CN1259320C - 三尖杉酯类生物碱防治植物线虫病害的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及下述通式(1)的三尖杉酯类生物碱(Cephalotaxine esters)防治植物线虫病害的应用。尤其是式中x为2的三尖杉酯碱(Harringtonine)和x为3的高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)对植物线虫有强毒杀作用，能有效用于植物线虫病害的防治。
Description
技术领域
本发明涉及三尖杉酯类生物碱(Cephalotaxine esters)，尤其三尖杉酯碱(Harringtonine)和高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)的用途(可单独用三尖杉酯碱或高三尖杉酯碱，也可用三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱两个化合物组成的混合物)，尤其是防治植物线虫病害的用途。
背景技术
植物线虫是一类常见植物病原害虫，分布广、寄主广，给农林业生产造成了严重危害。尤其近十多年来，松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的入侵，给东亚各国(包括我国)的林业生产已造成了巨大损失。化学杀线剂是防治植物线虫病害的有效措施，但化学杀线剂具有高毒、高残留的缺点，长期使用会污染环境及地下水源，并会通过食物链危害人类健康。因此，研究开发高效、低毒、低残留的杀线剂极为必要。
由于植物天然产物具有结构多样、生物活性广泛、在环境中易降解的特点，因此植物一直是各类生物活性物质的重要源泉。20在世纪70年代以来，由于认识到化学农药对环境的危害性，国际上逐渐重视从植物中寻找天然杀线虫活性物质，如印度，日本、意大利、美国、英国等国家均有这方面的研究报道，但至今大多仍停留在初步筛选阶段，发现的有效杀线虫活性成分很少，距离实际应用尚很遥远。我国对植物杀线活性物质的研究起步晚，仅见零星报道。公开号为CN1105512的中国发明专利公开了一种用苦豆碱杀灭松材线虫的方法，但与现有的化学杀线剂相比，苦豆碱在杀线虫作用强度上并不具显著性。
我们在前期工作中已发现了一种三尖杉生物碱，即桥氧粗榧碱(Drupacine)，对松材线虫和根结线虫均有较强的杀灭作用，并已申请了专利(申请号：200310112424.9，尚未公开)。但与化学杀线剂相比，桥氧粗榧碱的杀线虫作用亦不具显著优势。因此，从植物中寻找作用更强的杀线虫活性物质仍是植物源杀线剂研究与开发的关键。
三尖杉酯类生物碱(Cephalotaxines ester)是从粗榧科(Cephalotaxaceae)三尖杉属(Cephalotaxus)植物中发现的一类具有显著抗癌活性的生物碱，其中最常见和抗癌作用最强的是三尖杉酯碱(harringtonine)和高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)。
三尖杉酯类生物碱的结构见通式(I)：
其中x＝2的生物碱是三尖杉酯碱(Harringtonine)；x＝3的生物碱是高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)。
上述两种生物碱的制备是以三尖杉属(Cephalotaxus)植物为原料，采用常规的已知方法提取、分离获得(见参考资料：杨云等.天然药物化学成分提取分离手册.北京：中国中医药出版社，2003.21-23)。
上述两种生物碱已开发成抗癌药物用于临床。
发明内容
本发明的目的在于开发通式(I)的三尖杉酯类生物碱，尤其三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的新用途，即用于防治植物线虫病害的新用途。
本发明涉及通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱用于防治植物线虫病害的应用。
本发明通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱可单独或二者共同作为有效成分，添加到农药用载体或组合物中，制成农药制剂，用于防治植物线虫病害。或将含有这二种成分或含有其中一种成分的三尖杉属植物的提取物、部位提取物(如总生物碱)、分离部位添加到农药用载体或组合物中，制成农药制剂，用于防治植物线虫病害。可以采用通常的农药剂型和使用方法。
通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对植物寄生线虫有强毒杀活性，1mg/mL质量浓度处理松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)5天的杀线率均达99.8％。1mg/mL质量浓度对水稻潜根线虫(Hirschmanniella oryzae)和南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的离体毒杀作用均超过95％。
通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对线虫的毒力测定显示，对松材线虫的半数致死浓度(LC50)分别为6.7μg/mL和6.5μg/mL，其毒力是益舒宝(Ethoprop，一种常用化学杀线剂)的3.5倍，是桥氧粗榧碱的4倍。
通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对松材线虫的95％致死浓度(LC95)分别为42.0μg/mL和41.0μg/mL，比益舒宝低5倍，比桥氧粗榧碱低1.5倍多。说明通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对线虫的杀灭活性远强于常用化学杀线剂益舒宝和已知植物杀线成分桥氧粗榧碱。
含有通式(I)所述的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的混合物，如篦子三尖杉总生物碱，对线虫亦有强毒杀作用。
本发明的优点：
(1)与现有的化学杀线剂和已发现的植物源杀线虫活性物质相比，本发明的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱杀灭线虫的作用更强(比益舒宝高2.5～5倍，比桥氧粗榧碱高1.5～3倍)；
(2)本发明的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱作为抗癌药已临床应用多年，其对人体的安全性是有保证的；
(3)本发明的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱是来自植物的天然产物，在自然界中容易降解，不会形成残留，将其作为农药应用属“取自自然，用于自然”，因此，本发明的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱与化学杀线剂相比还具有低残留和对环境“友好”的特点。
具体实施方式
下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。
实施例1：三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的制备
篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri)枝干粗粉，用8倍量95％乙醇浸提三次，浸提液浓缩回收乙醇得浓水液，加3mol/L盐酸调至pH 3，过滤，滤液用碳酸钠碱化至pH 9～10，用氯仿萃取，回收氯仿，得到总生物碱(得率0.053％)。总生物碱加4％柠檬酸水溶解，酸水液再用饱和碳酸钠溶液依次调pH至6、7、8、9，分别用氯仿萃取得pH 6～7及pH 8～9两部位。pH 8～9部位过硅胶柱，以氯仿-甲醇(98∶2)洗脱，然后用乙醚重结晶，即得三尖杉酯碱。pH 6～7部位过硅胶柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，将各馏分做薄板层析，合并成分相同的流分，将主要流分(量最多的部分)用硅胶分配层析(硅胶加等量pH 5缓冲液研合均匀，再加适量氯仿，湿法装柱)，以缓冲液饱和的氯仿洗脱，将各流分做薄层层析检查，合并，获得高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱。
实施例2：三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的鉴定
三尖杉酯碱：分子式C28H37NO9；无色结晶，mp 74～76℃(乙醚)；[α]25 D-105°(c0.5，CHCl3)。在HPTLC(Kieselgel 60GF254，Merck)上与三尖杉酯碱标准品一致；与三尖杉酯碱标准品混合结晶，熔点不下降。IR、1H NMR和13C NMR数据与三尖杉酯碱的文献报道值吻合。
高三尖杉酯碱：分子式C29H39NO9；无色结晶，mp 144～146℃；[α]25 D-119°(c0.5，CHCl3)。在HPTLC(Kieselgel 60GF254，Merck)上与高三尖杉酯碱标准品一致；与高三尖杉酯碱标准品混合结晶，熔点不下降。IR、1H NMR和13C NMR数据与高三尖杉酯碱的文献报道值吻合。
实施例3：对松材线虫毒力的测定
将三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、桥氧粗榧碱及益舒宝(Ethoprop)颗粒剂用少量丙酮溶解，加蒸馏水稀释，配成不同浓度(μg/mL)的供试溶液。在直径6cm的培养皿中，用PDA培养基接种盘多毛孢菌(Pestalotia sp.)，在25℃恒温培养箱培养5天，至菌丝长满平皿。在长满盘多毛孢菌菌丝的培养皿中间放置一块长约1cm、厚约0.5cm的小正方形脱脂棉块。用微量注射器分别吸取0.5毫升不同浓度的供试溶液，注入棉块中，再吸取0.1毫升松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)液加入棉块中央，每处理设4次重复，以2％丙酮水溶液作对照。在25℃恒温培养箱培养线虫5天。将平皿内的培养基全部倒出，用改良贝曼漏斗法(Baermann funnel method)分离收集线虫并计数，按下列公式计算线虫的较正死亡率。
由供试溶液的浓度和校正死亡率通过统计学处理计算出LC50。结果(见表1)显示二种生物碱的杀线率与浓度密切相关，三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对松材线虫的半数致死浓度(LC50)分别为6.7μg/mL和6.5μg/mL其毒力是益舒宝的3.5倍，是桥氧粗榧碱的4倍。其对松材线虫的95％致死浓度(LC95)分别为42.0μg/mL和41.0μg/mL，比益舒宝低5倍，比桥氧粗榧碱低1.5倍多。说明三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对线虫的杀灭活性远强于常用化学杀线剂益舒宝和已知植物杀线成分桥氧粗榧碱。
表1.三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱对松材线虫的毒杀活性
| 供试样品 | LC50(μg/mL) | LC50 95％置信限(μg/mL) | LC95(μg/mL) |
| 三尖杉酯碱高三尖杉酯碱益舒宝(Ethoprop)桥氧粗榧碱 | 6.76.527.123.2 | 6.63～6.786.61～6.7526.6～27.622.9～23.5 | 42.041.0254.1111.1 |
实施例4：1mg/mL浓度下对松材线虫的毒杀活性测定
将三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、篦子三尖杉总生物碱(约含三尖杉酯碱36％、高三尖杉酯碱24％)和桥氧粗榧碱用少量丙酮溶解，加蒸馏水稀释成1mg/mL浓度，用实施例3的方法测定校正死亡率，结果：三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、篦子三尖杉总生物碱和桥氧粗榧碱对松材线虫的校正死亡率为99.8％、99.8％、98.5％和98.2％。
实施例5：对水稻潜根线虫的毒杀活性测定
将三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和桥氧粗榧碱用少量丙酮溶解，加蒸馏水稀释成3mg/mL浓度。取24孔细胞板，将100μL水稻潜根线虫(Hirschmanniella oryzae)悬浮液(50～100条线虫)注入样品孔内，加100μL无菌水，再加100μl样品溶液，混合均匀，以2％丙酮水溶液为空白对照，置于22～24℃、湿度为80％～90％的培养箱中，每处理3个重复。处理后24、48、72小时分别检查各处理的组的线虫死亡情况，按实施例3的公式计算校正死亡率，结果显示，三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和桥氧粗榧碱在1mg/mL浓度下作用72小时对水稻潜根线虫的校正死亡率分别为96.8％、97.4％和89.5％。
实施例6：对南方根结线虫的毒杀活性测定
按实施例5的方法测定三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和桥氧粗榧碱对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的毒杀活性。结果显示，三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和桥氧粗榧碱在1mg/mL浓度下作用72小时对南方根节线虫的校正死亡率分别为98.9％、99.4％和97.3％。
Claims (1)
1.下述通式(I)的化合物用于防治植物线虫病害的应用：
式中x为2或3。
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