CN1258215A - 丝氨酸蛋白酶和外用类视色素组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗寻常痤疮和/或在哺乳动物皮肤上产生抗衰老作用的方法,以及对此有效的组合物。更具体地说,本发明涉及丝氨酸蛋白酶作为唯一活性组分或用于有效治疗寻常痤疮和/或在哺乳动物皮肤上产生抗衰老作用的组合物,或与类视色素化合物组合有效用于相同用途的组合物。

Description

丝氨酸蛋白酶和外用类视色素组合物

与申请相关的交叉文献

本申请要求了1997年2月12日提交的美国临时申请No.60/037,605的优先权，该申请全部纳入本文作参考。

发明领域

本发明涉及治疗寻常痤疮和/或在哺乳动物皮肤上产生抗衰老作用的方法，以及用于该方法的有效组合物。更具体地说，本发明涉及丝氨酸蛋白酶单独或与类视色素化合物组合在药用或美容用组合物中的用途。

发明背景

寻常痤疮是一种毛(囊)皮脂单位疾病，它侵袭几乎所有的青少年和许多成年人。该疾病的最初损害认为是由于(毛)漏斗过度角质化(hypercornification andhyperkeratinization)，该过程促使皮脂腺转变成粉刺(comedone)。这种上皮组织结构的破坏可能会引起炎性损害，漏斗断裂而皮脂进入真皮。

因此，传统的治疗方法直接针对导致寻常痤疮形成的三种主要病理过程。外用类视色素的治疗针对由毛囊上皮异常脱落产生的皮脂腺阻塞。激素试剂针对雄激素刺激的皮脂产生的增加。最后，抗生素作用为减少和/或阻止导致发炎的(皮脂)腺内丙酸杆菌的增生。过氧化苯甲酰、水杨酸和各种清洁剂也可用于类似目的。外用类视色素被认为是治疗寻常痤疮的消粉刺(comedolytic)制剂中最有效的种类之一，但是它们的临床效果受到其刺激性作用的限制。

外用类视色素已经用于在哺乳动物皮肤表面产生抗衰老的作用。尽管已知它们是本领域中最有效的可用的外用治疗手段，但是这些化合物仍受到其刺激性作用的限制。

希望提供一种与传统痤疮治疗同样有效、但不会产生高度刺激性的治疗寻常痤疮的方法。

还希望提供一种在哺乳动物皮肤表面产生抗衰老作用的方法，该方法与类视色素治疗一样有效，但是不会产生相同的刺激性作用。

发明概述

根据本发明，我们已经发现了一种治疗寻常痤疮和/或在哺乳动物皮肤上产生抗衰老作用的方法，该方法包括或基本上包括对哺乳动物皮肤外用有效量的包含蛋白酶的第一种有外用活性的制剂。

在本发明的另一个实例中，我们已经发现了一种治疗寻常痤疮和/或在哺乳动物皮肤上产生抗衰老作用的方法，该方法包括或基本上包括对哺乳动物皮肤外用有效量的包含蛋白酶的第一种有外用活性的制剂，该活性剂与包含类视色素的第二种有外用活性的制剂结合使用。

在本发明的另一个实例中，我们已经发现了一种药用或美容用组合物，该组合物包括或基本上由下列物质组成：

a)包含蛋白酶的第一外用活性剂；和

b)包含类视色素的第二外用活性剂。

本发明的组合物和方法为治疗寻常痤疮和/或在哺乳动物皮肤上产生抗衰老作用提供了独特而方便的手段。

附图简述

本专利申请文本含有几张彩色附图。在请求和支付所需费用后，专利商标局会提供有所述彩色附图的专利副本。

在参看了本发明下文详细描述和所附附图后，就能更充分地了解本发明，本发明的其它优点也将更明显。

图1(a)表示用荧光标记的胰蛋白酶处理1小时后Rhino小鼠皮肤的横截面图。图1(b)表示用荧光标记的胰蛋白酶处理4小时后Rhino小鼠皮肤的横截面图。图1(c)表示用荧光标记的胰蛋白酶处理4小时，然后每天用1％(w/v)胰蛋白酶处理5天后的Rhino小鼠皮肤的横截面图。

图2(a)和2(b)表示用苏木素伊红(H&E)染色加工过的Rhino小鼠皮肤的组织学结构，(a)未处理过，(b)每天用包于GDL脂质体的0.1％(w/v)胰蛋白酶，处理5天。

图3(a)和3(b)的彩图表示加工成石蜡切片和对弹性蛋白染色的Rhino小鼠皮肤横截面图。图3(a)经载体处理过，图3(b)经胰蛋白酶处理过。图3(c)和3(d)表示加工成石蜡切片和对弹性蛋白染色的C57B1/6小鼠皮肤的横截面图。图3(c)经载体处理过，图3(d)经胰蛋白酶处理过。

图4(a-c)表示用H&E染色加工过的Rhino小鼠皮肤的组织学结构，(a)用0.0005％(w/v)全反式视黄酸处理过，(b)用0.005％(w/v)胰蛋白酶处理过，和(c)用0.0005％(w/v)全反式视黄酸和0.005％(w/v)胰蛋白酶处理过。

图5(a)和5(b)表示经载体处理过的Rhino小鼠TUNEL染色的皮肤组织的横截面图。图5(c)和5(d)表示经胰蛋白酶处理过的Rhino小鼠TUNEL染色的皮肤组织的横截面图。

图6表示，经逆转录-聚合酶链反应(″RT-PCR″)测得，用不同浓度胰蛋白酶处理的Rhino小鼠皮肤的基因表达曲线。

发明详述

本文所用的术语“(w/v)”应指每100毫升总组合物中给定组分的克数。

适用于本发明组合物中作为第一外用活性剂的外用活性剂包括蛋白酶，它可包括(但不局限于)丝氨酸蛋白酶。较佳的，第一外用活性剂选自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶IV、枯草溶菌素或其混合物。所选蛋白酶是胰蛋白酶。较佳的，蛋白酶存在的含量，以本发明组合物的总体积计，约为0-5％(w/v)，更佳的约为0.01-1％(w/v)。

尽管不希望受任何理论的束缚，认为本发明的第一外用活性剂可治疗与寻常痤疮相关的过度角质化和/或在皮肤上产生抗衰老作用。尽管第一外用活性剂可用作组合物中单独的活性组分来治疗寻常痤疮和/或在皮肤上产生抗衰老作用，但是为了更彻底地治疗寻常痤疮，本发明的第一外用活性剂可以与第二外用活性剂结合使用。

另外，尽管不希望受任何理论的束缚，认为所述第二外用活性剂可治疗与寻常痤疮相关的过度角质化和皮脂腺阻塞，同时还能在皮肤上产生与第一外用活性剂产生程度相当的抗衰老作用。因此，如本文实施例6所证实的，所述第一和第二外用活性剂的结合的第一特征是：治疗与寻常痤疮相关的至少两个病理过程的侵袭，同时第一外用活性剂不会丧失抗衰老作用。

本文实施例4证实了所述第一和第二外用活性剂结合使用的第二个特征，它表明所述第一外用活性剂和所述第二外用活性剂的结合使用减轻了与所述第二外用活性剂有关的刺激性作用。因此，用本发明治疗方法治疗寻常痤疮的效果和/或在皮肤上抗衰老作用的特征与单用第二外用活性剂的治疗相比大致相同，只是通常伴随所述第二外用活性剂的刺激性作用大幅度减少。

本文实施例7证实了所述第一和第二外用活性剂结合使用的第三个特征，它显示出所述第一外用活性剂和所述第二外用活性剂的结合大大地减少了获得产生效果所需的时间(与单用第二外用活性剂相比)。因此，治疗效率与单用第二外用活性剂的治疗相比大致相同，但是通过所述第二外用活性剂和所述第一外用活性剂的结合，获得所述第二外用活性剂通常伴随的结果所需的时间长短大大地减少。

适用于本发明组合物中作为第二外用活性剂的外用活性剂包括类视色素一类中的那些化合物，它们包括(但不局限于)视黄酸、维生素A醇(vitamin Aalcohol)、维生素A醛(vitamin A aldehyde)、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯或其它衍生物、类似物或其混合物。所选类视色素是全反式视黄酸。较佳的，类视色素存在的含量，以本发明组合物总体积计，约为0.0001-0.5％(w/v)，更佳的约为0.001-0.025％(w/v)。

如果第一外用活性剂的释放参数需要，则本发明的药用或美容用组合物还可进一步包括药学上或美容上可接受的载体，该载体可作为释放系统使外用活性剂渗入椭圆囊中。尽管可采用任何商业上可获得的载体来将第一外用活性剂输递至合适的皮肤附件，在椭圆囊情况下，脂质体较适合作为药学上或美容上可接受的载体。脂质体更佳的是非离子型，它包含：(a)甘油二月桂酯或甘油二硬脂酸酯；(b)具有胆固醇中发现的类固醇主链的化合物；和(c)具有约12-18个碳原子的脂肪酸醚，其中脂质体中各组成化合物之比约为53∶10∶22至63∶20∶32，较佳的约为55∶12∶24至61∶18∶30。包含甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚(″GDL″)是最佳的。较佳的，脂质体存在的含量，以组合物总体积计，约为10-100mg/ml，更佳的约为25-50mg/ml。各自之比约为58∶15∶27是最佳的。合适的脂质体可根据实施例2中提出的过程来制备，但是本领域中其它常用的方法也是可接受的。

上述脂质体组合物可这样制得，将所需组分混入合适的容器，用本领域中熟知的用于非离子型脂质体制备的任何常规高剪切混合装置在环境条件下进行混合，如Niemiec等“非离子型脂质体组合物对于肽类药物外用释放到毛囊皮脂单位的影响：用仓鼠耳朵模型的体内研究”12 Pharm.Res.1184-88(1995)(″Niemiec″)中所述的那样，该文献全部纳入本文作参考。

在其它实例中，本发明的药用或美容用组合物还可任意地与其它组分组合来产生美容或药用产品，这些组分例如是增湿剂、美容佐剂、抗氧化剂、表面活性剂、起泡剂、调节剂、润湿剂、香料、粘化剂(viscosifier)、缓冲剂、防晒剂、着色剂、防腐剂等，如果存在，则其用量不会破坏脂质体的结构。

当相互结合使用时，本发明的第一和第二外用活性剂可同时或不同时间施用于哺乳动物皮肤。例如，在第一个例子中，如果希望每天合用第一和第二外用活性剂进行治疗，则第一外用活性剂可在早晨施用，而第二外用活性剂可在下午施用。在第二个例子中(只是作为一个例子)，第二外用活性剂可在早晨施用，而第一外用活性剂可在下午施用。在第三个例子中(仅作为例子)，第一和第二外用活性剂可同时施用。在第四个例子中(仅作为例子)，第一和第二外用活性剂可在不同日施用。另外，在第五个例子中(仅作为例子)，第一和第二外用活性剂的治疗不必为1∶1的剂量，因此可施用第一外用活性剂两天，而在第三天给予第二外用活性剂，等等。当然，第五个例子有多种变化。提供前5个例子只是为了描述本发明方法可能采用的多种不同治疗方案中的一些。应当理解，这些实施例没有限制本发明的治疗方法，可以有其它许多治疗方案。

药用或美容用组合物施用的量应能有效地治疗寻常痤疮和/或在皮肤上产生抗衰老作用。本文所用的术语“有效量”应指该用量足以覆盖希望治疗寻常痤疮和/或产生抗衰老作用的皮肤表面区域。较佳的，向皮肤表面施加组合物(以每平方厘米皮肤表面计)应使得希望治疗寻常痤疮和/或在皮肤上产生抗衰老作用之处有约2-8μl/cm²的外用活性剂。

本文描述性公开的本发明可在本文未具体公开的任何组分、成分或步骤不存在时实施。下文提出了几个实施例以便进一步描述本发明的特征及其实施方式。然而，不应认为本发明局限于所述具体内容。

实施例

实施例1：Rhino小鼠系统

如Sundberg，J.P.在“无毛发和Rhino突变，染色体14”皮肤和毛发异常的小鼠突变手册(Handbook of Mouse Mutations With Skin and Hair Abnormalities)，291-312(1994)中所述的那样，用Rhino小鼠作为实验性痤疮模型来筛选外用活性消粉刺和抗角质化剂，该文全部纳入本文作参考。染色体14上的隐性突变导致25日龄小鼠皮肤起皱，没有体毛。此时，在第一次毛发周期末，毛囊乳头不能跟随正在退化的毛囊，并变得与真皮脱离。乳头不与毛囊上皮再相关来引发新的毛囊循环。毛囊的上方残迹充满了脱落的角质化的细胞，并形成了根部有小皮脂腺的椭圆囊，形成外露的粉刺。由于继发于顿挫型毛囊充满角质化碎屑使表面伸展，Rhino小鼠的皮肤逐渐变松弛，形成褶和嵴。椭圆囊逐渐扩大，形成毛发腔(cist)(假粉刺)，它是填充了角质化碎片的扩张的毛囊漏斗。

在Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine)获得5-7周龄的RHJ/LE(″Rhino″)无毛发雄性小鼠，如Mezick等在“Rhino小鼠中类视色素对角状物填充的椭圆囊大小的局部和全身作用：定量测定类视色素“抗角质化”作用的模型”83 J.Invest.Dermatol.110-113(1984)(″Mezick″)中所述的那样进行处理，该文全部纳入本文作参考。

实施例2：外用活性组合物的制备

将足量冻干胰蛋白酶(购自Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，Missouri))混合入0.05M N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(购自Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，Maryland)，商品名为“Hepes”)的缓冲水溶液中，使得所得溶液的pH约为7.4，溶液中的胰蛋白酶浓度约为2％(w/v)。然后，使1体积所得胰蛋白酶溶液与1体积(5％)甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚脂质体(用水配)混合，用Niemiec所述的方法进行制备，使得所得外用活性组合物中的胰蛋白酶浓度为1％(w/v)。甘油二月桂酸酯购自International Specialty Products Van Dyke(Belleville，New Jersey)，商品名为“Emulsynt GDL”。胆固醇购自Croda，Inc.(Parsippany，NewJersey)，商品名为“Cholesterol VSP/NF”。聚氧乙烯-10-硬脂酰醚购自ICISurfactants Americas(Wilmington，Delaware)，商品名为“Brij 76”。改变胰蛋白酶对GDL脂质体的体积对体积比，就可产生不同浓度的胰蛋白酶脂质体组合物。

视黄酸组合物含有乙醇/丙二醇载体，它包含70％(w/v)乙醇(乙基醇，200proof)(购自Quantum Chemicals Corporation(Tuscola，Illinois))和30％(w/v)丙二醇(购自Fisher Scientific(Pittsburgh，Pennsylvania))。用于视黄酸组合物的全反式视黄酸购自BSAF Aktiengesellschaft(Ludwigshafen，Germany)。改变全反式视黄酸与乙醇/丙二醇载体的体积对体积比就可产生不同浓度的视黄酸组合物。

实施例3：胰蛋白酶输递至毛囊中

将约100μl实施例2的外用活性胰蛋白酶组合物施加到实施例1的每只Rhino小鼠背侧。用购自Molecular Probes，Inc.的蛋白荧光标记试剂盒根据其所附说明(1996)对组合物中所用的胰蛋白酶作荧光标记。

在用荧光胰蛋白酶处理后1小时和4小时，用剪刀从每只小鼠上取下每只小鼠的1×2cm皮肤表面样品，在25℃下用pH约为6.9-7.1的10％福尔马林缓冲液(购自Stephens Scientific)固定，然后根据熟知的步骤制成石蜡块，根据熟知的方法用荧光显微镜进行检查。

如图1(a)所示，发现几乎所有的荧光标记均在椭圆囊和皮脂腺中。隔1小时(图1(a))和隔4小时处(图1(b))小鼠检查表现出相同的组织学染色模式，后一时间点皮肤渗透没有增加。这一观察结果提示与可能的非特异性胞外基质的蛋白酶消化的结果相反(它可能会在后一时间点表现出荧光染色剂在角质层更深渗入)。

在与实施例1相同的Rhino小鼠上重复本实施例，只是在荧光胰蛋白酶处理前，每天用实施例2的1％(w/v)胰蛋白酶组合物处理这些小鼠共5天。在第5天进行荧光胰蛋白酶处理后4小时，用相同的荧光显微检查法分析这些小鼠的皮肤。如图1(c)所述，在胰蛋白酶进入经处理皮肤的椭圆囊和皮脂腺的释放途径中没有发现显著的变化。然而，经胰蛋白酶处理过的皮肤的角质层外部有少量染色表明屏障完整性有一些丧失。如本文实施例4和表1所述，这种屏障完整性的丧失通过经表皮失水(transepidermal water loss)(″TWEL″)数值表现出来。

本实施例表明，在短期和长期使用两者，向Rhino小鼠皮肤表面应用含胰蛋白酶的外用活性组合物会导致胰蛋白酶开始释放到椭圆囊和皮脂腺内。

实施例4：胰蛋白酶处理减小了椭圆囊的大小但不诱发皮肤刺激

用实施例2的胰蛋白酶组合物(0.001％(w/v)-1％(w/v))对实施例1的Rhino小鼠每天一次进行外用处理，共5天。在第8天处死动物，通过分析图象来定量测定椭圆囊大小的减少。为了分析图象，如Mezick和Bernerd等在“Rhino小鼠模型：表面施用全反式视黄酸和CD271对假粉刺的表皮和椭圆囊壁微细结构的影响”283(2)Arch.Dermatol.Res.100-107(1991)和Bouclier等在“Rhino小鼠模型中用标准化图象分析技术定量测定外用类视色素和CD271诱导的表皮组织变化”4(2)Skin Pharmacol.65-73(1991)所述的那样(这两篇文献均纳入本文作参考)，加工全部制作标本的表皮和进行显微镜测定。在Gateway 2000 P5-100捕获图象用计算机上采用Empire Imagins Database 1.1版。用Image Pro Plus 1.3版进行测定，用Microsoft Excel 5.0版进行数据处理。计算每个处理组(3只Rhino小鼠)的椭圆囊平均直径(μ)和皮脂腺平均大小(μ2)，每个动物用5处随机的区域，每个区域测定两次。根据Finney，D.J.在“平行线测定，生物学实验中的统计学方法”Charles Griffen & Company Ltd.69-104(1978)(该文纳入本文作参考)中所述的方法计算椭圆囊直径的减少百分数。

如表1所示，胰蛋白酶诱导椭圆囊大小剂量依赖性减少，在约0.1％(w/v)胰蛋白酶处到达稳定。相对于脂质体对照进一步增加胰蛋白酶浓度不会导致椭圆囊大小减少超过55％。在单用脂质体载体时发现椭圆囊直径的减少程度较小。当7天以后分析时，单用胰蛋白酶(1％(w/v))处理对于椭圆囊大小的减少没有影响(未显示)。

表1：胰蛋白酶诱导椭圆囊大小成剂量依赖型减少处理                     相对于脂质体对照的椭圆       TEWL(g/m²h)

                         囊大小减少％胰蛋白酶0.001％(w/v)         26.85±4.38               29.53±3.68胰蛋白酶0.005％(w/v)         19.58±3.06               26.40±1.77胰蛋白酶0.01％(w/v)          33.08±2.15               28.53±2.18胰蛋白酶0.05％(w/v)          43.84±0.62               36.57±2.07胰蛋白酶0.1％(w/v)           50.67±0.83               42.80±4.33胰蛋白酶0.5％(w/v)           54.31±1.33               36.23±1.24胰蛋白酶1.0％(w/v)           54.85±1.02               42.00±1.14

脂质体载体               13.2±1.82^*              19.8±1.14

^*相对于未处理的对照来计算脂质体载体处理的椭圆囊大小减少百分数

为了进一步表征胰蛋白酶对Rhino小鼠皮肤的效果，我们用购自ServomedAB的“Evaporimeter EPT”蒸发计测定经表皮失水(″：TEWL″)，首先用环境湿度使蒸发计标准化，然后将探头置于测试对象背侧皮肤上，读取该处的TEWL值。

如表1所示，TEWL以剂量依赖型方式增加，在约0.05％(w/v)胰蛋白酶时到达稳定。这与椭圆囊直径最大程度减少的浓度大致相同。TEWL的增加和可见的刺激之间没有关系。在整个实验中观察到的少量脱屑和红斑不依赖于剂量，其甚至在1％(w/v)胰蛋白酶下仍保持很低的水平。另外，经胰蛋白酶处理过的小鼠的TEWL值低于单用类视色素处理过的数值。

未处理的、经脂质体对照处理的和经胰蛋白酶处理的Rhino小鼠皮肤的组织学分析揭示了经胰蛋白酶处理过的皮肤中有较大的变化。H&E染色和组织学分析根据Sheehand和Hrapchak，1980中描述的标准技术来进行。

如图2(b)所示，经胰蛋白酶处理过的表皮是增生性的，与图2(a)所示未经处理的表皮相比，其毛囊上皮和表皮的细胞层数均有所增加。发现变化主要在颗粒层和角质层中，该变化导致恢复脱屑，改善皮肤结构。这些表皮的变化是类视色素在体内的活性很好的特征性标志，并与潜在的临床效果有关。为了进一步支持胰蛋白酶与皮肤刺激无关的断言，图2(b)显示出没有在刺激情况下通常会存在的炎性细胞。

本实施例表明胰蛋白酶使椭圆囊大小成剂量依赖型减少。椭圆囊大小的减少与组合物治疗寻常痤疮的潜在临床效果有关。因此，本实施例还表明胰蛋白酶在治疗寻常痤疮中是有效的。本实施例进一步表明胰蛋白酶的外用治疗不会诱发皮肤刺激。

实施例5：胰蛋白酶处理导致皮肤弹性增加

用实施例2的胰蛋白酶组合物处理过的实施例1的Rhino小鼠表现出对皮肤弹性有显著的影响。为了定量测定该影响，进行库托计(cutometer)分析。我们采用购自Acaderm(Menlo Park，Clifomia)的库托计，并采用Couturaud等在“皮肤生物力学性质：用无创伤性方法体内评价年龄和身体部位的影响”1 Skin Res.andTechnol.68-73(1995)和Elsner等在“人前臂和外阴皮肤的力学性质”122 Br.J.Dermatol.607-614(1990)(这两篇文献均全文纳入本文作参考)中所述的方法。通过2mm的开孔进行抽吸，在负压释放后测定相应的皮肤移位和复原。在人体研究中，变形参数Ua/Uf(皮肤疲劳或负载后的总复原)、Ur/Uf(生物弹性或负载后的弹性复原)和Ur/Ue(坚固性，或皮肤抗变形能力的改善)的改进表明皮肤有更佳的张力和弹性。变性参数Ue，Uf，Ua和Ur部分与皮肤厚度有关。因此，如Barel等在“抽吸方法测定皮肤力学性质：库托计”Handbook of Non-Invasive Methods andthe Skin 335-340(1995)(纳入本文作参考)中所述的那样，用比值来进行评价。

如表2所示，胰蛋白酶处理导致所有这些参数增加，这反映了皮肤弹性有所改善。尽管动物间的差异很明显，但是库托计性能的提高是恒定的、并随治疗时间和长度的增加而提高。

表2：胰蛋白酶处理过的Rhino皮肤的力学性质生物                第7天                       第12天                       第16天物理     未经处理的     经胰蛋白酶     未经处理的    经胰蛋白酶     未经处理的     经胰蛋白酶参数     对照           处理过         对照          处理过         对照           处理过Ua/Uf    0.541±0.040   0.593±0.009   0.656±0.008  0.663±0.010   0.429±0.009   0.675±0.003Ur/Ue    0.408±0.080   0.557±0.021   0.242±0.006  0.666±0.024   0.243±0.006   0.733±0.018Ur/Uf    0.300±0.019   0.359±0.022   0.370±0.005  0.548±0.011   0.204±0.031   0.404±0.008

为了进一步研究弹性效果，根据Kligman，L.H.在“Luna的技术，一种优秀的弹性蛋白染色方法”3(2)The Amer.J.of Dermatopathol.199-200(1981)(纳入本文作参考)中提出的方法在石蜡切片上对经实施例2的经胰蛋白酶组合物处理过的实施例1的Rhino小鼠皮肤切片进行弹性蛋白染色。

如图3(b)所示，与图3(a)未经处理的小鼠相比，经胰蛋白酶处理过的Rhino小鼠的椭圆囊和皮脂腺周围的弹性蛋白纤维(染成紫色)厚度和密度增加。

对购自Charles River Laboratories(Kingston，New York)的C57B1/6小鼠进行相同的实验获得类似的结果。图3(c)和(d)分别表示未处理的和经胰蛋白酶处理过的皮肤弹性蛋白染色的结果。下表3显示了在经胰蛋白酶处理后，皮肤力学参数有所提高。

表3：胰蛋白酶处理过的C57B1/6皮肤的力学性能生物物理参数                 第16天

            未经处理的对照    经胰蛋白酶处理过Ua/Uf           0.429±0.014      0.675±0.018Ur/Ue           0.243±0.021      0.7335±0.02Ur/Uf           0.204±0.026      0.404±0.01

本实施例表明用胰蛋白酶进行外用治疗可增加C57B1/6和Rhino小鼠皮肤的弹性。皮肤弹性是与抗衰老有关的一种性质。因此，本实施例还表明胰蛋白酶传递对皮肤表面的抗衰老作用。

实施例6：胰蛋白酶以不同于视黄酸的机理起作用

用仓鼠耳朵模型系统评价胰蛋白酶对痤疮的皮脂组分方面的可能的作用。幼小的金色Syrian仓鼠(到达时有45-55克)购自Charles River Laboratories(Wilmington，Massachusetts)。每天用10μl实施例2的胰蛋白酶组合物处理仓鼠右耳腹侧，一周5天，共3周，而左耳用作未经处理的对照。如表3所示，在该系统中，胰蛋白酶对于皮脂腺的大小没有影响。

表3：胰蛋白酶对仓鼠耳朵皮脂腺的影响

 处理           皮脂腺大小(μ²)      大小减少的百分数(％)

未处理          99112.4±2904.0       N/A脂质体载体        94698.9±4997.1       4.45(相对于未处理)胰蛋白酶0.5(w/v)    95043.0±4269.1       -0.36(相对于脂质体载体)

本实施例表明在仓鼠耳朵模型系统中，胰蛋白酶对于皮脂腺的大小没有作用。已经知道，在这类模型中，类视色素诱导仓鼠耳朵皮脂腺大小剂量依赖型减少。因此，本实施例进一步提示胰蛋白酶作用的机理与类视色素化合物不同。

实施例7：胰蛋白酶和视黄酸表现出叠加的治疗效果

实施例1的第一批Rhino小鼠用次优剂量的实施例2的胰蛋白酶组合物进行处理。本文所用的术语“次优”是指胰蛋白酶浓度水平低于实施例4中证实的椭圆囊大小减少的最优浓度。实施例1的第二批Rhino小鼠用次优浓度的实施例2的全反式视黄酸进行处理。实施例1的第三批Rhino小鼠用次优剂量的实施例2中的胰蛋白酶组合物和实施例2中的全反式视黄酸组合物进行处理。在该第3批Rhino小鼠中，每天给予胰蛋白酶和全反式视黄酸进行处理，但在不同的时间(即胰蛋白酶在早晨而全反式视黄酸在下午)。处死小鼠，用实施例3中提出的步骤对其皮肤进行组织学检查。

如图4(c)所示，与单用胰蛋白酶和全反式视黄酸处理(图4(a&b))相比，用胰蛋白酶和全反式视黄酸组合物处理过的Rhino小鼠表现出对脱屑有很大程度的改善，但是单独的治疗却也表现出比未经处理的皮肤(图2(a))有显著的改善。另外，组织学分析揭示出经处理皮肤表面的开孔椭圆囊比单用任一处理要少得多。

本实施例表明胰蛋白酶和全反式视黄酸的组合处理对皮肤表面特性(如开孔椭圆囊的数目)有叠加作用，这意味着这些组合物可有效地用于治疗寻常痤疮。

实施例8：胰蛋白酶消除了毛囊上皮中的PCD

每天用实施例2的0.1％(w/v)胰蛋白酶组合物处理实施例1的Rhino小鼠，共5天，在第8天处死动物。

通过实施例3所述的步骤获得未经处理的、经载体处理的和经胰蛋白酶处理的小鼠的1cm×2cm皮肤样品，然后如Gavrieli等在“通过特异性标记核DNA片段化鉴定原位编程性细胞死亡”119 J1.Cell Biology 493-501(1992)(″Gavrieli″)中所述的那样，用TdT介导的dUTP-生物素切口末端标记(″TUNEL″)染色步骤进行分析。在该步骤中，用购自Oncor，Inc.的“ApopTag^TMPlus原位细胞凋亡检测试剂盒”根据Oncor，Inc.的“ApopTag^TMPlus原位细胞凋亡检测试剂盒”步骤中所指的那样(1995年2月)(以Gavrieli文献中所述的对片段化DNA末端作标记为根据)对制得的皮肤切片进行染色。图5(a-d)显示了组织学分析，其中染色剂有过氧化物酶末端(棕色)和甲基绿色复染剂(counter-stain)。其结果显示在图5(a&b)(经载体处理过)和图5(c&d)(经胰蛋白酶处理过)中。

如图5(a-d)所述，经TUNEL染色的样品通过形态学(浓缩和破裂的细胞核和细胞质或凋亡体)以及染色剂的颜色(浓缩的细胞核中的片段化DNA被染成棕色)两者可确认编程性细胞死亡(凋亡)的细胞。如图5(a&b)所示，TUNEL染色揭示了毛囊上皮中的凋亡体水平出乎寻常得高。胰蛋白酶处理消除了毛囊上皮内的所有凋亡体，和在颗粒层(图5(c&d))编程性细胞死亡(PCD)的恢复，以表示表皮分化的恢复。

本实施例表明胰蛋白酶能恢复毛囊上皮和表皮内的细胞死亡和增生两者之间的平衡。导致寻常痤疮的病理过程之一是过度角质化，它可能就是由于该平衡的移动而引起的。因此，本实施例还进一步表明，胰蛋白酶恢复上皮细胞死亡和增生间适当平衡的能力可能是其能治疗寻常痤疮的因素。

实施例9：胰蛋白酶诱导基因表达改变

每天用实施例2制得的胰蛋白酶组合物(0％(w/v)，0.0001％(w/v)，0.001％(w/v)和0.01％(w/v))处理实施例1的Rhino小鼠，处理5天，在第8天处死动物。如实施例3所述获得经载体处理的小鼠和经胰蛋白酶处理的小鼠的皮肤，然后如Chomczymski在“酸性胍盐硫氰酸酯-苯酚-氯仿抽提分离RNA的单步方法”162Anal.Biochem.156-59(1987)(纳入本文作参考)中所述那样，用购自Tel-Test″B″Inc.的“RNA Stat-60”试剂抽提其全部RNA。然后，用Promega，Corp(1995年5月)出版的“无RNA酶的DNA酶过程”描述的步骤，在各小鼠中抽提出的RNA中加入足量无RNA酶的DNA酶(购自Promega，Corp.，商品名为“RQl RNase-freeDNase”)，以使各产物含有200ng DNA酶化的RNA。用Gibco-BRL(现在为LifeTechnologies，Inc.)(1992年4月)出版的“上标II型逆转录酶”中描述的步骤，用购自Life Technologies，Inc.的随机六聚物作为随机引物，对所得200ng DNA酶化的RNA进行逆转录(RT)。

然后，用约0.5单位(每100μl反应)热稳定DNA聚合酶(购自Perkin-Elmer-Cetus Corporation，商品名为“Taq聚合酶”)和约0.1μmol/反应的小鼠甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(G3PDH)引物(购自Clontech Laboratories，Inc.(″Clontech″))或表4中提到的引物(采用表4中的条件或根据Clontech引物的过程中描述的步骤)，通过聚合酶链反应(PCR)扩增所得RT产物。

表5描述了所用的一些DNA引物、PCR反应所需的MgCl₂的量以及PCR循环的时间长度。外皮蛋白(involucrin)引物在Marthinuss等的“Pam212—一种表皮角质化细胞系的编程性细胞死亡：bcl-2在表皮分化中可能起的作用”，6 CellGrowth Diff.239-250(1995)中有所描述，该文纳入本文作参考。

表4：用于RT-PCR实验的DNA引物

 DNA引物                     MgCl₂   循环(分    循环    SEQ ID

(见所附序列表)               (mM)      钟)@℃    次数    NO：

转谷氨酰胺酶有义链           2.5       1@94；    35      15′AACCCCAAGT TCCTGAAG                     2@55；

                                       3@72

转谷氨酰胺酶反义链           2.5       1@94；    35      25′TTTGTGCTGG GCCACTTC                     2@45；

                                       3@72

弹性蛋白有义链               5         1@94；    35      35′TAAGGCAGCC AAATATGGTG                   2@45；

                                       3@72

弹性蛋白反义链               5         1@94；    35      45′ACCTGGATAA ATGGGAGAAA G                 2@55；

                                       3@72

当需要更好地显示时，根据熟知的步骤用乙醇沉淀所得PCR产物。当采用G3PDH的引物时，仅采用PCR反应产物的10％。

然后，根据本领域中熟知的方法在2％琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析PCR产物，以便比较经胰蛋白酶处理和未经处理小鼠皮肤中某些基因的表达水平。将没有逆转录的Rhino小鼠皮肤的RNA样品作为每一PCR扩增的阴性对照。当阳性对照不能从商业上获得时，就用6个月龄的Rhino小鼠皮肤的RNA样品作为阳性对照。凝胶分析结果表明， RT-PCR产物在凝胶上的迁移总是与阳性对照相同，与报道的扩增物大小相同。

然后，分析各产物中“管家”基因G3PDH的mRNA水平，比较各RT-PCR反应产物的相对质量。如图6所示，在所有检测的样品中，发现G3PDH基因表达是类似的，从而就能分析所需基因的基因表达的相对水平。

转谷氨酰胺酶(一种参与凋亡体的交联和形成的酶)在对照动物中表现出很高的mRNA水平，而随着胰蛋白酶浓度的增加却降低到检测水平以下。这表明胰蛋白酶恢复了椭圆囊的体内平衡，并消除了毛囊上皮中异常高水平的编程性细胞死亡。

随着用浓度增加的胰蛋白酶处理，弹性蛋白mRNA亦增高。因此，随着胰蛋白酶处理后新的弹性蛋白的表达，它导致了实施例5所述的皮肤弹性增加。

外皮蛋白(表皮分化的一个标志)的水平以剂量依赖方式随胰蛋白酶处理而增加。这表明正常的表皮更新，分化得到恢复。因此，胰蛋白酶恢复了实施例8中所示的表皮分化的平衡。

本实施例表明，胰蛋白酶对寻常痤疮的作用及其抗衰老能力可通过在一定的胰蛋白酶浓度范围内检查一系列基因表达方式来加以理解。胰蛋白酶诱导mRNA水平的变化得到清楚地证实，这表明胰蛋白酶在PCD、编程性细胞死亡、弹性蛋白表达和表皮分化中的调控作用。

实施例10：含有胰蛋白酶和全反式视黄酸的组合物的用途

根据Niemiec所述的步骤制备甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚脂质体，其中脂质体的组成化合物之比约为58∶15∶27。在混合脂相和水相形成Niemiec的脂质体之前，在水相中加入0.1％(w/v)抗坏血酸，在组合物的脂相中加入表5所示的组分。用合适的缓冲液调节该组合物的最终pH在4-7范围内，最好在4.5-5.5内。

表5：加入脂相中的组分

      组分                           ％(w/v)

     维甲酸                            0.01

对羟基苯甲酸甲酯                       0.10

对羟基苯甲酸丙酯                       0.02二叔丁对甲酚(butylated hydroxytoluene)     0.05

在脂质体组合物中加入第二组合物，该组合物包含溶解在0.05M，ph7.4的Hepes缓冲液(补至100毫升)中的1.0克胰蛋白酶，加入比为每8份脂质体组合物配1份第二组合物。该最终组合物适用于立即进行外用施药。

Claims (57)

1.一种治疗寻常痤疮和/或在皮肤表面产生抗衰老作用的方法，该方法包括对哺乳动物皮肤外用有效量的外用活性组合物，该组合物包含第一外用活性剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中第一外用活性剂是蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中第一外用活性剂是丝氨酸蛋白酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其中第一外用活性剂选自胰蛋白酶、类胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶IV、枯草溶菌素或其混合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中第一外用活性剂是胰蛋白酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中第一外用活性剂存在的量以外用活性组合物的总体积计为0-5％(w/v)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中第一外用活性剂存在的量以外用活性组合物的总体积计为0.01-1％(w/v)。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述外用活性组合物进一步还包括药学上或美容上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述药学上或美容上可接受的载体是脂质体或其混合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述脂质体为非离子型。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述脂质体包括：

a)甘油二月桂酸酯、甘油二硬脂酸酯或其混合物；

b)胆固醇、或具有胆固醇中发现的类固醇主链的化合物、或其混合物；和

c)有12-18个碳原子的脂肪酸醚或其混合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述脂质体包括：

a)甘油二月桂酸酯；

b)胆固醇；和

c)聚氧乙烯-10-硬脂酰醚。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述脂质体的组分存在的比例为53∶10∶22至63∶20∶32。

14.根据权利要求8所述的方法，其中所述药学上或美容上可接受的载体存在的量以所述外用活性组合物总体积计为0-100mg/ml。

15.根据权利要求1所述的方法，其中组合物进一步包含其它组分如增湿剂、美容佐剂、抗氧化剂、表面活性剂、起泡剂、调节剂、润湿剂、香料、粘化剂、缓冲剂、防晒剂、着色剂、防腐剂等。

16.一种治疗寻常痤疮和/或在皮肤表面产生抗衰老作用的方法，该方法包括对哺乳动物皮肤外用有效量的下列物质：

a)第一外用活性剂；和

b)有效量的第二外用活性剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中第一外用活性剂是蛋白酶。

18.根据权利要求17所述的方法，其中第一外用活性剂是丝氨酸蛋白酶。

19.根据权利要求18所述的方法，其中第一外用活性剂选自胰蛋白酶、类胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶IV、枯草溶菌素或其混合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中第一外用活性剂是胰蛋白酶。

21.根据权利要求20所述的方法，其中第一外用活性剂存在的量为0-5％(w/v)。

22.根据权利要求21所述的方法，其中第一外用活性剂存在的量为0.01-1％(w/v)。

23.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二外用活性剂是类视色素。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二外用活性剂选自视黄酸、维生素A醇、维生素A醛、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯或其它衍生物、类似物或其混合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二外用活性剂是全反式视黄酸。

26.根据权利要求24所述的方法，其中第二外用活性剂存在的量为0.0001-0.5％(w/v)。

27.根据权利要求26所述的方法，其中第二外用活性剂存在的量为0.001-0.025％(w/v)。

28.根据权利要求16所述的方法，它进一步还包括药学上或美容上可接受的载体。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述药学上或美容上可接受的载体是脂质体或其混合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述脂质体为非离子型。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述脂质体包括：

a)甘油二月桂酸酯、甘油二硬脂酸酯或其混合物；

b)胆固醇、或具有胆固醇中发现的类固醇主链的化合物、或其混合物；和

c)有12-18个碳原子的脂肪酸醚或其混合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述脂质体包括：

a)甘油二月桂酸酯；

b)胆固醇；和

c)聚氧乙烯-10-硬脂酰醚。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述脂质体的组分存在的比例为53∶10∶22至63∶20∶32。

34.根据权利要求28所述的方法，其中所述药学上或美容上可接受的载体存在的量以所述外用活性组合物总体积计为0-100mg/ml。

35.根据权利要求16所述的方法，其中组合物进一步包含其它组分如增湿剂、美容佐剂、抗氧化剂、表面活性剂、起泡剂、调节剂、润湿剂、香料、粘化剂、缓冲剂、防晒剂、着色剂、防腐剂等。

36.根据权利要求16所述的方法，其中第一外用活性剂与第二外用活性剂同时施加到哺乳动物皮肤上。

37.根据权利要求16所述的方法，其中第一外用活性剂向哺乳动物皮肤施用的时间与第二外用活性剂不同。

38.一种药用或美容用组合物，该组合物包括：

a)第一外用活性剂；和

b)第二外用活性剂。

39.根据权利要求38所述的药用或美容用组合物，其中第一外用活性剂是蛋白酶。

40.根据权利要求39所述的药用或美容用组合物，其中第一外用活性剂是丝氨酸蛋白酶。

41.根据权利要求40所述的药用或美容用组合物，其中第一外用活性剂选自胰蛋白酶、羧肽酶-Y、蛋白酶IV、枯草溶菌素或其混合物。

42.根据权利要求41所述的药用或美容用组合物，其中第一外用活性剂是胰蛋白酶。

43.根据权利要求42所述的药用或美容用组合物，其中第一外用活性剂存在的量以外用活性组合物的总体积计为0-5％(w/v)。

44.根据权利要求43所述的药用或美容用组合物，其中第一外用活性剂存在的量以外用活性组合物的总体积计为0.01-1％(w/v)。

45.根据权利要求38所述的药用或美容用组合物，其中所述第二外用活性剂是类视色素。

46.根据权利要求45所述的药用或美容用组合物，其中所述第二外用活性剂选自视黄酸、维生素A醇、维生素A醛、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯或其它衍生物、类似物或其混合物。

47.根据权利要求46所述的药用或美容用组合物，其中所述第二外用活性剂是全反式视黄酸。

48.根据权利要求46所述的药用或美容用组合物，其中第二外用活性剂存在的量以外用活性组合物的总体积计为0.0001-0.5％(w/v)。

49.根据权利要求48所述的药用或美容用组合物，其中第二外用活性剂存在的量为0.001-0.025％(w/v)。

50.根据权利要求48所述的药用或美容用组合物，其中所述外用活性组合物进一步还包括药学上或美容上可接受的载体。

51.根据权利要求50所述的药用或美容用组合物，其中所述药学上或美容上可接受的载体是脂质体或其混合物。

52.根据权利要求51所述的药用或美容用组合物，其中所述脂质体为非离子型。

53.根据权利要求52所述的药用或美容用组合物，其中所述脂质体包括：

a)甘油二月桂酸酯、甘油二硬脂酸酯或其混合物；

b)胆固醇、或具有胆固醇中发现的类固醇主链的化合物、或其混合物；和

c)有12-18个碳原子的脂肪酸醚或其混合物。

54.根据权利要求53所述的药用或美容用组合物，其中所述脂质体包括：

a)甘油二月桂酸酯；

b)胆固醇；和

c)聚氧乙烯-10-硬脂酰醚。

55.根据权利要求53所述的药用或美容用组合物，其中所述脂质体的组分存在的比例为53∶10∶22至63∶20∶32。

56.根据权利要求50所述的药用或美容用组合物，其中所述药学上或美容上可接受的载体存在的量以所述外用活性组合物总体积计为0-100mg/ml。

57.根据权利要求38所述的药用或美容用组合物，其中组合物进一步包含其它组分如增湿剂、美容佐剂、抗氧化剂、表面活性剂、起泡剂、调节剂、润湿剂、香料、粘化剂、缓冲剂、防晒剂、着色剂、防腐剂等。

Images