CN1261101C - 壳聚糖甘草酸纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种制备壳聚糖甘草酸纳米粒子的方法。甘草酸具有抗病毒性肝炎、慢性肝炎作用以及破坏血管内艾滋病毒细胞的效果，目前临床使用的甘草酸制剂存在口服难吸收的问题。本发明将溶于酸性水溶液的壳聚糖和溶于氨水溶液的甘草酸混合，通过在一定范围内的壳聚糖分子量、壳聚糖脱乙酰度、酸溶液浓度、氨水浓度、投料比等，在较温和的反应条件下合成了壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，将其冷冻干燥后即得到粉末状壳聚糖甘草酸纳米粒子。本发明中壳聚糖甘草酸交联水分散体系是分散均匀、形状接近球形的纳米粒子。本发明产物在水中能够重新分散成纳米粒子，具有一定的靶向和缓释性能。本发明方法简单、原料易得，产品口服后，与市售口服制剂相比，其肠道吸收效率和生物利用度有明显提高。

Description

壳聚糖甘草酸纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明是利用离子交联反应制备壳聚糖甘草酸纳米粒子的方法。

背景技术

纳米粒子在药物输送方面具有很多优越性，如可缓释药物，从而延长药物的作用时间；可达到靶向输送药物的目的；可在保证药物作用的前提下，减小给药计量，从而减轻或避免不良反应；可提高药物的稳定性，有利于储存；也有可能建立一些新的给药途径，包括体内局部给药、粘膜吸收给药、多肽类口服给药。目前可用作制备药物纳米粒子的载体主要有合成的、可生物降解的、高分子聚合物和天然的大分子体系。合成的可生物降解的高分子聚合物包括：聚酐、聚已内酯、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等。天然的大分子体系包括蛋白质、多糖、明胶、淀粉等。其中，多糖类中的壳聚糖是一种资源比较丰富的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性和血液相容性，以其为主链的载体包载药物后具有控制药物释放和延长药物疗效，降低药物的毒、副作用，提高药物的稳定性和改变给药途径等特点。Tozaki等报道了含有抗炎症药物5-氨基水杨酸的壳聚糖微球在结肠处的定点释放，实验证明该药物对由2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎有治愈作用。而用涂有一层3∶1∶1的果胶/壳聚糖/羟丙基甲基纤维素薄膜的标记药片(Tc299m)在人体上实验得出：该药片能顺利通过胃、肠而不被破坏，却在结肠处释放(Tozaki H，Fujita T，Odoriba T，et al.JPharmacy Pharmacology，1999，51：1107)。此外，壳聚糖还可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结，因此从生物制药角度来看，壳聚糖可以作为大分子药物的载体促进这类分子通过组织上皮，壳聚糖纳米粒子药物释放系统就是在这个基础上提出来的。

就目前研究报导而言，壳聚糖纳米粒子药物释放系统的制备方法主要有四大类：一是溶剂挥发法，采用聚合物和药物的有机溶液与水在乳化剂存在下形成稳定乳液，经高压匀乳或超声后，在连续搅拌及一定温度和压力条件下蒸去溶剂即得纳米混悬液或假胶乳(pseudo-latex)。影响粒子大小的因素有乳化剂、相比例、搅拌速度、蒸发速度等。如果需要包裹水溶性药物，则需要制备成W/O/W复乳该体系中溶剂全部蒸发比较困难，另外乳化剂的存在有一定的毒副作用，因此在临床上的使用受到限制。Callo等用溶剂挥发法制备了壳聚糖纳米粒子，但这种方法制备的粒子药物主要分布在表面(Callo J M，HassanE E.Pharm Res，1988，5：300)；二是共价交联法，Ohya最早将壳聚糖纳米球应用于药物运载系统。他用水相和油相乳化，然后加GA的方法，大量制备了载有5FU的纳米球(Ohya Y，Shiratani M，Kobayashi H，et al.Pure Appl Chem，1994，A31：629)。这一开创性研究证明了合成稳定的用于药物载体的壳聚糖纳米球的可能性。但后来的研究发现，由于GA的交联作用，对细胞的繁殖和生物大分子的完整性有副作用，而且造成药物和壳聚糖的共价结合，使药物被固定化而不是被包埋；三是自组装壳聚糖衍生物，利用壳聚糖分子链上的羟基和氨基的反应活性引入疏水性基团，制得两亲性在水中可自组装成纳米粒子的壳聚糖衍生物。K.Y.Lee利用EDC的偶联作用将脱氧胆酸键合到壳聚糖主链上，得到不同取代度(DS，每100个葡萄糖苷所含的脱氧胆酰的个数)的脱氧胆酸改性壳聚糖(DAC)，水相介质中能够形成自聚体，通过物理作用包埋adriamycin(ADR)，药物的最大包埋量达壳聚糖自聚体重量的16.5％，包埋效率为49.6wt％(K.Y.Lee，I.C.Kwon，Y.H.Kim，et al.Langmuir，1998(14)：2329)；四是离子交联法，壳聚糖的阳离子特性使它除了能和阴离子形成聚合物以外，还能和聚阴离子接触形成凝胶，Odmeier等应用这一原理采用一种简单方法制备壳聚糖纳米球(Bodmeier R，Chen H，Paeratakul O.Pharm Res，1989，9：413)。壳聚糖同氧化乙烯和氧化丙烯形成通过静电相互作用PEO-PPO双层覆盖的纳米球。这种纳米球的核心是由壳聚糖和PEO形成的致密结构，而表层一层厚的绒毛状结构可能由PEO-PPO组成。另外，还可以通过共价的方式在壳聚糖纳米球的表面引入其他大分子，如通过碳二亚胺反应在壳聚糖纳米球的自由氨基和PEG的甲氧基之间形成共价连接，形成PEG覆盖的壳聚糖纳米球。研究发现，PEG的引入不但减少了球的正电荷，而且还可以提高其生物相溶性。总之离子交联的壳聚糖纳米球有很多诱人的特性：①合成条件温和；②球非常均一并可以调整大小(10～200nm)和有可以方便调整的阳性表面；③有很强的结合多肽、蛋白、疫苗寡核苷酸和质粒的能力；④可以通过调整其组成来改变药物的释放率；⑤冻干后复原可以保持球的完整性和药物成分的活力。由于离子交联的壳聚糖纳米球的这些特点，使得这一领域成为研究热点。

甘草酸具有缓急、润肺、解毒、祛痰、止咳、通经脉、利气血、调和诸药抗炎、抗溃疡作用和抗变态反应、抗病毒性肝炎慢性肝炎的作用以及破坏血管内艾滋病毒细胞的效果。王昕红研究发现，复方甘草酸苷(美能)联合促肝细胞生长素治疗重型肝炎，具有起效快、治疗好、病死率低等优点，且治疗时间越长，肝功能恢复越好，对早期和中期重型肝炎较晚期重型肝炎效果疗效好(王昕红，张光文，乔汉臣等.中国药房，2003，14(12)：738)。目前使用的甘草酸制剂存在口服难吸收的问题，关键点是甘草酸片剂在胃内酸性环境下容易结团、甘草酸分子在酸性环境下易形成不溶的分子聚集体即胶束，为此用肠溶性聚合物保护其免和胃内酸性环境接触可明显增加其生物利用度。

甘草酸分子中含有三个羧基，是一种潜在的阴离子交联剂。在适当的条件下，甘草酸羧酸盐可与壳聚糖质子化铵阳离子交联，形成壳聚糖甘草酸纳米粒子。壳聚糖的阳离子特性，使得纳米粒子与肠道粘膜有很强的粘附性，同时能增强肠粘膜通透性。在肠道里直接被吸收后，经门脉血流回流至肝脏后可被肝内网状内皮系统阻滞，并逐步释放甘草酸，具有肝靶向作用，有利于提高肝病治疗效果。迄今为止，壳聚糖、甘草酸复合纳米粒子方面的技术还未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于获得一种简单易行的、稳定性好、粒径均匀的、分散好、包封率高的壳聚糖甘草酸纳米粒子及其制备方法。

本发明提出的壳聚糖甘草酸纳米粒子是采用离子交联法制备。首先将壳聚糖和甘草酸分别溶解于酸性和碱性水溶液中，然后按照一定的比例和方法将两者混合，最后通过冷冻干燥得到壳聚糖甘草酸纳米粒子粉状制剂。

具体制备步骤如下：

1、壳聚糖氨质子化：壳聚糖加入0.1～1.0wt％浓度的酸性水溶液中，壳聚糖在酸溶液中的浓度是0.1～5.0wt％，室温下搅拌至壳聚糖完全溶解，过滤后即得氨质子化壳聚糖。

2、甘草酸铵盐的制备：甘草酸加入一定量的50℃热水中，搅拌完全溶解后于该溶液中加入一定量25～28％氨水，加水至氨的浓度为0.1～1.0wt％，甘草酸的浓度为0.1～1.0wt％，继续搅拌0.5～1.0小时得甘草酸铵盐水溶液

3、壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系：在搅拌下，壳聚糖水溶液滴加或倒入甘草酸水溶液中(或甘草酸水溶液滴加或倒入壳聚糖水溶液中)，混合完全后继续搅拌发应0.5～3小时，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，其中，甘草酸用量是壳聚糖用量的10.0～40.0wt％。

4、壳聚糖甘草酸纳米粒子粉状制剂的制备：壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系经过超滤浓缩后，冷冻干燥即得壳聚糖甘草酸纳米粒子粉状制剂。

以上方法制备的壳聚糖甘草酸纳米粒子粉状制剂在水或缓冲溶液中能够重新分散，本发明制得的纳米粒子表面为过量的羧酸基或质子氨，因而对pH具有响应性。

本发明中，所用的有机酸是低分子量的醋酸，或甲酸，或草酸。碱是氨水，来源方便，价格便宜。

本发明中，反应体系中壳聚糖酸性水溶液在使用前可加碱部分中和，使离子交联反应顺利进行。

本发明中，使用前加入壳聚糖酸性水溶液的碱是25～28％的氨水。

本发明中，加入壳聚糖水溶液中25～28％氨水的用量是壳聚糖用量的0～40.0wt％。

本发明中，甘草酸水溶液中所用的碱是25～28％氨水，该浓度氨水有市售，方便了制备工艺。

本发明中，壳聚糖的分子量不受限制，脱乙酰度在75～100％之间。

本发明中，壳聚糖可为经过季铵盐化、接枝改性的壳聚糖衍生物。例如壳聚糖羟丙基三甲基季铵，壳聚糖/N-异丙基丙烯酰胺接枝聚合物等。

本发明中，甘草酸可为其单铵盐、二铵盐或三铵盐。

本发明中，壳聚糖甘草酸混合方式可以为壳聚糖溶液滴加或壳聚糖直接加入甘草酸水溶液中，或者相反过程，大大方便了操作工艺。

在壳聚糖或甘草酸溶液中或两者混合后的溶液中加入0.1-1.0wt％的电解质，以增大交联的紧密度。

本发明中，上述所用的电解质可为Na₂SO₄、NaCl等的一种或多种。

在壳聚糖或甘草酸溶液中或两者混合后的溶液中也可加入1-5wt％的非离子表面活性剂，用以增强与人体的相容性。所用的非离子表面活性剂可为聚乙二醇、司班、吐温等的一种或多种。

本发明中，甘草酸水溶液滴加入壳聚糖水溶液时，速度不易过快，5秒钟/滴比较适中；搅拌也不易过快，400-600转/分钟较好。

本发明制备的壳聚糖甘草酸纳米粒子的尺寸范围在50～100nm。

本发明制得的壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系的固含量0.1～5.0wt％。

本发明制得的纳米粒子能够在水中或者缓冲溶液中重新自动分散。

由于本发明产品的特性，使本发明产品作为药物载体可获得广泛的应用。

目前，壳聚糖作为药物载体时，研究主要集中在壳聚糖与多聚阴离子交联凝胶的同时完成对药物的包埋，比较而言，本发明应用甘草酸的阴离子特性和壳聚糖的阳离子特性，将两者直接结合形成纳米粒子，具有以下特点：(1)粒和工均匀，且纳米粒子粉状制剂在水中或缓冲溶液中能够重新分散。(2)具有pH响应性能。(3)尺寸在纳米级，包封率高。(4)药物的释放速度可以通过改变投料比、壳聚糖分子量来控制。(5)制备方法操作简单，稳定性高、重复性好。

具体实施方式

实施例1：低固含量壳聚糖甘草酸单铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖酸性水溶液的配制

在500ml容量瓶中，加入壳聚糖0.3g，36％醋酸水溶液0.84g，然后加水至300g。室温搅拌48小时，过滤后制得浓度为1.0mg/ml壳聚糖醋酸水溶液。

甘草酸单铵盐碱性水溶液的配制

在50ml容量瓶中，加入甘草酸单铵盐30.0mg，加入20.0g水，50℃下加热搅拌24小时使其完全溶解，冷却后加入25％氨水0.12g，然后加水至30.0g，搅拌混合均匀后得到浓度为1.0mg/ml甘草酸铵盐水溶液。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

取上述甘草酸铵盐水溶液1.0g于圆底烧瓶中，加水稀释至10.0g，搅拌10分钟后缓慢滴加10.0g壳聚糖水溶液，滴加完毕后继续搅拌0.5小时。得到兰白色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径为50nm，载药量为16.5％，包埋率为88.0％。实施例2：高固含量壳聚糖甘草酸单铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖酸性水溶液的配制

同例1，只是最终壳聚糖的浓度为5.0wt％，醋酸的浓度为1.0wt％。

甘草酸单铵盐碱性水溶液得配制

同例1，只是配制的甘草酸的浓度为1.0wt％，氨水的浓度为1.0wt％。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

取上述甘草酸铵盐水溶液1.0g于圆底烧瓶中，加水稀释至5.0g，搅拌10分钟后与8.0g壳聚糖水溶液直接混合，继续搅拌3小时后得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径55nm，载药量为8.1％，包埋率为88.1％。

实施例3：壳聚糖甘草酸二铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖酸性水溶液的配制同例1。

甘草酸二铵盐碱性水溶液得配制

同例1，只是用甘草酸二铵盐代替甘草酸单铵盐。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

取10.0g壳聚糖水溶液圆底烧瓶中，将例1中的甘草酸水溶液稀释10倍后缓慢滴加入壳聚糖水溶液，滴加完毕继续搅拌0.5小时，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径55nm，载药量为7.9％，包埋率为85.8％。

实施例4：壳聚糖甘草酸三铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖酸性水溶液的配制同例1。

甘草酸三铵盐碱性水溶液得配制

同例1，只是以甘草酸三铵盐取代甘草酸单铵盐

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

同例1，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径50nm，载药量为8.1％，包埋率为88.1％。

实施例5：含0.1％NaCl壳聚糖甘草酸单铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖酸性水溶液的配制

在50ml容量瓶中，加入壳聚糖0.3g，36％醋酸水溶液0.84g，NaCl固体0.15g，然后加水至150g。室温搅拌48小时，过滤后制得浓度为2.0mg/ml壳聚糖醋酸水溶液。

甘草酸单铵盐碱性水溶液得配制同例1。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

同例1，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径55nm，载药量为8.0％，包埋率为87.0％。

实施例6：含1％聚乙二醇壳聚糖甘草酸单铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖酸性水溶液的配制

在50ml容量瓶中，加入壳聚糖0.3g，36％醋酸水溶液0.84g，聚乙二醇1.5g，然后加水至150g。室温搅拌48小时，过滤后制得浓度为2.0mg/ml壳聚糖醋酸水溶液。

甘草酸单铵盐碱性水溶液得配制同例1。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

同例1，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径50nm，载药量为8.1％，包埋率为88.1％。

实施例7：接枝改性壳聚糖甘草酸单铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖/N-异丙基丙烯酰胺接枝聚合物的制备

在水杨醛对壳聚糖氨基保护条件下，利用原子转移自由基聚合于壳聚糖主链上引入聚-N-异丙基丙烯酰胺支链，然后于三氟乙酸中脱保护，制得壳聚糖/N-异丙基丙烯酰胺接枝聚合物。

接枝改性壳聚糖酸、甘草酸单铵盐水溶液的配制同例1。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

同例1，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径60nm，载药量为7.8％，包埋率为84.6％。

实施例8：季铵盐化壳聚糖甘草酸单铵盐纳米粒子的制备

壳聚糖羟丙基三甲基季铵盐

首先利用表氯醇和三甲胺反应制备缩水甘油三甲基氯化铵，然后将壳聚糖与缩水甘油三甲基氯化铵在异丙醇溶液中80℃下反应14小时即可得到壳聚糖羟丙基三甲基季铵盐壳聚糖羟丙基三甲基季铵盐、甘草酸单铵盐水溶液的配制同例1。

壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备

同例1，得到兰色乳光壳聚糖甘草酸纳米粒子水分散体系，平均粒径70nm，载药量为8.1％，包埋率为86％。

Claims (14)

1.一种壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，通过离子交联反应在室温条件下制备，其特征是：(1)壳聚糖溶入0.1～1.0wt％浓度的酸性水溶液，配制成0.1～5.0wt％浓度的氨质子化壳聚糖水溶液；(2)甘草酸溶于0.1～1.0wt％浓度的碱性水溶液，配制0.1～1.0wt％浓度的甘草酸铵盐水溶液；(3)在搅拌下，混合壳聚糖水溶液和甘草酸水溶液，甘草酸用量是壳聚糖用量的10-40wt％，混合后继续反应0.5-3小时即得到纳米粒子的水分散体系；(4)将水分散体系冷冻干燥即得到壳聚糖包埋甘草酸纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是反应体系中所用酸是醋酸，或甲酸，或草酸；碱是氨水。

3.根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是反应体系中壳聚糖酸性水溶液在使用前加碱部分中和。

4.根据权利要求3所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是加入的碱是25～28％氨水。

5.根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是甘草酸水溶液中所用的碱是25～28％氨水。

6.根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是壳聚糖的脱乙酰度在75％～100％之间。

7.根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是壳聚糖是市售的产品，或经过季铵盐化，或接枝改性的壳聚糖衍生物。

8、根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是所用的甘草酸是其单铵盐，或二铵盐，或三铵盐。

9、根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是壳聚糖甘草酸混合方式为壳聚糖溶液滴加或壳聚糖直接加入甘草酸水溶液中，或者相反过程。

10、根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是在壳聚糖水溶液、甘草酸水溶液或者两者混合后的体系中加入0.1～1.0wt％电解质。

11、根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是在壳聚糖水溶液、甘草酸水溶液或者两者混合后的体系中加入1～5wt％非离子表面活性剂。

12、根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是水分散体系中的纳米粒子固含量0.1～5.0wt％。

13、根据权利要求1所述的壳聚糖甘草酸纳米粒子的制备方法，其特征是该方法制得的纳米粒子能够在水中或者缓冲溶液中重新自动分散。

 14、根据权利要求1所述的方法制备的壳聚糖甘草酸纳米粒子在药物载体上的应用。