体切下。该盒用EcoRI(对噬菌体32.3和36.1)或HindIII(对噬菌体33.1和36.1)部分消化。部分消化的片段和作为大小标记物的用HindIII和EcoRI消化的1DNA片段(Boehringer Mannheim公司货号528552)一起，在80V，于含有溴化乙锭的0.5×TAE中，在1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳5小时；凝胶上放置一个带刻度的尺子，并用紫外透射(302nm)来照相。

分离的片段用20×SSC转移到不带电的膜(Hybond-N，Amersham货号RPN303N)，接下来在0.25N HCl中脱嘌呤，在0.5MNaOH，1.5MNaCl中变性和在1M Tris(pH7.5)，1.5M NaCl(65)中中和。用生物素化寡核苷酸探针依次分别探测T3和T7启动子序列(新英格兰Biolabs货号1227-BT和1223-BT)，在第二次杂交前，在68℃，用在0.2M NaOH中的0.1％(w/v)SDS处理20分钟，膜被去除。在放置在Eurotherm 91E旋转杂交细菌培养器(型号310；RobbinsScientific)中的玻璃杂交瓶(Hybraid)内，在10ml含有1％(w/v)BSA和0.5mg/ml载体的DNA磷酸盐缓冲的7％(w/v)SDS溶液，中进行预杂交(28)。加入生物素化寡核苷酸探针，到最终浓度为10ng/ml。对T7杂交温度为59℃，对T3为49℃。杂后交洗涤是在如下的条件下进行：于5×SSC，0.1％(w/v)SDS中在25℃维持15分钟，然后于5×SSC，0.1％(w/v)SDS中，在60℃维持15分钟。用10ml 1×封闭剂(5％(w/v))SDS，125mM NaCl，25mM磷酸钠(pH7.2))，在25℃维持15分钟以封闭膜。向封闭混合物加入碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Boehringer Mannheim公司；cat no.1093266)到浓度为1单位/ml，并且膜再进行10分钟处理。在1×封闭剂中10分钟，然后在15分钟的0.1×封闭剂中处理后洗涤，随后用上面所述的CDP-Star和放射自显影。

与在凝胶中同时电泳的对照大小的标记物的位置相对比，估计出杂交片段的大小。得到DNA片段梯分别对应于T3或T7启动子的位点和连续的限制位置(与从用双脱氧核苷酸序列标记的启动子生成的梯子相类似)的距离。因为T3和T7启动子位置侧面与插入物的两端相接，得到完全的基因图，以允许限制位置的确定。

在溴化乙锭染色的凝胶上分析完全消化产物可提供有关分离所有相邻断裂部位的距离的其他信息。噬菌体克隆32.3(EcoRI)、33.1(HindIII)和36.1(HindIII和EcoRI)的限制图分别示于图4a、5a和6a中。由重组噬菌体亚克隆限制性片段

在37℃下用20单位的EcoRI(用于噬菌体32.2和36.1)或HindIII(用于噬菌体33.1和36.1)消化重组噬菌体DNA(7.5μg)共6小时。在包含溴化乙锭的0.5×TAE缓冲液中在1％(w/v)琼脂糖中通过电泳分离限制性片段。通过UV照射(302nm)肉眼观察电泳带，然后切下所选择的片段。根据制造商的要求使用硅胶膜技术(QIAquick Gel Extraction Kit；QIAGEN货号28704)回收DNA。

克隆载体是噬菌粒pBluescriptII KS+(Stratagene)，该噬菌粒已用HindIII或EcoRI消化，然后用虾碱性磷酸酶(BoehringerMannheim公司；货号1758250)处理，并由此被线性化。载体DNA如上所述用凝胶电泳和QIAquick凝胶抽提技术纯制。在10μl的T4DNA连接酶缓冲液(与酶一起提供的缓冲液)中，于15℃下用1 Weiss单位的T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim公司)连接线性载体(约20ng)和噬菌体限制性片段(约20ng)共16小时。连接反应用于转化100μl的感受态E.coli DH5a细胞。

E.coli菌株DH5a的单菌落接种在250ml的LB肉汤中，并于37℃下在振摇的培养箱中生长至550nm处的吸光度为约0.5。在Eppendorf 5414C微量离心机中于3000rpm和4℃下离心5分钟，由此收集细胞，并重新悬浮在30ml的冷0.1M氯化镁中，然后放置在冰上共20分钟。如前所述离心收集细胞，并将沉淀物悬浮在1ml的冷0.1M氯化镁中。添加甘油至15％(v/v)，并将感受态细胞储存在-70℃下。

在转化时，溶解100μl等分的感受态细胞，然后与10μl的连接反应物混合，放置在冰上共30分钟，在42℃下热激2分钟，然后再放置于冰上2分钟。在900μl的SOC培养基(2％(w/v)细菌—胰化蛋白胨、0.5％(w/v)细菌—酵母提取物、10mM氯化钠、2.5mM氯化钾、10mM氯化镁、10mM硫酸镁、20mM葡萄糖)中于37℃温育1小时，由此复苏已转化的细胞，然后于37℃下将其铺板在包含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂上用于过夜培养。由各载体/插入对的连接物中选择8或16个菌落。

在3ml体积的包含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB肉汤中接种各菌落，在振摇培养箱中于37℃下16小时后收集细菌悬浮物。由各悬浮物(Wizard^TM Plus Minpreps，Promega货号A7500)制备小量的DNA。通过凝胶电泳比较经纯制的质粒DNA和未经切断的载体，以鉴别带有包含合适尺寸的插入片段的质粒的克隆。

由这些克隆得到的DNA合适地用HindIII或EcoRI消化，然后使用带有正确尺寸的可切除的插入片段的克隆用于序列分析。包含插入片段的质粒克隆如下：32.3E1和32.3E5(带有由重组噬菌体32.3得到的4.7kb EcoRI片段的pBluescriptII)；33.1H2，33.1H3，33.1H4，33.1H6，33.1H7和33.1H8(带有由重组噬菌体33.1得到的3.3kbHindIII片段的pBluescriptII)；36.1H1，36.1H2，36.1H4，36.1H6，36.1H7，36.1H8，36.1H9和36.1H10(带有由重组噬菌体36.1得到的4.4kb HindIII片段的pBluescriptII)；以及36.1E2和36.1E8(带有由重组噬菌体36.1得到的6.0kb EcoRI片段的pBluescriptII)。

在50ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB肉汤中使用带有质粒32.3E5、33.1H2、33.1H7、36.1H7、36.1H1和36.1E2的E.coli DH5a的单菌落制备细菌悬浮物。根据供应商的指导使用QIAGEN质粒试剂盒和QIAGEN-tip 100树脂柱(QIAGEN，货号12144)由上述悬浮物中纯制100-200μg质粒DNA的制备物。与探针EY.AI5和EY.AD11杂交的亚克隆的噬菌体片段的序列分析

根据制造商的指导(ABI Perkin-Elmer)，利用带有AmpliTaq DNA聚合酶的ABI PRISM^TM染料终止循环测序反应试剂盒(BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(ABI Perkin-Elmer)，使用双脱氧测序化学进行DNA测序。如果插入片段36.1H7的表观二级DNA结构阻碍了终末测序反应，则使用BigDye引物循环测序反应试剂盒(Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(T7)(ABI Perkin-Elmer)。根据制造商的指导，在位于昆士兰大学的澳大利亚基因组研究实验室的ABI A377测序仪上分析测序反应的产物。

总共进行112个测序反应，平均阅读长度为700个碱基。记录了约20kb的新的马基因组DNA序列，然后首先分析针对本文描述为EY.AC7、EY.AM7、EY.AD11和EY.AI5的序列的同源性，其次分析针对可从GenBank(国立生物技术信息中心，马里兰州，美国[NCBI])和类似的DNA及蛋白质数据库中得到的序列的同源性。

在首先的测序步骤中使用针对在pBluescriptII载体(BresatecCustom Oligos)中位于插入片段侧翼的T3和T7启动子序列的引物。由其3′极端扩增序列，由已知序列数据中得到的用于该目的的19-24-mer寡核苷酸引物(Bresatec Custom Oligos)从其3′极端延伸序列，然后使该延伸的序列与初级数据吻合。复制、重叠和互补链测序确保了最终基因组DNA序列的准确性。用于构建邻接DNA序列的计算机软件是针对Macintosh的SequencherTM 3.0(Gene Codes公司)。

由噬菌体36.1亚克隆的8个4.4kb HindIII片段被证明是相同的，区别仅在于载体中的插入片段的取向。该结论是基于在序列的至少400个碱基段中观察到100％的同一性。应用该标准可确认由噬菌体36.1得到的2个6.0kb EcoRI片段也是相同的。由噬菌体32.3得到的4.7kb的2个亚克隆的EcoRI片段是不同的。

噬菌体克隆33.1的作图和限制性分析(见图5a)表明有2个类似的3.3kb HindIII片段存在。6个亚克隆的3.3kb插入片段的部分测序支持该观点。质粒33.1H7、33.1H3、33.1H4和33.1H6中的插入片段是相同的，质粒33.1H2和33.1H8中的插入片段是相互相同的，但与上一组呈88-90％的相似性。因此，质粒33.1H7和33.1H2中的插入片段被独立地测序。

选择用于与EY.AI5和EY.AD11序列(实施例2)杂交的噬菌体的测序表明，这些序列和EY.AC6及EY.AM7序列(实施例2)是马Y染色体中的长范围重复单位的组成部分。如在噬菌体32.3、33.1(两次)和36.1中的马基因组DNA插入片段中所发现的，该重复单位的结构示于图4b、5b和6b中。

质粒32.3E1包含一个插入片段，可能是假基因的一部分，如数据库核苷酸和蛋白质翻译检索(GenBank BLAST 2.0；blastn and blastxprograms；NCBI)所测定的，与多个不相关的基因的开放读框具有有限的同源性。

马基因组DNA中鉴别的重复元件包括一些序列，这些序列包括上述重复序列EY.AI5、EY.AD11、EY.AC6和EY.AM7。另外，作为1500bp(大约)单位的一部分的EY.AI5序列，以下称为EY.LINE，在蛋白水平上与哺乳动物的长散布重复元件(LINE：GenBank登录号U93574(人)和AB012223(狗))中的开放读框2(ORF2)的区域有大约50％的同源性。如果是功能性的，这些元件的大小为6.0kb，并包含带有内启动子的5′未翻译区域(UTR)、2个开放读框(ORF1和ORF2)以及终止于polyA尾部的3′UTR。ORF1编码核酸结合蛋白，而ORF2编码带有内切核酸酶和逆转录酶活性的蛋白。EY.LINE序列位于SEQ ID NO：8的核苷酸990-2497处，SEQ ID NO：9的421-1920处，SEQ ID NO：10的421-1930处以及SEQ ID NO：11的1502-2996处。

LINE是广泛存在于哺乳动物基因组中能够逆转录转座的高度重复性DNA序列。由于截短、重排和无意义的突变(67)，大多数在功能上是无活性的。LINE存在于所有已研究的动物(包括有袋类动物)中，而且认为得自于相同的祖先。如果比较从具体的物种中得到的克隆元件，在单个序列之间有可能存在差异。在与LINE探针杂交(68)时，限制性基因组DNA的Southern杂交给出物种特异性的图案。

在用作探针时，上述4个与马Y染色体有关的DNA序列检测到该EY.LINE重复元件。反过来，比较图4b、5b和6b时可以明显看出，该元件是3.5kb(最小长度)的更大重复单元的一部分。这解释了使用不同序列作为探针时在Southern杂交之间存在相似性的原因。图1表明本文所述的EY.LINE对于马是特异性的，其中未检测到EY.AI5与骆驼的限制性消化的基因组DNA有杂交。图1的数据清楚地表明了Equus spp.中EY.LINE的雄性特异性。

本领域技术人员可以理解到，在不偏离本发明的范围的情况下，还可对具体的实施例中所示的本发明进行多种的改进和/或修改。因此，这些实施例应仅是说明性的，而非限制性的。序列表<110>伍利当斯私人有限公司<120>通过分析Y染色体DNA序列确定马物种遗传性别<130>91176<150>PO7802<151>1997-07-09<160>22<170>PatentIn Ver.2.0SEQ ID NO：1<211>432<212>DNA<213>Equus caballus<400>1ccagaacgga gcaggccttt ccaagttcga ggagaaagtt agaaacctac aagaaatcca 60gagaaagcaa aactatccta cctggaaagg gggaggagtc agacaggtct gagatggctc 120tgaaactctg tgtacttgga ggttgccagg acaacttagg tatctgaggt tgtttatgac 180atcacggtga ccatgttccc caagttggcc gcatggttac agtctgagaa ttgccctggc 240tggtctatta aaggaagaca tacccagaaa tagctttgac aaacagaagt cgtgcacaga 300aactagaaga gatcaaacag actctgatta caggcataag aaaggactcc ttgccaagaa 360gcgagaagag agggacaagc actgagagga gaacattctc atctgttcaa gtctatgggg 420attccgttct gg 432SEQ ID NO：2<211> 600<212> DNA<213> Equus caballus<400> 2caatcgggtc cagaataacg acatacagct gtgggggctg aaagagatta gagaacgtga 60acttccaagg attgaaaatc acctcaaaag tcttactgat gctacagaag ggtagaccat 120tccaaataca tgaagaggaa cactaccaag agaacccgat ccgtgctaag cccaggaacc 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Claims

1、分离的多核苷酸，所述的多核苷酸具有SEQ ID NOS：1-4或8-11中任一种的序列，或与其杂交的序列，其中所述的多核苷酸与马Y染色体特异杂交。

2、分离的多核苷酸，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：8的核苷酸990-2497、SEQ ID NO：9的核苷酸421-1920、SEQ ID NO：10的核苷酸421-1930或SEQ ID NO：11的核苷酸1502-2996的序列，或与其杂交的序列，其中所述的多核苷酸与马Y染色体特异杂交。

3、权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述序列与SEQ ID NOS：1-4或8-11中所示的任一种序列共享至少60％的同源性，其中所述的同源性依据本文描述的blastn程序计算出。

4、权利要求3的分离的多核苷酸，其中所述序列与SEQ ID NOS：1-4或8-11中所示的任一种序列共享至少80％的同源性，其中所述的同源性依据本文描述的blastn程序计算出。

5、权利要求3或4的分离的多核苷酸，其中SEQ ID NOS：1-4或8-11中所示的任一种序列的特征在于SEQ ID NO：8的核苷酸990-2497、SEQ ID NO：9的核苷酸421-1920、SEQ ID NO：10的核苷酸421-1930或SEQ ID NO：11的核苷酸1502-2996。

6、权利要求1的分离的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：3所示的序列或与其杂交的序列。

7、包括权利要求1-6任一项的多核苷酸序列的载体。

8、包括权利要求7的载体的宿主细胞。

9、具有至少8个核苷酸的寡核苷酸探针或引物，所述的寡核苷酸具有与权利要求1或2的多核苷酸杂交的序列。

10、权利要求9的寡核苷酸探针或引物，其长度至少为10个核苷酸。

11、权利要求10的寡核苷酸探针或引物，其长度至少为18个核苷酸。

12、权利要求11的寡核苷酸探针或引物，其包括选自如下的一种序列：

AGCGGAGAAAGGAATCTCTGG(SEQ ID NO：12)，或

TACCTAGCGCTTCGTCCTCTAT(SEQ ID NO：13)。

13、权利要求9-12任一项的寡核苷酸探针，其中所述的探针与可检测标记缀合。

14、权利要求13的寡核苷酸探针，其中所述的标记选自放射性同位素、酶、生物素、荧光剂或化学发光剂。

15、确定马、胎马、马胚胎或马细胞的性别的方法，所述方法包括分析来自马、胎马、马胚胎或细胞的生物学样品中是否存在SEQID NOS：1-4或8-11任一种所示的多核苷酸序列，其中存在多拷贝数的所述多核苷酸指示所述生物学样品来自雄性。

16、权利要求15的方法，其中多拷贝数是指在单倍体基因组中存在多于5个拷贝。

17、权利要求15或16的方法，其中所述生物学样品包括一或多个精细胞。

18、权利要求15或16的方法，其中所述生物学样品包括具细胞核的胎细胞。

19、权利要求15或16的方法，其中所述分析涉及Southern印迹杂交、斑点印迹杂交或原位杂交。

20、权利要求19的方法，其中所述分析涉及使用权利要求9-14任一项所述的寡核苷酸探针。

21、权利要求15或16的方法，其中所述分析涉及聚合酶链反应或连接扩增反应。

22、权利要求21的方法，其中所述分析涉及使用权利要求9-12任一项所述的寡核苷酸引物。

23、用于确定马、胎马、马胚胎或一个马细胞或马细胞群的性别的试剂盒，其包括权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸或者权利要求9-14中任一项所述的寡核苷酸探针或引物。

24、一种分离特异于Y染色体的多核苷酸的方法，包括：

(i)合并基本上相等量的来自单一物种的两个或多个雄性动物的基因组DNA，并合并基本上相等量的来自同一物种的类似数目的雌性动物的基因组DNA；

(ii)用任意寡核苷酸引物将基本上相等的雄性和雌性合并的DNA混合物样品进行PCR或LCR，并用凝胶电泳分辨得到的扩增的多核苷酸；以及

(iii)从凝胶中分离扩增自雄性DNA但从雌性DNA不能扩增的多核苷酸。

25、权利要求24的方法，其中步骤(i)中的雄性和雌性动物是同胞。

26、权利要求24或25的方法，其包括下述额外步骤：用从步骤(iii)分离的多核苷酸或其片段作为引物，在从个体雄性和雌性动物中分离的DNA样品上进行PCR反应，以证实该分离的多核苷酸特异于Y染色体，其中若在从雄性分离的DNA上进行PCR反应后存在扩增产物而在从雌性分离的DNA上进行PCR反应后不存在扩增产物，则证实所述多核苷酸特异于Y染色体。

27、权利要求24或25的方法，其包括下述额外步骤：用从步骤(iii)分离的多核苷酸或其片段作为探针，探查雄性和雌性基因组DNA样品，以证实该分离的多核苷酸特异于Y染色体，其中若在雄性DNA中存在多拷贝数的杂交信号指示而在雌性DNA中不存在多拷贝数的杂交信号指示，则证实所述多核苷酸特异于Y染色体。

28、权利要求27的方法，其中多拷贝数是指在单倍体基因组中存在多于5个拷贝。