CN1267152C - 聚乙二醇－干扰素α冻干制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的冻干的聚乙二醇-干扰素α制剂。本发明的特点在于选用谷氨酸和/或精氨酸作为保护剂。本制剂可以包括任选附加的稳定剂如单糖类和/或二糖类。本制剂也可以包括任选的填充剂和/或渗透性调节剂如甘露醇。本发明优选的聚乙二醇-干扰素α是聚乙二醇(40000)-干扰素α。
Description
技术领域
本发明涉及聚乙二醇-干扰素冻干制剂，以氨基酸作为保护剂，特别是精氨酸和/或谷氨酸作为保护剂，以及其冻干方法。
背景技术
干扰素是由细胞分泌的一类诱生蛋白质，具有广普的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是目前世界上公认的最为有效的抗病毒药物之一。在国内外已广泛用于治疗多种病毒性、肿瘤性疾病。但干扰素结构不稳定；长期使用易产生抗体；相对分子量小，在体内易经肾小球滤过而排泄，体内半衰期短。利用一些无毒但水溶性好的免疫惰性大分子聚合物(如聚乙二醇)对其进行修饰，在临床上表现出更大的临床效力。主要优点为：在体外，有较好的物理及热稳定性，抗酶解能力提高，可溶性增加；在体内，循环半衰期明显延长，免疫原性下降，生物利用度提高等。
干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。然而一些干燥方法是在0℃以上或更高的温度下进行。干燥后产品的理化和生物学性质会发生很大的变化。而冻干(即冷冻干燥)是发生在0℃以下，是指通过升华从冻结的物料中去除水分或其他溶剂的过程。升华指的是溶剂，比如水，象干冰一样，不经过液态，从固态直接变为气态的过程。冷冻干燥得到的产物称作冻干物(lyophilizer)，该过程称作冻干(lyophilization)。在冰冻干燥过程中样品的结构不会被破坏，因为固体成份被在其位置上的坚冰支持着。在冰升华时，它会留下孔隙在干燥的剩余物质里。这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性。目前此技术是常用来长期保存生物材料及药品等。
冷冻干燥可以自然发生。在自然情况下，这一过程缓慢而且不可预测。通过冷冻干燥系统，人们改进、细分了很多步骤，加速了这一过程。冻干过程分为冷冻、升华、解析干燥三个阶段，每一个阶段都有相应的要求，不同的物料其要求各不相同，各阶段工艺设计及控制手段的差异直接关系冻干产品的质量和冻干设备的性能。
如上所述，冷冻干燥(冻干)法常用于许多生物活性材料(包括蛋白质)的保存。但是，冻干法也有其自身的局限性，如在冷冻和除水过程中，蛋白过浓，可能会导致产物的不稳定。因此，除了在冻干状态以及液态都可以发生的脱酰胺作用以及氧化反应外，冻干法可能导致交联(生成共价寡聚物)以及非共价聚合物比例的升高。为了增强生物活性材料的稳定性，经常需要一些保护剂。
目前，大多注射用蛋白类生物制品的保护剂通常选用人血白蛋白，而人血白蛋白价格昂贵，致使该冻干产品成本高；另外人血白蛋白具有携带病毒的危险。为了解决这个问题，许多人正致力于蛋白类冻干制剂的研究，尝试以其他物质代替人血白蛋白作为冻干保护剂。如中国专利CN1260171A中选用右旋糖苷作为重组干扰素的冻干保护剂。
已知在某些状态下氨基酸可以作为冻干蛋白产品的保护剂。据报道，谷氨酸钠和赖氨酸盐，对一种蛋白，乳酸脱氢酶，的冷冻变性具有防冻作用(Seguro，et al.，Cryobiology27：70-79(1990))等。其他种类的分子，包括单糖和二糖，以及聚合物比如PVP，也有报道作为冻干蛋白的保护剂。但是，对任一给定的蛋白产品，它们的效用是无法预测的。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种聚乙二醇-干扰素α冻干制剂，该制剂中的蛋白，性能稳定，适于保存。
本发明另一目的是提供一种聚乙二醇-干扰素α冻干制剂的制备方法。
本发明的其他目的，体现于本文对本发明的描述中。
根据本发明，一种聚乙二醇-干扰素α冻干制剂，含有聚乙二醇-干扰素α和一种保护剂，该保护剂为精氨酸和/或谷氨酸。
本发明的保护剂，能保持聚乙二醇-干扰素α在冻干过程中和之后的生物活性和稳定性。精氨酸和/或谷氨酸保护聚乙二醇-干扰素α的机制，可能是在冷冻过程中与蛋白共浓缩，从而起到稀释和保护蛋白的作用。还有一种可能是在冷冻和/或冻干过程中，两性的氨基酸分子与蛋白分子之间发生特异的相互作用，保护蛋白不变性。
本发明的制剂在冻干前，每ml含有谷氨酸1-50mmol，优选为5-20mmol，更优选为10mmol，和/或精氨酸5-100mmol，优选为5-30mmol，更优选为15mmol。
本发明的保护剂，优选精氨酸和谷氨酸共用，其中精氨酸和谷氨酸含量的比值为0.5-2.5，优选的比值为1-2，更优选的比值为1.5。
本发明的制剂还包括一种可药用缓冲液。这种可药用缓冲液可以是常用缓冲液，如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲液，优选乙酸盐。本制剂在冻干前，可以含有5-20mM缓冲液，如乙酸盐，优选10mM缓冲液，如乙酸盐。本发明制剂在冻干前，用缓冲液将pH调节到pH5.5-6.5之间，优选pH6.0。
本发明制剂中所用的干扰素，可使用任何干扰素α，例如，欧洲专利No.43980中公开的干扰素α(其中称为成熟人白细胞干扰素A，也参见J.Pharm.Biomed，Analysis Vol.7，No.2，233-238(1989))。
用于本发明的优选干扰素α是聚乙二醇-干扰素α2a、聚乙二醇-干扰素α2b或聚乙二醇-干扰素α1b，尤其优选聚乙二醇-干扰素α2b。
本发明的制剂在冻干前，每ml含有106-108IU、特别是1-18×106(IU)的聚乙二醇-干扰素α。
本发明中采用的干扰素α结合到聚合物上，例如聚亚烷基二醇(取代的或未取代的)如聚乙二醇上，形成PEG-干扰素α。可用本领域中已知的各种接头完成这种结合，诸如欧洲专利申请EP-A-0510356和A-0593868中公开的那些接头。聚乙二醇的分子量可在300至60000道尔顿之间变化，一种或多种接头、优选一至三种接头结合到干扰素α上。
虽然本发明并不限于特定的聚乙二醇-干扰素α，在一个优选的实施例中，与干扰素α化学结合的聚乙二醇的平均分子量是40000，其中所述的优选的聚乙二醇-干扰素α分子是单一聚乙二醇分子与单一干扰素α分子化学结合的分子。优选的连结方式为通过酰胺键使所述的PEG分子与干扰素α分子连结。
本发明的制剂还可以包括任选的稳定剂，如单糖类及其衍生物和/或二糖类。常用的单糖类有，例如，葡萄糖、果糖、甘露醇等，优选甘露醇；本发明的制剂在冻干前，单糖类的含量为0.1-3％(w/v)，优选0.5％(w/v)。常用的二糖类有，例如，蔗糖、乳糖、海藻糖等，优选海藻糖；本发明的制剂在冻干前，二糖类的含量为0.1-3％(w/v)，优选0.5％(w/v)。
当单糖类和二糖类一起使用时，它们的总含量仍为0.1-3％(w/v)，单糖和二糖含量的比值为0.3-1，优选0.5。
这些单糖和二糖的保护作用，也可能是由于其在冷冻状态下与聚乙二醇-干扰素α共浓缩，起到稀释和保护聚乙二醇-干扰素α的作用，从而防止了聚合；另外，聚乙二醇-干扰素α包含结合的水分子，这些水分子被多元醇置换后可以提高蛋白的稳定性。
本发明的制剂也还可以包括任选的填充剂和/或渗透性调节剂。
填充剂和/或渗透性调节剂，优选甘露醇，但也可以是具有相同作用的其它试剂，如NaCl，甘氨酸，葡聚糖，PVP，羧甲基纤维素等。
本发明的制剂在冻干前，填充剂和/或渗透性调节剂的含量为3-8％(w/v)，优选4.5(w/v)％。
该制剂在冻干前还含有水，如无菌水，生理盐水等等。优选生理盐水。
按照本发明，一种可冻干的聚乙二醇-干扰素α溶液，用于制备本发明冻干制剂。该溶液每ml含有106-108IU、特别是1-18×106(IU)的聚乙二醇-干扰素α；含有谷氨酸1-50mmol，优选为5-20mmol，更优选为10mmol和/或精氨酸5-100mmol，优选为5-30mmol，更优选为15mmol；5-20mM可药用缓冲液，优选乙酸盐缓冲液，优选10mM缓冲液，如乙酸盐缓冲液。
该溶液的pH为pH5.5-6.5之间，优选pH6.0。
该溶液中还含有水，如无菌水，生理盐水等等。优选生理盐水。
优选精氨酸和谷氨酸共用，其中精氨酸和谷氨酸含量的比值为0.5-2.5，优选的比值为1-2，更优选的比值为1.5。
该溶液每ml还可以含有0.1-3％(w/v)，优选0.5％(w/v)的单糖类，优选甘露醇，更优选0.5％(w/v)甘露醇；和/或0.1-3％(w/v)，优选0.5％(w/v)，二糖类，优选海藻糖，更优选0.5％(w/v)海藻糖。
该溶液每ml还可以含有3-8％(w/v)，优选4.5％(w/v)，填充剂和/或渗透性调节剂，优选甘露醇，更优选4.5％(w/v)甘露醇。
本发明还涉及一种聚乙二醇-干扰素α冻干制剂的制备方法。本发明的冻干制剂，可采用常规方法，通过冻干本发明的聚乙二醇-干扰素α溶液得到。可以使用常规冻干装置冷冻干燥保护剂体系和聚乙二醇-干扰素α所共同组成的溶液，其中所使用的冷冻干燥条件是：于-35℃至-55℃低温条件预冷冻2-6小时，然后于-35℃至30℃条件下真空干燥12至24小时。
本发明还涉及一种聚乙二醇-干扰素α冻干制剂的应用方法，包括用水，优选抑菌水，使该冻干制剂溶解生成溶液后再使用。
以下实施例用于进一步阐述本发明。
实施例1
取谷氨酸、精氨酸、甘露醇分别用10mM乙酸盐缓冲液配制，调pH6.0，经过滤除菌，分别配制2-4号保护剂，各浓度如下，其中每号样品均含有1-18×106(IU)，充分混匀后，分装为1ml/瓶，进行冻干保存。冷冻干燥条件是-35℃预冷冻4小时，然后于-35℃至-7℃条件下真空干燥20小时，然后逐渐升温至10℃保持3小时。所使用冻干机是德国Christ ALPHA I6。
1号：1％人血白蛋白；
2号：15mmol精氨酸+0.5％甘露醇+4.5％甘露醇；
3号：10mmol谷氨酸+0.5％甘露醇+4.5％甘露醇；
4号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％甘露醇+4.5％甘露醇；
将样品以水再溶解，同时测定聚乙二醇-干扰素α2b生物活性的和单个聚乙二醇-干扰素α2b的纯度。结果见表1-1和表1-2。表1-1为不同保护剂聚乙二醇-干扰素α2b在4℃保存的稳定性，单位为106IU。表1-2为不同保护剂聚乙二醇-干扰素α2b在25℃保存的稳定性，单位为106IU。
表1-1：不同保护剂下聚乙二醇-干扰素α2b在4℃的稳定性
| 试样 | 0个月 | 6个月 | 12个月 | 18个月 | 24个月 | |
| 1 | 生物活性 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.5 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.7 | 95.5 | 95.8 | 95.6 | 95.5 | |
| 2 | 生物活性 | 1.5 | 1.5 | 1.4 | 1.5 | 1.4 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 96.2 | 96.0 | 95.9 | 96.1 | 95.6 | |
| 3 | 生物活性 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.5 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.2 | 95.0 | 95.2 | 95.3 | 94.9 | |
| 4 | 生物活性 | 1.5 | 1.5 | 1.4 | 1.5 | 1.4 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 96.8 | 96.6 | 96.5 | 96.7 | 96.4 |
表1-2：不同保护剂下聚乙二醇-干扰素α2b在25℃的稳定性
| 试样 | 0个月 | 6个月 | 12个月 | 18个月 | 24个月 | |
| 1 | 生物活性 | 1.5 | 1.5 | 1.3 | 1.2 | 0.9 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.6 | 95.5 | 94.8 | 94.5 | 94.6 | |
| 2 | 生物活性 | 1.5 | 1.4 | 1.1 | 0.9 | 0.7 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.9 | 95.8 | 94.8 | 95.9 | 95.6 | |
| 3 | 生物活性 | 1.5 | 1.5 | 1.2 | 0.9 | 0.7 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 97.1 | 96.9 | 96.8 | 96.3 | 95.9 | |
| 4 | 生物活性 | 1.5 | 1.4 | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 96.8 | 96.5 | 96.6 | 96.3 | 95.8 | |
从以上两表可以看出，四种保护剂在4℃保存二年，聚乙二醇-干扰素α2b的生物学活性不降低，2、3、4号保护剂与1号保护剂比无明显差别，可以完全替代后者。在25℃保存12个月时各号保护剂聚乙二醇-干扰素α2b的生物学活性开始有不同程度下降，4号保护剂稍好于2、3号保护剂。另外，单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度是没有改变的。
实施例2
谷氨酸与精氨酸组合与不同二糖类组合作为冻干保护剂的比较：
分别配制以下几种保护剂，制备方法见实施例1。
2-1号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；
2-2号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％蔗糖+4.5％甘露醇；
2-3号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％甘露醇+0.5％乳糖+4.5％甘露醇。
测定方法同实施例1。结果见表2。表2为不同保护剂聚乙二醇-干扰素在40℃加速试验冻干保存的稳定性，单位为106IU。
表2：不同保护剂下聚乙二醇-干扰素在40℃加速试验的稳定性
| 试样 | 0个月 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 | 5个月 | 6个月 | |
| 2-1 | 生物活性 | 1.5 | 1.5 | 1.6 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.2 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.7 | 95.5 | 95.6 | 95.6 | 95.5 | 95.1 | 94.6 | |
| 2-2 | 生物活性 | 1.5 | 1.6 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.2 | 1.2 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 96.2 | 96.0 | 95.9 | 96.1 | 95.6 | 95.0 | 94.9 | |
| 2-3 | 生物活性 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.6 | 1.4 | 1.1 | 0.8 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.2 | 95.0 | 95.2 | 95.3 | 94.8 | 94.1 | 93.6 | |
从上表可以看出，海藻糖与谷氨酸、精氨酸组合的冻干保护效果好于蔗糖或乳糖与谷氨酸、精氨酸组合的保护效果。同样，单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度也是是没有改变的。
从上述实例可清楚地看出，本发明所提供的制剂，能保持聚乙二醇-干扰素α在冻干过程中和储藏过程中的生物活性和稳定性。
实施例3
按照实施例1中的方法配制以下不同浓度的保护剂，其中每号样品均含有1-18×106(IU)，充分混匀后，分装为1ml/瓶，进行冻干保存。
3-1号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；
3-2号：45mmol精氨酸+30mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；
将样品以水再溶解，同时测定聚乙二醇-干扰素α2b生物活性的和单个聚乙二醇-干扰素α2b的纯度。结果见表3。表3为不同浓度保护剂聚乙二醇-干扰素在40℃加速试验冻干保存的稳定性，单位为106IU。
表3：不同浓度保护剂下聚乙二醇-干扰素在40℃加速试验的稳定性
| 试样 | 0个月 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 | 5个月 | 6个月 | |
| 3-1 | 生物活性 | 1.5 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.5 | 1.4 | 1.2 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.9 | 96.1 | 95.6 | 95.7 | 96.0 | 95.1 | 94.8 | |
| 3-2 | 生物活性 | 1.5 | 1.6 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.5 | 1.3 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 96.2 | 95.8 | 95.9 | 95.0 | 95.8 | 95.6 | 95.0 | |
从上表可以看出，高浓度的保护剂与低浓度保护剂相比，保护效果稍好，但影响不大。
实施例4
按照实施例1中的方法配制以下不同浓度的保护剂，其中每号样品均含有1-18×106(IU)，充分混匀后，分装为1ml/瓶，进行冻干保存。
4-1号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+0.5％海藻糖+4.5％甘露醇；
4-2号：15mmol精氨酸+10mmol谷氨酸+1.5％海藻糖+3.5％甘露醇。
结果见表4。表4为不同浓度保护剂聚乙二醇-干扰素在40℃加速试验冻干保存的稳定性，单位为106IU。
表4：不同浓度保护剂下聚乙二醇-干扰素在40℃加速试验的稳定性
| 试样 | 0个月 | 1个月 | 2个月 | 3个月 | 4个月 | 5个月 | 6个月 | |
| 3-1 | 生物活性 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.2 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 95.8 | 96.1 | 95.6 | 95.7 | 96.0 | 95.1 | 94.8 | |
| 3-2 | 生物活性 | 1.6 | 1.5 | 1.6 | 1.5 | 1.4 | 1.5 | 1.2 |
| 单聚乙二醇-干扰素α2b的纯度(％) | 96.2 | 95.3 | 95.9 | 95.0 | 95.8 | 95.6 | 95.0 | |
从上表可以看出，不同浓度的海藻糖对聚乙二醇-干扰素α2b均有保护效果。
Claims (29)
1.一种聚乙二醇-干扰素α冻干制剂，含有
聚乙二醇-干扰素α，和
一种保护剂，该保护剂为精氨酸，或该保护剂为精氨酸和谷氨酸。
2.权利要求1的冻干制剂，其中该制剂的pH为pH 5.5-6.5，用药用缓冲液调节。
3.权利要求2的冻千制剂，其中该制剂的pH为pH 6.0。
4.权利要求1的冻干制剂，其中该精氨酸和谷氨酸含量的摩尔比为0.5-2.5。
5.权利要求4的冻干制剂，其中该精氨酸和谷氨酸含量的比值为1-2。
6.权利要求5的冻干制剂，其中该精氨酸和谷氨酸含量的比值为1.5。
7.权利要求1-6中任一项所述的冻干制剂，其中所述的制剂含有单糖和/或二糖类；当单糖类和二糖类一起使用时，它们的总含量为0.1-3％(w/v)，单糖和二糖含量的质量比为0.3-1。
8.权利要求7中所述的冻干制剂，其中所述的单糖类为葡萄糖、果糖、甘露醇。
9.权利要求7-8中任一项所述的的冻干制剂，其中所述二糖类为蔗糖、乳糖、海藻糖。
10.权利要求7-9中任一项所述的冻干制剂，在冻干前，单糖类和/或二糖类的含量为0.1-3％(w/v)。
11.权利要求10的冻干制剂，所述二糖为0.5％(w/v)海藻糖。
12.权利要求7-9中任一项所述的冻干制剂，单糖和二糖含量的比值为0.5。
13.权利要求1-12中任一项所述的冻干制剂，其中在冻干前，聚乙二醇—干扰素c的浓度为1-18×106IU/ml；谷氨酸浓度为1-50mmol/ml；精氨酸浓度为5-100mmol/ml。
14.权利要求13的冻干制剂，谷氨酸浓度为5-20mmol/ml。
15.权利要求14的冻干制剂，谷氨酸浓度为10mmol/ml。
16.权利要求13的冻干制剂，精氨酸浓度为5-30mmol/ml。
17.权利要求16的冻干制剂，精氨酸浓度为15mmol/ml。
18.权利要求1-17中任一项所述的冻干制剂，其中在冻干前，该缓冲液为5-20mM乙酸盐缓冲液。
19.权利要求18的冻干制剂，其中缓冲液为10mM乙酸盐缓冲液。
20.权利要求1-18中任一项所述的冻干制剂，其中聚乙二醇-干扰素α的化学结合物，为单一聚乙二醇分子与单一干扰素α分子化学结合物。
21.权利要求20的冻干制剂，所述的聚乙二醇的平均分子量为40000。
22.权利要求1-21中任一项所述的冻干制剂，其中所述的干扰素α是干扰素α2a，干扰素α2b，干扰素α2c或干扰素α1b。
23.权利要求1-21中任一项所述的冻干制剂，其中所述的干扰素α是干扰素α2b。
24.权利要求1-17中任一项所述的冻干制剂，其中该制剂包括填充剂。
25.权利要求24的冻干制剂，其中填充剂为3％-8％(w/v)的甘露醇。
26.权利要求24的冻干制剂，其中填充剂为4.5％(w/v)的甘露醇。
27.权利要求20-21中任一项所述的冻干制剂，其中所述的化学结合物是通过酰胺键使干扰素α2b分子与PEG分子连结的结合物。
28.一种权利要求1所述的聚乙二醇-干扰素α冻干制剂的使用方法，包括用水，使冻干制剂溶解生成溶液后使用。
29.权利要求28的方法，其中所述的水为抑菌水。
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