CN1261373A - 激活目的基因的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了激活目的基因的组合物和方法。该组合物含有一个只有存在靶分子时才表达基因产物的隐藏靶向表达盒。表达盒可用于治疗疾病和防止致瘤细胞增殖。

Description

激活目的基因的组合物和方法

                        相关申请

本申请要求1997年6月25日提交的美国临时申请号60/050,772的优先权。

                      本发明的领域

本发明涉及特别是在靶基因存在下激活目的基因的方法和组合物。

                      本发明的背景

癌症治疗的本质和基本方法一直是变化的。目前，局部癌症治疗后常规是辅助性化疗。现在的临床方案中正在探索基因疗法，免疫系统操纵，正常造血因子的激活，在肿瘤组织中诱导分化，以及血管形成的抑制。这些新领域的研究已经用于非恶性疾病。

同时，新的临床方案有狭窄的治疗指数并且有很大可能导致有害的副作用。完整的理解药理学，药物相互作用，及临床药物动力学对于安全和有效的用于人体是必需的。

病毒感染的治疗正处于萌芽阶段。典型的使用药物诸如利用了感染的生物体与其宿主代谢的差别的抗生素来治疗细菌感染。然而，病毒大部分使用宿主自身的酶完成复制，从而很少有机会进行药物干涉。通过使用强调节元件，病毒利用宿主基因实现其自身基因的转录和翻译。

在哺乳动物中，天然的由细胞毒性T-淋巴细胞对抗病毒感染，它在宿主细胞表面表达时识别病毒蛋白质，并裂解感染的细胞。破坏感染的细胞阻止了病毒的进一步复制。其它的防御包括表达抑制蛋白质合成和病毒芽殖的干扰素，以及表达从体液中清除游离病毒颗粒的抗体。但是，这些天然机制的诱导需要将病毒蛋白质暴露于免疫系统。许多病毒显示休眠或潜伏期，在此时期很少或不进行蛋白质合成。在这种时期对免疫系统而言病毒感染实际上是不可见的。

逆转录病毒具有RNA链的基因组感染形式。感染时，RNA基因组反转成DNA，典型地随后在随机位点整合到宿主染色体DNA。当整合发生在截短的编码关键的细胞受体或生长因子的位点，或将这类基因置于强病毒顺式作用调节元件的控制下，将导致细胞转化成恶性状态。

由于它们的反式作用调节元件对宿主调节序列的作用，病毒可能是致癌的。事实上，致癌性是导致发现第一个已知感染人体的逆转录病毒的特征。在感染成人T-细胞白血病(ATL)病人的血细胞中鉴定了HTLV-I和HTLV-II(人嗜T-淋巴细胞病毒I和II)，相信通过它们的反式激活因子对淋巴细胞启动子区域的作用诱导致瘤性转化。亦发现另外两种逆转录病毒感染人体。这些病毒，HIV-I和HIV-II，是爱滋病的病原体。

现在对HIV感染的治疗方法包括叫作蛋白酶抑制剂的新药物。当与其它抗病毒复合物诸如AZT一起使用时，这些药物能显著降低血液中HIV水平。同时，在免疫系统防御多肽分子中叫作趋化因子的天然武器显示出是HIV的颈敌。

反义寡聚脱氧核苷酸已经推荐为重要的一类新药物。简言之，反义是指使用类似单链DNA的小的合成的寡核苷酸抑制基因表达。基因表达是依据Watson-Crick碱基配对即腺嘌呤和胸腺嘧啶或者鸟嘌呤与胞嘧啶通过氢键相互作用通过与特定靶信使RNA(mRNA)中编码(有义)序列的杂交实现抑制的。

依据控制反义寡聚脱氧核苷酸和细胞RNA相互作用的简单碱基配对法则，可以设计靶向任何已知序列基因的分子。这种策略的主要优势在于作用的潜在特异性。理论上，可以设计靶向整个人类基因组中任何单个基因的反义分子，可能制造出已知致病基因的任何疾病的专一性药物。结果是，存在多种反义寡聚脱氧核苷酸(ODN)活性的应用物用于可能的抗病毒和抗癌应用。

反义ODN提供了阻碍细胞中特定基因表达的可能性。虽然有许多在培养细胞中明显反义抑制基因表达的报道，但只在很少的情况下严格证明了专一性抑制。在许多研究中，专一性是从反义的生物学作用与对照ODN的比较推导的，没有测定靶RNA或蛋白质的水平来评价专一性。反义技术不想要的副反应可能通过多种机制发生。

目前正在认真研究寡聚核苷酸作为基因表达调节子的可能性。多数的努力集中于抑制诸如癌基因或病毒基因等靶基因的表达。寡聚核苷酸靶向RNA(反义寡核苷酸)或DNA，形成三链结构抑制RNA聚合酶II的转录。为了达到所需的作用，寡核苷酸必须通过有效防止其从头合成来促进先存的不需要的蛋白质的衰变。

因而需要开发比以前研究所用方法更有效，可靠和特异的新反义方法。

                        本发明的总结

提供了激活目的基因表达的组合物和方法。组合物是含有双链核苷酸序列的反义隐藏表达盒。第一条链含有一段伸出臂的(armed)表达盒，即连接在侧翼序列下游的编码目的蛋白质的RNA分子并且在RNA序列上游可操作的插入翻译起始点。侧翼序列编码靶分子。也就是说，侧翼序列编码靶基因或编码感兴趣的RNA。侧翼序列对应于靶的“有义”链。同时提供了能与第一条核苷酸序列的侧翼序列杂交的第二条核苷酸链，即反义链。结合时反义链掩盖了翻译起始点。可设计侧翼序列使反义序列与侧翼序列没有100％同源性。这样，存在靶核苷酸分子时，反义链倾向于与靶互补结合。此时，反义链从伸出臂的链解离并与靶配对。反义链的解离暴露出核糖体结合位点使伸出臂的盒在靶的存在下翻译。

发现该组合物可用于调节基因表达，治疗疾病，以及阻止致瘤细胞的增殖。另外，该组合物在植物和动物学应用中也可广泛使用。

                    附图的简要说明

图1提供了作为抗病毒药物的掩藏靶向表达盒的示意图。

图2提供了有义链靶序列与反义链完全互补的掩藏靶向表达盒的示意图。

图3提供了具有用于增加靶特异性的多联体几何结构的掩藏表达盒的示意图。

图4提供了具有需要定量阈值的靶分子以起始所需基因翻译的多联体几何结构的掩藏靶向表达盒的示意图。

图5提供了增加紧凑度和降低粘度的环状掩藏靶向表达盒的示意图。

图6提供了增加紧凑度的茎环掩藏靶向表达系统的示意图。

图7提供了产生靶向盒有义链的构建体实施例。

图8提供了使用掩藏靶向表达盒的体外实验的示意图。

                        本发明的详细描述

后面将参照优选实施方案更完整的描述本发明。本发明可通过不同形式实施而不应认为限于此处叙述的实施方案；更确切地，提供的实施方案是使本公开物将本发明的范围传递给本技术领域熟练人员。

提供了控制目的基因表达的组合物和方法。通过使用与靶分子反义的寡核苷酸调节表达。此方式下，目的基因只在对应于靶分子的RNA或DNA存在时表达。

该方法涉及使用一种反义掩藏表达盒。反义掩藏表达盒设计为双链核酸分子。第一条链含有连接到侧翼序列下游的目的蛋白质的RNA分子。侧翼序列含有一段靶基因部分有义序列的核苷酸序列。第一条链还在侧翼序列下游含有一个翻译起始点。需要认识到插入核糖体结合位点的部位可以是变化的。可选地，可包括7个甲基鸟嘌呤帽子以稳定分子。参看图1。

掩藏表达盒的第二条链含有对应于靶基因或序列的反义寡核苷酸。也就是说，反义序列至少部分与侧翼序列包含的靶序列互补。反义寡核苷酸可以是RNA分子，DNA分子或其混合物。第二条反义链与第一条链的相应侧翼序列结合形成的双链体排斥了对下游序列包括翻译起始点，目的序列或两者都有的核糖体扫描。因而，通过反义链与侧翼序列的结合掩藏了目的蛋白质的翻译和表达。从侧翼序列置换反义链中断对目的蛋白质表达和翻译的掩藏。

目的蛋白质可依据组合物的用途变化。例如，当掩藏盒示意图作为抑制致瘤细胞生长的机制时，目的蛋白质可选自毒素蛋白质，细胞因子，细胞调节子，或类似物。另外，RNA分子可以是非编码RNA，诸如具有RNA酶活性的RNA。

已知多种毒素蛋白质可用于本发明。它们包括核糖体灭活剂，假单胞杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)(Chandhary等，(1990)生物化学杂志(J.Biol.Chem)265：16303-16310)；细胞代谢破坏剂，诸如核糖核酸酶(参看例如，Mariani等，(1990)自然(Nature)347：737-741)；芽胞杆菌RNA酶毒素(Barnase toxin)，从假单胞杆菌外毒素A和核糖核酸酶衍生的嵌合毒素(Prior等，(1990)，细胞(Cell)64；1017-1023)；百日咳毒素(Pertussis)(接收号M14378M16494，Micosia等(1986)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：4631-4635)；霍乱毒素(Cholera)(Dams等，(1991)生化与生物物理学报(Biochim，Biophys，Acta)1090：139-141)；白喉毒素(Diphtheria)，蓖麻毒素(Gelfand等，EP 0335476-A2)；等等。另外，来自疱疹序列的胞腺嘧啶激酶可用作毒素或效应分子。在细胞内的转录使它对9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(gancyclovir)敏感。这样，可标记目的细胞并随后在两步系统中破坏细胞。

可使用含有上述毒素序列的掩藏盒靶向和破坏任何细胞，器官，生物体或物种；前提是可鉴定出对这些细胞器官，生物体或物种特异的靶序列。例如，可使用表达盒选择性靶向和消灭脊椎动物环境。有害动物。这类有害动物包括农业有害动物包括澳大利亚的狐狸和野兔。

可使用盒选择性破坏感染病毒的细胞。在这一方面，靶序列包含病毒特异性序列，而目的蛋白质是如上所述的毒素。

掩藏盒可用于治疗多种疾病。这类疾病包括，但不限于涉及过度活化器官诸如亢进活性的甲状腺的疾病。在这一方面，掩藏盒包括一段甲状腺特异性靶序列和如上所述的蛋白质毒素。

这种盒可用于治疗涉及缺陷基因的疾病。在这一方面，靶序列含有缺陷mRNA序列，而目的序列含有正常蛋白质序列。想得到的效应是双重的。反义链与缺陷mRNA的结合可停止缺陷蛋白质的产生，而目的序列的表达导致正常蛋白质的产生。

这种盒可用于在缺乏某蛋白质的器官中产生目的蛋白质。在这一方面，靶序列含有器官特异性序列，而目的序列含有该器官中缺乏的蛋白质的序列。

本发明亦可用于测定靶分子存在的检测系统。在这种情况下目的蛋白质将是一种易于通过例如简单的细胞染色或酶检测测定的报告蛋白质。这类报告序列包括但不限于β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，葡糖醛酸酶(GUS)，等等。

盒中亦包括一个翻译起始点。这类序列在本技术领域为人熟知并且包括Kozak序列。参看例如，Kozak，Marilyn(1988)分子和细胞生物学(Mol.andCell Biol.)，8：2737-2744；Kozak，Marilyn(1991)生物化学杂志(J.Biol，Chem)，266：19867-19870；Kozak，Marilyn(1990)美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.USA)，87：8301-8305；Kozak，Marilyn(1989)细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)，108：229-241；以及它们引用的文献。这些文献并于此处。

可将翻译起始点插入到对应于目的基因的序列的上游。可将Kozak序列设计为能在所有3个阅读框起始翻译。参看例如，Murphy和Efstratiadias(1987)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，84：8277-8281。通常，Kozak序列将包含识别为在高等真核生物中的起始的共有序列。这种共有序列是GCCGCCAGCCAUGG。在Kozak序列中这种共有序列重复多次，以提供在所有三种阅读框中的翻译起始。

Kozak序列的长度是可变的。一般而言，增加前导序列的长度增强翻译。

已认识到在适当时候亦可使用原核翻译起始点；例如靶向原核生物时。这类序列包括Shine-Dalgamo序列(UAAGGAGG)，典型地在起始子AUG上游5-10个碱基。

侧翼序列含有对应于靶基因或序列的一段序列。也就是说，侧翼序列包括靶分子的全部或部分有义链并且可能是RNA或DNA。有义链意思是指能与反义部分杂交的序列，该反义部分当靶是基因时能够与靶表达的信使RNA杂交或与靶RNA或DNA分子杂交。

侧翼序列长度可变。已认识到其长度可根据靶基因的长度和丰度，以及反义部分对靶的特异性和亲合性而变化。可使用的侧翼序列的长度通常在大约10至大约200核苷酸，优选地大约20至大约150核苷酸，更优选地大约40至大约100核苷酸范围变化。

侧翼序列可以是天然存在的或合成的序列。当序列是合成的，可在结构中掺入错配核苷酸，以促进靶分子对反义分子的热力学取代。已认识到如果将翻译起始点插入到侧翼序列，这种序列插入将提供非杂交序列并进一步降低侧翼序列和反义寡核苷酸之间的同源性。虽然认识到高至100％的同源性可与设计的反义链从侧翼序列的置换相兼容，但通常预设低于90％的同源性，优选地大约75％同源性，更优选地大约65％同源性。

已知7-甲基鸟嘌呤(TMeG)帽子增加翻译的效率。因而，可在侧翼序列的5′端包括这样一个7-甲基鸟嘌呤帽子。参看例如，Shatikin，A.J.(1976)细胞(Cell)，9：645-653；Malone等(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86：6077-6081；Fuerst和Mossc 1989)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，206：333-348和Kozcok，Marilyn(1991)基因表达(GeneExpression)，1：117-125。

本发明表达盒反义序列的构建是为了与目的核苷酸序列杂交。这类目的核苷酸序列包括来自靶基因的信使RNA，病毒RNA或DNA等等。反义链构建为与靶同源。通常，这种同源性高于反义链与侧翼序列的同源性。因而，存在靶分子时，反义链从盒的侧翼序列取代并与靶分子杂交。为了增强取代，盒可构建为反义序列比侧翼序列长，提供3′或5′不配对突出端或“粘末端”与靶分子结合。此粘末端将增强反义寡核苷酸的替换。

如上面讨论，靶分子是可变的。为了治疗恶性或致瘤细胞生长，靶分子将对应于只在致瘤细胞表达或存在的核苷酸。这种情况下，表达盒的目的序列将编码一种毒素蛋白质，它在靶存在时表达以杀死细胞。表达盒也可编码一种细胞因子或干扰素来对抗肿瘤性生长。有些情况下，可提供编码不同蛋白质的表达盒的组合。靶分子可以是基因。本技术领域已知多种靶基因。这类基因包括c-myc，n-myc，c-myb，c-abl，c-kit，c-mos，bcr-abl，bcl-2，成视网膜细胞瘤-1(retinoblastoma-1)，P-53，GM-CSF，G-CSF，Ick，IGF-1，egr-1(A.Krieg，免疫方法(Immuno Methods)1，191(1992))；c-fes CS.Ferrari等，细胞生长分化(Cell Growth Differ.)1，543(1990))；c-fms(J.Wu等，癌基因(Oncogene)5,873(1990))；c-fos(A.Block等，in(77).PP.63-70)；N-ras(T.Skorski等，实验药物杂志(J.Exp.Med.)175，743(1992))；Ha-ras(T.Saison-Behmoaras等，EMBO J.MD.，1111(1991))；B-myb(M.Arsura等，血液(Blood)79，2708(1992))；CSF-1(M.Birchenall-Roberts等，免疫学杂志(J.Immunol.)145，3290(1990)；Myeloblastin(D.Bories等，细胞(Cell)59，959(1988)；红细胞生成素基因(Erythropoietin)(O.Hermine等，血液(Blood)78，2253(1991))；MZF-1(L′.Bavisotto等，实验药物杂志(J.Exp.Med.)174，1097(1991)；mdr 1(L.Rivoltini等，Int.J.Cancer 46，727(1990)；IGF-1受体(P.Porcu等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)12，5069(1992))；生长激素(P.Weinent，J.Blalock，R，LeBoeuff，内分泌学(Endocrinology)128，2053(1991))；EGR-1(L，Neyses，JNouskas，H.Vetter，生化生物物理研究通讯(BiochemBiophys.Res.Commun.)181，22(1991))；G蛋白质(Supra(1992))；MHC-1#(M.Cambe等，抗癌药物设计(Anti-Cancer Prug Des.7 7,341(1992))；血紧张素原基因(Angiotensinogen)(J.Cook等，反义研究开发(Antisense Res.Dev.)2，199(1992)；Myogenin(A.Brunetti等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265，13435(1990))；LH受体^**(A.West和B.Cooke，分子细胞内分泌学(Moll.Cell.Endocrinol.179，R9(1991))；细胞视黄醇结合蛋白I，F.Cope，J.Wille，L.D.Tomei，in(77)，PP.125-142；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(A.Witsell和L.Schook，英国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)89，4754(1992))。

靶分子包括但不限于CD4基因，参看接收号X87579；CFTR基因(Varon等(1995)人类分子遗传(Hum.Mol.Genet)4：1463-1464)；人C3d/Epstein-Barr病毒受体(Fujisaku等，U989)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：2118-2125)；人主要组织相容性复合体I CD8 α-链基因(接收号M27 161，Nakayama等(1989)免疫遗传学(Immunogenetics)30：393-397；人弹性蛋白酶2mRNA(接收号M16631)，Fletcher等(1987)生物化学(Biochemistry)26：7256-7261)；人弹性蛋白mRNA(接收号M36860，Fazio等，(1988)J.Invest.Dermatol，91：458-464)；人细胞间粘附分子1基因(接收号U86814)；人白介素1-β转变酶同I βmRNA(接收号U13697 Alnemri等(1998)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：4312-4317)；人免疫球蛋白Cmu-Cdelta基因座(接收号X57331，Word等(1989)Int.Immunoll：296-309)；人白介素2基因(接收号J00264，Maeda等(1983)生化与生物物理研究通讯(Biochem，Biophys，Res.Commun.)115：1040-1047；Fujita等(1983)美国国家科学院院刊(Proc，Natl，Acad.Sci.USA80：7437-7441)；人主要组织相容性复合体I抗原人类白细胞抗原-B(接收号U88407)；人主要组织相容性复合体II人类白细胞抗原-DPA1抗原(接收号U87556)；等等，以参考文献并于此处。

类似地，靶分子可以是来自病毒的RNA或DNA。在这种状况下可抑制病毒复制和生长。这类病毒基因包括但不限于来自下列病毒的序列，柯萨奇病毒(Marquardt和Ohlinger(1995)病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)53：189-199)；登草热病毒，参看接收号U88535；脑炎病毒，参看接收号AB001026；埃博拉病毒(Sanchez等(1989)病毒学(Virology)170：81-91，接收号L11365)；非淋淋巴细胞瘤病毒(Baer等(1984)自然(Nature)310：207-211)；埃可病毒32(Huttunen等(1996)J.Gen.Virol.77：715-725)；肠道病毒(VP4-VP2衣壳3DRNA聚合酶基因Pulli等(1995)病毒学(Virology)212：30-38)；甲型流感病毒(Guan等，(1996)病毒学杂志(J.Virol.)70：8041-8046)；乙肝病毒(Fukuda等(1995)传染性疾病杂志(J.Infect.Dis.)172：1191-1197)；丙肝病毒(Hitomi等(1995))病毒免疫学(Viral Immunol.)8：109-119)；D型肝炎病毒(Khudyakov等(1993)病毒研究(Virus Res.)27：13-247；E型肝炎病毒(Tam等(1990)科学(Science)247：1335-1449，接收号M32400)；G型肝炎病毒(接收号U86023)；人免疫缺陷病毒(接收号U04908，Gao等(1996)病毒学杂志(J.Virol)70：1651-1667)；人乳头瘤病毒(接收号U37537，Wu等(1993)Lancet 341：522-524)；甲型流感病毒(接收号U86987)；人鼻病毒(接收号D00239，Hughes等(1988)J.Gen.Virol.69：49-58)；仙台病毒(接收号D00053，Morgan和RakeStraw(1986)病毒学(Virology)154：31-40)胃肠炎病毒TFI病毒粒子蛋白质基因(接收号Z35758；Chen等(1995)病毒研究(Virus Res.)38：83-89)；单纯疱疹2型病毒(接收号Z86099，Mc Geoch等(1987)J.Gen Vird.68：19-38)；委内瑞拉马脑炎病毒(接收号L01442，Kinney等(1986)病毒学(Virology)152：400-413)；以参考文献并于此处。

其它目的基因包括例如巨细胞病毒的.jun，bFGF，wnt-1，TGF-beta，spi-1；单纯疱疹病毒1型和2型的NDR，c-erbB-2；人乳头瘤病毒的bcl-2和bci-abl；乙肝的P53和c-myb；流感病毒的l-myc和ras；等等。

构建掩藏表达盒的方法一般是本技术领域现有的。参看例如Sambrook等，冷泉港，纽约。可依据已知技术制备RNA/DNA分子以及反义寡核苷酸。参看例如美国专利号5,149,797；5,175,273；Uhlmann和Peyman(1990)Chem.Rev.，90：543-584及它们引用的文献。反义寡核苷酸是能与靶分子互补结合的脱氧核糖核酸或核糖核酸。这种反义寡核苷酸可能是至少一个或所有核苷酸间桥联磷酸酯残基是修饰的磷酸酯，诸如膦酸甲酯，硫代膦酸甲脂，吗啉磷酸酯(phosphoromorpholidates)，哌嗪磷酸酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯。举例，某些例如每隔一个的核苷酸间桥联磷酸酯残基可以是如上所述修饰的。在另一个例子中，这种反义寡核苷酸是至少一个或全部核苷酸含有2′-低级烷基组分(例如C1-C4，线性或分枝，饱和或不饱和烷基，诸如甲基，乙基，乙烯基，丙基，1-丙烯基，2-丙烯基，和异丙基)的核苷酸。亦可参看Furdon等(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)，17：9193-9204；Agrawal等(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，87：1401-1405；Baker等(1990)核酸研究(Nucleic Acids Res.)，18：3537-3543；Sproat等(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)，17：3373-3389；Walder和Walder(1988)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，85：5011-5015。

磷酸二酯骨架的修饰显示赋予稳定性并且可能提供增强的亲合性以及增强ODN的细胞穿入。另外，可利用化学方案用新的连接取代整个磷酸二酯骨架。可通过自动ODN合成制备硫代磷酸脂和膦酸甲脂修饰的ODN。

可以合成二硫代磷酸脂形式的硫代磷酸脂。在二硫代酯连接中，非桥联的氧原子可由硫取代。这种连接是高度抗核酸酶的。

亦可使用糖修饰增强分子的稳定性和亲合性。与天然β-异头物相比，2′-脱氧核糖糖的α-异头物的碱基翻转。含有α-异头物糖的ODN对核酸酶降解是抗性的。

如果需要，可修饰靶向盒来增加体内稳定性。因而，可使用抗核酸酶寡核苷酸，诸如PS和MP寡核苷酸。参看例如，Miller，P.(1991)生物技术(Biotechnology)，9：358和Stein等(1991)药物治疗(Pharmacol Ther.)，52：365。

可以容易和大量的合成本发明的靶向表达盒。亚磷酰胺化学的发展及其精心制成自动技术大大加强了用它合成寡聚物的容易程度并从而容易获得它们。参看例如，Beaucage和Caruthers(1981)Tetra hedron Lett.，37：3557以及Zon和Geiser(1991)抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Des.)，6：539。

本发明的方法，寡核苷酸和制剂有多种用途。它们可用于阻止致瘤细胞的增殖和生长。本发明的方法，寡核苷酸和组合物亦可在治疗疾病中用作治疗药物。亦发现他们可用于需要一种调节需在特定时间或任何所需时期表达的基因的表达的方法的发酵工艺中来调节基因表达。

术语“反义寡核苷酸”包括其生理和药物可接受盐类：即保持亲本化合物的所需要的生物学活性并且不引入不需要的毒理效应的盐。这类盐的例子是(a)与阳离子诸如钠，钾，亚精胺等形成的盐；(b)与无机酸例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸诸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，顺丁烯二酸，反丁烯二酸，葡糖酸，柠檬酸，苹果酸，抗坏血酸，安息香酸，丹宁酸，棕榈酸，褐藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，甲磺酸，对-甲苯磺酸，萘二磺酸，聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)等等形成的盐；以及(d)从元素阴离子诸如氯，溴，碘形成的盐。

本发明的制剂将掩藏盒包含在生理或药物学可接受载体诸如水溶液载体中。因此，本发明中使用的制剂包括但不限于那些适于非肠道用药，包括皮下，皮内，肌肉内，静脉内和动脉内用药，以及局部用药(即可吸入颗粒的气雾化制剂对囊纤维化病人肺的用药)的制剂。制剂可方便地制成单位剂量形式并且可由本技术领域任何熟知方法制备。这类剂型描述于例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences 19th ed.，Osol，A.(ed.)，Mack EastonPA(1980)。一在任何情况下最合适的用药途径依赖于对象，要治疗的状况的性质和严重性，以及要使用的特定活性组合物。

本发明提供了使用具有上面陈述的特征的靶向掩藏盒制备的治疗不同疾病的药物。在依据本发明的药物制造中，典型地将掩藏盒与可接受载体等其它组分混合。当然，载体必须与制剂中其它组分相容并且必须对病人无害。载体可以是固体或液体。可在本发明制剂中掺入一种或多种寡核苷酸，制剂是通过制药业任何熟知技术包括实质上混合各组分，可选地包括一种或多种附属治疗成分来制备的。

本发明的制剂可包含活性组合物的无菌水溶液和非水溶液注射液，该制剂优选地与预期受体血液等渗并基本不含热原。这些制剂可含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂以及使制剂与预期受体血液等渗的溶质。水溶液和非水溶液无菌悬浮液可包括悬浮剂和增浓剂。制剂可以是含单位剂量或多剂量形式存在，例如密封的安瓿管和小瓶，并且可以保存在只需在使用前加入无菌溶液载体，例如注射用盐或水的冻干状态。

在制剂中靶向盒可包含在脂粒子或囊泡中，诸如适于非肠胃用药的脂质体或微晶。只要其中含有靶向盒，颗粒可以是任何适当的结构，诸如单层或多层的。带正电的脂诸如N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸甲酯，或“DOTAP”对这类颗粒和囊泡是特别优选的。这类脂颗粒的制备是众所周知的。参看例如美国专利号4,880,635，Janoff等；4,906,477，Kurono等；4,911,928，Wallach；4,917,951，Wallach；4,920,016，Allen等；4,921,757，Wheatley等；等等。

靶向盒的用药剂量将依赖于使用的特定方法，并且当用于病体时，将依赖于疾病，病体状况，特定剂型，用药途径等等。一般而言，需要的细胞内盒浓度从.05至50μm，或更特定地.2至5μm。向病体诸如人体用药时，使用的剂量从大约.01，.1，或1mg/kg至50，100，或150mg/kg。

现在的技术仅集中于反义分子。在细胞中反义寡核苷酸结合犯错的RNA分子。为了有效，必须向各细胞传送高剂量的反义分子。本发明提供了一种增强反义技术效能的效应分子。这种情况下，可更容易地操纵细胞并且更低的剂量，潜在地甚至1个细胞1个分子的比率可以有效。

是特异性的思想提供了本发明的潜在特征。用于诸如肿瘤疾病等病况的标准细胞毒性化疗充满了系统毒性。毒性剂量与治疗剂量的比率相当低，反映了在化疗药物影响了大量细胞靶以及药物不能区分正常和疾病细胞。理论上，可以通过利用Watson-Crick碱基对形成所传递的特异性确认适当的靶来解决这个问题。

下列实验是以说明而不是限制的方式提供的。

                            实验使用靶向盒杀死致瘤细胞

根据本质上是上述的方法，构建了第一链含有编码毒素A的RNA的靶向盒。毒素RNA上游连接编码p53DNA序列有义部分的DNA序列。在多种癌细胞中发现了p53蛋白质。在p53分子中插入了Kozak序列。对应于p53有义核苷酸构建了反义结构。

在药物可接受溶液中以从大约.01，.1或1mg/kg至50,100，或150mg/kg的浓度提供了靶向盒。将靶向盒用作抗病毒药物

图1描绘了将掩藏靶向表达盒用作抗病毒药物(黑RNA药物(Black RNADrug))。由提供的要点确认盒的特征。有义链在其5′末端具有7meG帽子。在灭活形式中，反义链与有义链侧翼序列杂交；这样Kozak序列被掩藏。Kozak序列和反义链之间的错配区域通过缺乏氢键表示。出现与反义链完全同源的活性病毒RNA时，反义链从有义链解离并结合病毒RNA，使病毒RNA失活。进一步，随着反义链的解离，暴露出Kozak序列从而使毒素蛋白质从AUG起始密码子开始翻译。产生毒性量的成熟毒素时，破坏宿有病毒的细胞。具有完全互补的反义和侧翼序列的靶向盒

图2描绘了有义链病毒靶序列与反义链完全互补的掩藏靶向表达盒。在灭活靶向盒中，核糖体组装和从5′末端的扫描被反义链和侧翼序列的双链阻止。在此实施例中，可通过检测β-半乳糖苷酶活性来测试反义链的取代及目的基因(lacz)的活性表达。具有增强的靶特异性的靶向盒

图3描绘了用于增强靶特异性以起始目的基因翻译的具有多联体几何结构的掩藏靶向表达盒。每一反义/有义组合(1-3)对应不同靶序列。例如，1应于病毒RNA，2应于细胞因子RNA，3应于宿主特异性蛋白质。只有在靶细胞中存在所有3种靶序列，从盒的有义链有效取代所有3种反义序列，从而使核糖体组装并从5′末端扫描至Kozak序列和AUG起始密码子时，才能表达编码目的蛋白质的RNA。具有靶定量阈值的靶向盒

图4描绘了具有需要定量阈值以起始翻译的多联体几何结构的掩藏靶向表达盒。所有的有义/反义组合(1-3)对应相同的靶RNA。在靶细胞中只有存在足够量(此实施例中3个拷贝)靶RNA，从盒的有义序列有效替换所有3个反义序列，从而使核糖体组装并从5′末端扫描至Kozak序列和AUG起始密码子时，才能表达编码目的蛋白质的RNA。因而多联体几何结构需要阈值量的靶RNA起始翻译。这种多联体盒构建体特别适用于靶向具有不正常的高拷贝数特定mRNA的癌细胞。该构建体也可与图3的构建体组合制成。环状靶向盒

图5描绘了环状掩藏靶向表达盒。

与靶分子互补的反义分子与靶向表达盒3′和5′末端的互补序列结合，从而阻止核糖体组装和从5′末端的扫描。这样，在互补靶分子存在时反义链的替代能使目的蛋白翻译和表达。环状构型可能更紧凑和低粘度，从而具有药物传递使用所需的特别特性。茎环靶向盒

图6描绘了茎环掩藏靶向表达盒。与靶分子互补的反义分子与环结构内的互补序列结合，进一步稳定了茎环结构。通过复合体的稳定二级结构阻止了核糖体从5′末端至Kozak序列和起始AUG密码子的扫描。互补靶分子存在时反义链的替代使茎环结构稳定性降低，不能阻止从5′末端开始的核糖体扫描。图7：伸出臂的有义链质粒构建体

图7描绘了用于产生靶向表达盒有义RNA链的pCI-Neo(Promega公司)质粒构建体。描绘的MCS-Kozak-lacZ的全序列陈列于序列1。将对应于部分萤火虫萤光素酶mRNA的可替换的侧翼序列插入到多克隆位点(MCS)，这样从T₇启动子的转录产生的RNA从5′末端含有萤光素酶片段-Kozak-β gal。可替代的萤光素酶有义片段陈列于序列2，3，4，5，6，7或8。图8体外测定掩藏靶向表达盒的活性

使用Riboprobe^组合系统(目录号P1450，Promega公司)，通过图7所示构建体的体外转录产生了掩藏靶向盒的有义链RNA。

对应于部分靶分子(萤火虫荧光素酶RNA，目录号L4561，Promega公司)的反义序列与互补的靶向盒有义链侧翼序列杂交。序列2，3，4，5，6，7或8分别列出可替代的侧翼序列，序列9，10，11，12，13，14或15分别列出对应的反义序列。制备侧翼有义序列和相应反义序列所依据的全长萤火虫荧光素酶RNA列于序列16。将杂交的混合物引入含有核糖体和全长萤火虫萤光素酶RNA(Flex^，兔网织红细胞裂解物系统，目录号L4540，Promega公司)的体外翻译混合物中。对照反应没有掩藏盒。

翻译完成后，检测混合物的β-半乳糖苷酶(β-gal)和萤光素酶活性。阴性萤光素酶和阳性β-gal活性表示成功的抑制了靶分子并成功的表达了目的基因。

示意图描绘了检测机理。图框1中，反义序列结合到互补的靶向盒的侧翼序列。反义/有义双链阻碍了核糖体从5′末端开始的扫描，从而阻止了β-galRNA的翻译。取代和反义对靶萤光素酶RNA的结合(图框2)具有双重效应(图框3)。从暴露的盒可表达β-gal(β-gal阳性)并且通过反义与靶的结合阻止了靶的表达(萤光素酶阴性)。

本技术领域熟练技术人员将会想到与本发明有关的得益于此处展示教程的本发明的其它修改和实施方案。因而，必须知道本发明不限于公开的特定实施方案。虽然使用了特定的术语，但仅以通常和描述意义使用它们而不是为了限制，而修改和实施方案预计包括在附录的权利要求书的范围中。

                        序列表(1)一般资料：

(i)申请人：Black Jr.，Charles A.

(ii)发明的题目：激活目的基因的组合物和方法

(iii)序列数：16

(iv)通讯地址：

    (A)收信人：W.Murray Spruill

    (B)街道：3605 Glenwood Ave.Suite 310

    (C)城市：Raleigh

    (D)州：NC

    (E)国家：美国

    (F)邮编：27622

(v)计算机可读形式：

    (A)媒介类型：软盘

    (B)计算机：IBM兼容PC

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release # 1.0，版本 # 1.30

(vi)当前申请资料：

    (A)申请号：

    (B)填表日期

    (C)分类：

(vii)律师/代理人资料

    (A)名字：Spruill，W.Murray

    (B)登记号：32,943

    (C)参考/大纲号：5722-2

(ix)电讯资料：

    (A)电话：919 420 2202

    (B)电传：919 881 3175(2)序列资料1：

(1)序列特征：

    (A)长度：4279碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“重组分子(多克隆位点/Kozack序列/LacZ基因)”(ix)特征：

    (A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)

    (B)位置：1..64

    (D)其它资料：/产物＝“多克隆位点”

(ix)特征：

    (A)名称/关键词：混合特征

    (B)位置：65..79

    (D)其它资料：/功能＝“翻译起始点共有序列”

    /产物＝“Kozack序列”

(ix)特征：

    (A)名称/关键词：主要转录物(prim_transcript)

    (B)位置：80..4279

    (D)其它资料：/基因＝“LacZ”

    /标准名称＝“β半乳糖苷酶”

(xi)序列描述：序列1：TTAATACGAC TCACTATAGG CTAGCCTCGA GAATTCACGC GTGGTACCTC TAGAGTCGAC     60CCGGGCCGCC GCCACCATGG CGCAGCACCA TGGCCTGAAA TAACCTCTGA AAGAGGAACT    120TGGTTAGGTA CCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT    180GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA    240GCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT    300CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG    360CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC    420GAGGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA    480GGCTTTTGCA AAAAGCTTGG GATCTCTATA ATCTCGCGCA ACCTATTTTC CCCTCGAACA    540CTTTTTAAGC CGTAGATAAA CAGGCTGGGA CACTTCACAT GAGCGAAAAA TACATCGTCA    600CCTGGGACAT GTTGCAGATC CATGCACGTA AACTCGCAAG CCGACTGATG CCTTCTGAAC    660AATGGAAAGG CATTATTGCC GTAAGCCGTG GCGGTCTGGT ACCGGTGGGT GAAGACCAGA       720AACAGCACCT CGAACTGAGC CGCGATATTG CCCAGCGTTT CAACGCGCTG TATGGCGAGA       780TCGATCCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC       840GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC       900GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGCG CTTTGCCTGG TTTCCGGCAC       960CAGAAGCGGT GCCGGAAAGC TGGCTGGAGT GCGATCTTCC TGAGGCCGAT ACTGTCGTCG      1020TCCCCTCAAA CTGGCAGATG CACGGTTACG ATGCGCCCAT CTACACCAAC GTAACCTATC      1080CCATTACGGT CAATCCGCCG TTTGTTCCCA CGGAGAATCC GACGGGTTGT TACTCGCTCA      1140CATTTAATGT TGATGAAAGC TGGCTACAGG AAGGCCAGAC GCGAATTATT TTTGATGGCG      1200TTAACTCGGC GTTTCATCTG TGGTGCAACG GGCGCTGGGT CGGTTACGGC CAGGACAGTC      1260GTTTGCCGTC TGAATTTGAC CTGAGCGCAT TTTTACGCGC CGGAGAAAAC CGCCTCGCGG      1320TGATGGTGCT GCGTTGGAGT GACGGCAGTT ATCTGGAAGA TCAGGATATG TGGCGGATGA      1380GCGGCATTTT CCGTGACGTC TCGTTGCTGC ATAAACCGAC TACACAAATC AGCGATTTCC      1440ATGTTGCCAC TCGCTTTAAT GATGATTTCA GCCGCGCTGT ACTGGAGGCT GAAGTTCAGA      1500TGTGCGGCGA GTTGCGTGAC TACCTACGGG TAACAGTTTC TTTATGGCAG GGTGAAACGC      1560AGGTCGCCAG CGGCACCGCG CCTTTCGGCG GTGAAATTAT CGATGAGCGT GGTGGTTATG      1620CCGATCGCGT CACACTACGT CTGAACGTCG AAAACCCGAA ACTGTGGAGC GCCGAAATCC      1680CGAATCTCTA TCGTGCGGTG GTTGAACTGC ACACCGCCGA CGGCACGCTG ATTGAAGCAG      1740AAGCCTGCGA TGTCGGTTTC CGCGAGGTGC GGATTGAAAA TGGTCTGCTG CTGCTGAACG      1800GCAAGCCGTT GCTGATTCGA GGCGTTAACC GTCACGAGCA TCATCCTCTG CATGGTCAGG      1860TCATGGATGA GCAGACGATG GTGCAGGATA TCCTGCTGAT GAAGCAGAAC AACTTTAACG      1920CCGTGCGCTG TTCGCATTAT CCGAACCATC CGCTGTGGTA CACGCTGTGC GACCGCTACG      1980GCCTGTATGT GGTGGATGAA GCCAATATTG AAACCCACGG CATGGTGCCA ATGAATCGTC      2040TGACCGATGA TCCGCGCTGG CTACCGGCGA TGAGCGAACG CGTAACGCGA ATGGTGCAGC      2100GCGATCGTAA TCACCCGAGT GTGATCATCT GGTCGCTGGG GAATGAATCA GGCCACGGCG      2160CTAATCACGA CGCGCTGTAT CGCTGGATCA AATCTGTCGA TCCTTCCCGC CCGGTGCAGT      2220ATGAAGGCGG CGGAGCCGAC ACCACGGCCA CCGATATTAT TTGCCCGATG TACGCGCGCG      2280TGGATGAAGA CCAGCCCTTC CCGGCTGTGC CGAAATGGTC CATCAAAAAA TGGCTTTCGC      2340TACCTGGAGA GACGCGCCCG CTGATCCTTT GCGAATACGC CCACGCGATG GGTAACAGTC      2400TTGGCGGTTT CGCTAAATAC TGGCAGGCGT TTCGTCAGTA TCCCCGTTTA CAGGGCGGCT      2460TCGTCTGGGA CTGGGTGGAT CAGTCGCTGA TTAAATATGA TGAAAACGGC AACCCGTGGT      2520CGGCTTACGG CGGTGATTTT GGCGATACGC CGAACGATCG CCAGTTCTGT ATGAACGGTC      2580TGGTCTTTGC CGACCGCACG CCGCATCCAG CGCTGACGGA AGCAAAACAC CAGCAGCAGT      2640TTTTCCAGTT CCGTTTATCC GGGCAAACCA TCGAAGTGAC CAGCGAATAC CTGTTCCGTC      2700ATAGCGATAA CGAGCTCCTG CACTGGATGG TGGCGCTGGA TGGTAAGCCG CTGGCAAGCG      2760GTGAAGTGCC TCTGGATGTC GCTCCACAAG GTAAACAGTT GATTGAACTG CCTGAACTAC      2820CGCAGCCGGA GAGCGCCGGG CAACTCTGGC TCACAGTACG CGTAGTGCAA CCGAACGCGA      2880CCGCATGGTC AGAAGCCGGG CACATCAGCG CCTGGCAGCA GTGGCGTCTG GCGGAAAACC      2940TCAGTGTGAC GCTCCCCGCC GCGTCCCACG CCATCCCGCA TCTGACCACC AGCGAAATGG      3000ATTTTTGCAT CGAGCTGGGT AATAAGCGTT GGCAATTTAA CCGCCAGTCA GGCTTTCTTT      3060CACAGATGTG GATTGGCGAT AAAAAACAAC TGCTGACGCC GCTGCGCGAT CAGTTCACCC      3120GTGCACCGCT GGATAACGAC ATTGGCGTAA GTGAAGCGAC CCGCATTGAC CCTAACGCCT      3180GGGTCGAACG CTGGAAGGCG GCGGGCCATT ACCAGGCCGA AGCAGCGTTG TTGCAGTGCA      3240CGGCAGATAC ACTTGCTGAT GCGGTGCTGA TTACGACCGC TCACGCGTGG CAGCATCAGG      3300GGAAAACCTT ATTTATCAGC CGGAAAACCT ACCGGATTGA TGGTAGTGGT CAAATGGCGA      3360TTACCGTTGA TGTTGAAGTG GCGAGCGATA CACCGCATCC GGCGCGGATT GGCCTGAACT      3420GCCAGCTGGC GCAGGTAGCA GAGCGGGTAA ACTGGCTCGG ATTAGGGCCG CAAGAAAACT      3480ATCCCGACCG CCTTACTGCC GCCTGTTTTG ACCGCTGGGA TCTGCCATTG TCAGACATGT      3540ATACCCCGTA CGTCTTCCCG AGCGAAAACG GTCTGCGCTG CGGGACGCGC GAATTGAATT      3600ATGGCCCACA CCAGTGGCGC GGCGACTTCC AGTTCAACAT CAGCCGCTAC AGTCAACAGC      3660AACTGATGGA AACCAGCCAT CGCCATCTGC TGCACGCGGA AGAAGGCACA TGGCTGAATA      3720TCGACGGTTT CCATATGGGG ATTGGTGGCG ACGACTCCTG GAGCCCGTCA GTATCGGCGG      3780AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTACCATT ACCAGTTGGT CTGGTGTCAA AAATAATAAT      3840AACCGGGCAG GCCATGTCTG CCCGTATTTC GCGTAAGGAA ATCCATTATG TACTATTTAA      3900AAAACACAAA CTTTTGGATG TTCGGTTTAT TCTTTTTCTT TTACTTTTTT ATCATGGGAG      3960CCTACTTCCC GTTTTTCCCG ATTTGGCTAC ATGACATCAA CCATATCAGC AAAAGTGATA      4020CGGGTATTAT TTTTGCCGCT ATTTCTCTGT TCTCGCTATT ATTCCAACCG CTGTTTGGTC      4080TGCTTTCTGA CAAACTCGGA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA      4140TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC      4200CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GATCCTCTAG AGTCGACCTG CAGGCATGCA      4260AGCTGGCACT GGCCGTCGT                                                   4279(2)序列资料2：

(i)序列特征：

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述/desc＝“合成的寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列2GAATACAAAG CTTATGCATG(2)序列资料3：

(i)序列特征：

    (A)长度：13个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列3GAATACAAAG CTT(2)序列资料4：

(i)序列特征：

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列4AAAGCTTATG CATGCGGCCG(2)序列资料5：

(i)序列特征：

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列5CGGCCGCATC TAGAGGGCCC(2)序列资料6：

(i)序列特征：

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列6：GCGGCCGCAT CTAGAGGGCC CGGAT(2)序列资料7：

(i)序列特征：

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列7AATACAAAGC TTATGCATGC GGCC(2)序列资料8：

(i)序列特征：

    (A)长度：30碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列8AATACAAAGC TTATGCATGC GGCCGCATCT(2)序列资料9：

(i)序列特征：

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列9CATGCATAAG CTTTGTATTC(2)序列资料10：

(i)序列特征：

    (A)长度：13碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列10AAGCTTTGTA TTC(2)序列资料11：

(i)序列特征：

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列11CGGCCGCATG CATAAGCTTT(2)序列资料12：

(i)序列特征：

    (A)长度：20碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列12GGGCCCTCTA GATGCGGCCG(2)序列资料13：

(i)序列特征：

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列13ATCCGGGCCC TCTAGATGCG GCCGC(2)序列资料14：

(i)序列特征：

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列14GGCCGCATGC ATAAGCTTTG TATT(2)序列资料15：

(i)序列特征：

    (A)长度：30碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”

(xi)序列描述：序列15AGATGCGGCC GCATGCATAA GCTTTGTATT(2)序列资料16：

(i)序列特征：

    (A)长度：1798碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：mRNA

(xi)序列描述：序列16GAAUACAAAG CUUAUGCAUG CGGCCGCAUC UAGAGGGCCC GGAUCCAAAU GGAAGACGCC     60AAAAACAUAA AGAAAGGCCC GGCGCCAUUC UAUCCUCUAG AGGAUGGAAC CGCUGGAGAG       120CAACUGCAUA AGGCUAUGAA GAGAUACGCC CUGGUUCCUG GAACAAUUGC UUUUACAGAU       180GCACAUAUCG AGGUGAACAU CACGUACGCG GAAUACUUCG AAAUGUCCGU UCGGUUGGCA       240GAAGCUAUGA AACGAUAUGG GCUGAAUACA AAUCACAGAA UCGUCGUAUG CAGUGAAAAC       300UCUCUUCAAU UCUUUAUGCC GGUGUUGGGC GCCGUUAUUU AUCGGAGUUG CAGUUGCGCC       360CGCGAAGCAC AUUUAUAAUG AACGUGAAUU GCUCAACAGU AUGAACAUUU CGCAGCCUAC       420CGUAGUGUUU GUUUCCAAAA AGGGGUUGCA AAAAAUUUUG AACGUGCAAA AAAAAUUACC       480AAUAAUCCAG AAAAUUAUUA UCAUGGAUUC UAAAACGGAU UACCAGGGAU UUCAGUCGAU       540GUACACGUUC GUCACAUCUC AUCUACCUCC CGGUUUUAAU GAAUACGAUU UUGUACCAGA       600GUCCUUUGAU CGUGACAAAA CAAUUGCACU GAUAAUGAAU UCCUCUGGAU CUACUGGGUU       660ACCUAAGGGU GUGGCCCUUC CGCAUAGAAC UGCCUGCGUC AGAUUCUCGC AUGCCAGAGA       720UCCUAUUUUU GGCAAUCAAA UCAUUCCGGA UACUGCGAUU UUAAGUGUUG UUCCAUUCCA       780UCACGGUUUU GGAAUGUUUA CUACACUCGG AUAUUUGAUA UGUGGAUUUC GAGUCGUCUU       840AAUGUAUAGA UUUGAAGAAG AGCUGUUUUU ACGAUCCCUU CAGGAUUACA AAAUUCAAAG       900UGCGUUGCUA GUACCAACCC UAUUUUCAUU CUUCGCCAAA AGCACUCUGA UUGACAAAUA       960CGAUUUAUCU AAUUUACACG AAAUUGCUUC UGGGGGCGCA CCUCUUUCGA AAGAAGUCGG      1020GGAAGCGGUU GCAAAACGCU UCCAUCUUCC AGGGAUACGA CAAGGAUAUG GGCUCACUGA      1080GACUACAUCA GCUAUUCUGA UUACACCCGA GGGGGAUGAU AAACCGGGCG CGGUCGGUAA      1140AGUUGUUCCA UUUUUUGAAG CGAAGGUUGU GGAUCUGGAU ACCGGGAAAA CGCUGGGCGU      1200UAAUCAGAGA GGCGAAUUAU GUGUCAGAGG ACCUAUGAUU AUGUCCGGUU AUGUAAACAA      1260UCCGGAAGCG ACCAACGCCU UGAUUGACAA GGAUGGAUGG CUACAUUCUG GAGACAUAGC      1320UUACUGGGAC GAAGACGAAC ACUUCUUCAU AGUUGACCGC UUGAAGUCUU UAAUUAAAUA      1380CAAAGGAUAU CAGGUGGCCC CCGCUGAAUU GGAAUCGAUA UUGUUACAAC ACCCCAACAU      1440CUUCGACGCG GGCGUGGCAG GUCUUCCCGA CGAUGACGCC GGUGAACUUC CCGCCGCCGU      1500UGUUGUUUUG GAGCACGGAA AGACGAUGAC GGAAAAAGAG AUCGUGGAUU ACGUCGCCAG      1560UCAAGUAACA ACCGCGAAAA AGUUGCGCGG AGGAGUUGUG UUUGUGGACG AAGUACCGAA      1620AGGUCUUACC GGAAAACUCG ACGCAAGAAA AAUCAGAGAG AUCCUCAUAA AGGCCAAGAA      1680GGGCGGAAAG UCCAAAUUGU AAAAUGUAAC UGUAUUCAGC GAUGACGAAA UUCUUAGCUA      1740UUGUAAUCCU CCGAGGGGGC GAGCUCCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA        1798

Claims (15)

1.含有双链核酸分子的掩藏表达盒，其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码目的蛋白的RNA序列，并且有一个可操作的插入RNA序列的上游的翻译起始点；以及，

结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述第二条链对应靶分子的反义寡核苷酸。

2.权利要求1的盒，其中上述盒进一步含有连接到侧翼序列5′末端的7-甲基鸟嘌呤帽子。

3.权利要求1的盒，其中上述目的蛋白编码一种毒素。

4.权利要求1的盒，其中上述靶含有为致瘤细胞独有的寡核苷酸。

5.抑制致瘤细胞生长的一种方法，包括将上述细胞与含有双链核酸分子的掩藏表达盒接触；

其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码目的蛋白质的RNA序列，以及可操作的插入到该RNA序列上游的翻译起始点；以及

结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述第二条链对应于靶分子的反义寡核苷酸。

6.权利要求5的方法，其中上述盒进一步含有连接到侧翼序列5′末端的7-甲基鸟嘌呤帽子。

7.权利要求5的方法，其中上述翻译起始点含有Kozak序列。

8.权利要求5的方法，其中上述目的蛋白质是一种毒素。

9.权利要求8的方法，其中上述靶含有为致瘤细胞特有的核苷酸序列。

10.在靶分子存在时控制目的蛋白质表达的一种方法，上述方法包括将含有靶分子的细胞与含有双链核酸分子的掩藏表达盒接触，其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码目的蛋白的RNA序列，并且一个可操作插入到该RNA序列的上游的翻译起始点；以及，

结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述第二条链对应靶分子的反义寡核苷酸。

11.权利要求10的方法，其中上述盒进一步包括连接到侧翼序列5′末端的7-甲基鸟嘌呤帽子。

12.权利要求10的方法，其中上述目的蛋白编码一种毒素。

13.权利要求10的方法，其中上述靶含有为致瘤细胞特有的核苷酸序列。

14.在特定器官中产生目的蛋白的一种方法，包括将上述器官的细胞与含有双链核酸分子的掩藏表达盒接触，其中第一条链含有连接到侧翼序列下游的编码上述目的蛋白的RNA序列，并且有一个可操作的插入RNA序列的上游的翻译起始点；以及，

结合到侧翼序列的第二条反义链，其中上述反义链对应上述器官特异的靶分子。

15.权利要求14的方法，其中上述盒进一步含有连接到侧翼序列5′末端的7-甲基鸟嘌呤帽子。

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