CN1255165A - 酚酸酯酶及其应用 - Google Patents

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伊恩·约翰·菲林汉姆
杰弗里·彼得·黑兹尔伍德
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Abstract

本发明涉及一种具有酚酸酯酶活性的酶,基因编码所述酶及制备和使用所述酶的方法。

Description

酚酸酯酶及其应用
本发明涉及一种具有酚酸酯酶活性的酶，DNA分子编码所述酶及制备和使用所述酶的方法。
技术背景
植物细胞壁分为两部分，即第一和第二细胞壁。第一细胞壁是由三种主要类型的多糖组成：纤维素、半纤维素和果胶。第二细胞壁也含有多糖及木质素。半纤维素是一种常规类型的存在于植物细胞壁的高支链多糖，它与其自身及纤维素和木质素相连接，并且这些连接的键对植物结构的稳定性和支撑植物结构起着作用。
基于木糖骨架的半纤维素称为木聚糖。已显示广泛存在于各种不同植物，包括水果、蔬菜、豆类、谷类、草、软木和硬木，中的木聚糖是线性β-(1-4)-D-吡喃型木糖聚合物，该聚合物可以被包括α-L-阿拉伯糖、α-D-葡糖醛酸和/或α-D-葡糖醛酸的4-O-甲基醚衍生物的糖基取代。许多木聚糖也与包括香豆酸和阿魏酸的酚酸残基发生酯化作用。这些酚酸残基以酯的形式与α-L-呋喃型阿拉伯糖基木聚糖相连接并用于防止木聚糖水解酶，即木聚糖酶，对木聚糖的降解，以及通过与其中的木质素形成的共价键而赋予植物细胞壁结构的稳定性。此外，阿魏酸在不同的木聚糖链之间存在二阿魏酸桥键，这更进一步地赋予了对植物细胞的结构支撑(Linden J.C.等，美国化学会志专题论文集，566卷(1994)，452～467)。
已知许多微生物能够通过植物细胞壁多糖的酶解而水解酚酸酯和消化植物细胞壁。其中某些微生物拥有具有酚酸酯酶活性的酶，即香豆酸酯酶活性或阿魏酸酯酶活性或这两种活性的结合。
例如，Borneman，W.S.等(应用和环境微生物学，58卷(1992)，3762～3766)描述的两种阿魏酸酯酶(FAE)，分别指定为FAE-I和FAE-II，是从厌氧真菌Neocallimastix strain MC-2中分离出来的。据报道FAE-II对底物(O-{5-O-[(E)-阿魏酰基]-α-L-呋喃型阿拉伯糖基}-(1-3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1-4)-D-吡喃型木糖(FAXX)具有特异性，而FAE-I既具有FAXX的降解活性又有(O-{5-O-[(E)-p-香豆酰基]-α-L-呋喃型阿拉伯糖基}-(1-3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1-4)-D-吡喃型木糖(PAXX)的降解活性，FAXX∶PAXX的最高代谢比为3∶1。当使用FAXX作为底物时，这两种酶的最适PH值分别为6.2和7.0。
英国专利2 301 103披露了得自黑曲霉的FAE及基因编码的所述酶。当阿魏酸甲酯用作底物时，所述酶具有约5的最适PH值和约50～60℃的最适温度。
其它具有阿魏酸酯酶活性的纯化酶是已知的(例如，McCrae，S.I.等，Enzyme Microb.Technol(酶微生物技术)，16卷(1994)，826～834；Faulds，C.B.和Williamson，G.，Microbiology(微生物学)，140卷(1994)，779～784；Castanares，A.等，酶微生物技术，14卷(1992)，875；和Kroon，P.A.等，Biotechnol.Appl.Biochem(生物技术应用生物化学)，23卷(1996)，255～262)，该纯化酶具有约5.0～6.0范围的最适PH值和30～60℃的最适温度。
具有酚酸酯酶活性的酶可用于工业、农业和医疗的应用，这些应用可以在PH值约或高于6.5和/或温度高于45℃下进行。
本发明的概述
本发明的一个目的是提供具有良好酚酸酯酶活性的酶。
本发明的另一个目的是提供能够相对大量获得的具有酚酸酯酶活性的酶的来源。
本发明进一步的一个目的是提供制备具有酚酸酯酶活性的酶的方法。
本发明的更进一步的一个目的是提供具有酚酸酯酶活性的酶在例如食物和饲料的生产、纸张和纸浆以及木质纤维素废物的生物转化过程中的应用。
本发明的其它目的将通过下面的详细描述而变得显而易见。
本发明的主题是具有酚酸酯酶活性的酶，其特征在于当其在含有33μM FAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，所述酶具有高于6.5，优选约7.0的最适PH值和高于45℃，优选约高于50℃，更优选约55℃的最适温度。在优选的情况下，所述酶具有阿魏酸酯酶活性和/或香豆酸酯酶活性。
本发明的主题也是一种具有酚酸酯酶活性的酶，该酶能从Piromyces SP.，例如Piromyces equi得到，优选从布达佩斯条约国际微生物研究所(IMI)，Bakeham Lane，Egham，Surrey，UK登记号为375061保藏的Piromyces equi strain得到。
在优选的情况下，本发明的酶含有在SEQ ID NO：1中所给出的氨基酸序列或其功能性衍生物。本发明的酶的功能性衍生物定义为在SEQ ID NO：1中所给出的氨基酸序列中具有一个或多个N-末端、C-末端或内部取代、插入和/或缺失的酶，当该功能性衍生物在含有33μMFAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，其保持高于6.5，优选约7.0的最适PH值和高于45℃，优选高于50℃，更优选约55℃的最适温度。在更优选的情况下，本发明的酶含有在SEQID NO：3中所给出的氨基酸序列或其功能性衍生物。
此外，本发明的酶优选用SEQ ID NO：1中所给出的DNA序列或其功能性衍生物进行编码。本发明的酶更优选用SEQ ID NO：3中所给出的DNA序列或其功能性衍生物进行编码。
本发明涉及具有一个和多个上述性质的酚酸酯酶。
本发明更进一步的主题是具有酚酸酯酶活性的用DNA分子编码的酶，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO：1中给出的DNA序列或其功能性衍生物或同系物。在SEQ ID NO：1中给出的DNA序列的功能性衍生物定义为具有SEQ ID NO：1所给出的DNA序列中具有一种或多种5′-，3′-或内部取代、插入和/或缺失的DNA序列，所述功能性衍生物保持其编码具有酚酸酯酶活性的酶的能力，并当其在含有33μM FAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，具有高于6.5，优选约7.0的最适PH值和高于45℃，优选高于50℃，更优选约55℃的最适温度。本发明的DNA序列的功能性同系物定义为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所给出的DNA序列上优选有75％的同系物，更优选有85％的同系物，最优选有95％的同系物的DNA序列。在更优选的情况下，按照本发明的用DNA分子编码的酶含有SEQ ID NO：3所给出的DNA序列或其功能性衍生物或同系物。
在优选的具体实施方案中，本发明的DNA分子含有能够在原核或真核宿主细胞中复制所述DNA分子和/或表达所述酶的载体序列。
本发明更进一步的主题是含有一个或多个本发明的DNA分子的转化的原核细胞或真核细胞。所述细胞优选选自由大肠杆菌，球形芽孢杆菌如枯草杆菌、球形乳酸杆菌和球形乳球菌，曲霉属，木霉属，青霉菌，白霉属，克鲁维酵母菌属和酵母属如啤酒酵母组成的组中。
本发明的酶可以在基因转移植物如玉米、大豆和canola/油菜籽或植物根储备器官，如土豆、胡萝卜、甜菜根中表达。
在适当的阶段，如在收获期，引入表达和/或分泌的本发明酯酶具有可以在降低生长阶段减少对基因转移植物或植物根储备器官结构破坏的危险的优点。
转化的原核细胞或真核细胞的生产方法是现有技术已知的。基因转移真菌如曲霉菌，转化的酵母菌如酵母菌和基因转移植物也是本技术领域已知的，并能够通过专利GB2 301 103、EP479 359和EP449 375中所教导和披露的方法制备。
本发明的主题也是一种制备具有酚酸酯酶活性的酶或酶制剂的方法，其特征在于所述酶是从自然发生的生物体或转化的细胞或能够表达按照本发明的酶的生物体中分离出来的。包括，例如，部分纯化的可作为细胞或生物体提取物的酶制剂也是本发明的主题。本发明的酶制剂可以含有一种或多种进一步的多糖改性和/或降解的酶。所述多糖改性和/或降解的酶优选选自包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、内葡聚糖酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、果胶酶、乙酰酯酶、甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶和其它糖基水解酶的组中。
此外，本发明的酶制剂也可以含有一种或多种进一步地选自包括淀粉酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、植酸酶和脂酶组成的组中的酶。
按照本发明的酶和/或酶制剂的应用包括在从含有酚酸部分的底物中释放酚酸的方法中的应用。
按照本发明所述的酶和/或酶制剂可同样用于改善植物材料的可消化性的动物饲料的生产中，尤其是用于饲料中植物细胞壁具有高含量的酚酸。而且，本发明的酶和/或酶制剂可用于谷类植物包括但不限于玉米、小麦、草和苜蓿，通过预改性细胞壁的含量以改善用于家蓄饲料的可消化性。
本发明的更进一步的主题是饲料添加剂，该添加剂含有按照本发明的具有酚酸酯酶活性的酶或酶制剂和含有所述饲料添加剂的饲料。
本发明的酶和/或酶制剂在生产纸张和纸浆工业中的应用，例如可以帮助从纤维素纸浆中除去木质素。另外，本发明的酶和/或酶制剂与木聚糖水解酶相结合通过增加纸浆中木质素的可溶解性和可提取性而能够降低用于漂白所需要的氯的量。
此外，当与木聚糖酶和/或纤维素酶结合时，本发明的酶和/或酶制剂可用于将植物材料或木质素纤维废物生物转化成糖，例如，用于化学或燃料生产，和/或酚酸的制备。
附图的简要描述
图1：用FAXX作为底物测量的本发明的酚酸酯酶的PH曲线。
图2：用FAXX作为底物测量的本发明的酚酸酯酶的温度曲线。
本发明的详细描述
下面的实施例是对本发明更加详细地说明而不是对本发明主题的限制。实施例1
将分离自马盲肠的(Orpin C.G.，J.Gen.Microbiol.(基因微生物杂志)，1981年第123卷第287～296页)和由E.A.Munn描述的(AnaerobicFungi，Biology，Ecology and Function，由D.O.Mountfort和C.G.Orpin编辑，MarcelDekker，Inc.，纽约，1994年第47～105页)和在布达佩斯条约国际微生物研究所(IMI)登记号为375061保藏的Piromyces equi在厌氧的条件下温度为39℃在含瘤胃分泌液(kem，P.，Lander，D.J.和Orpin，C.G.，基因微生物杂志1984年130卷第27-37页)的带有0.10％可溶木聚糖和0.5％Sigmacell(Sigma化学公司，Poole，Dorset，英国)为碳源的培养基中进行培养。总RNA从上述条件下生长的真菌中提取，通过小(dT)色谱选择多(A)+RNA，并从选定的RNA合成双链cDNA，并将其用ZAP-cDNA合成试剂盒克隆到λZAPII中并按照试剂盒制造者(Stratagene，La Jolla，美国加尼福尼亚)(Xue，G-P等，J.Gen.Microbiol.(基因微生物杂志)，1992年第138卷第1413～1420页和Ali，B.R.S.等，FEMS Microbiol.Lett.(FEMS微生物通讯)，1995年第125卷第15～22页)的指导进行体外包装。重组噬菌体通过在软琼脂涂覆层中大肠杆菌XL1-Blue的菌群上的平铺而生长并用抗纯化的真菌纤维素/半纤维素复合体而产生的抗体对重组噬菌体进行筛选，纯化真菌纤维素/半纤维素复合体的方法按照Ali，B.R.S等发表于FEMS微生物通讯1995年第125卷第15～22页的方法进行。用兔抗复合抗体作为初级抗体进行噬菌斑的抗体筛选，方法是基本上按照picoBlueTM免疫筛选试剂盒(Stratagene)所提供的操作指南进行，并做了下列修改：将异丙基-β-D-吡喃型硫代半乳糖苷(IPTG；0.33mM)直接加入到含有重组λZAPII和宿主细菌(大肠杆菌XL1-Blue)的软琼脂涂覆层中；将噬菌斑提到Hybond-C过滤器上(Amersham)；代替BSA的封闭溶液含有干奶粉(4％重量/体积)；将与辣根过氧化酶(Sigma化学品公司)偶合的抗兔IgG(总分子量)用作第二抗体；着色展开液在50mM三盐酸缓冲液中含有3，3`二氨基联苯胺(0.5毫克/毫升)，PH值为7.4，和过氧化氢(0.5微升/毫升)。酯酶的生产根据Dalrymple，B.P.等发表于FEMS微生物通讯，1996年，第143卷第115～120页上的方法，通过抗体筛选选择的克隆合成能水解[4-甲基散形花酰基(肉桂酸-p-三甲基氯化铵)](4-methylumbelliferoyl(p-trimethylammonium cinnamate chloride)的酶。
根据Sambrook等的Molecular Cloning(分子克隆)：试验室手册(1989年第二版，Cold Spring Harbor，New York)，完成一般分子生物学技术，包括DNA分离、限制酶的消化、络合、转化以及酯酶基因的DNA测序。
完成了本发明的具有酚酸酯酶活性的基因编码酶的核苷酸测序，其结果列于SEQ ID NO：3中。可译框架包括1608个核苷酸，具有预测分子量为55,540道尔顿的536个氨基酸的编码蛋白质。实施例2最适PH值的测定
在含有50mM三盐酸，PH＝9.0，50mM NaCl，10mM MgCl2，200μMdNTPs，50微微摩尔的底物的缓冲溶液中进行PCR反应(30秒94℃，45秒50℃，1分钟72℃的20次循环)产生由SEQ ID NO.1编码的截断的酶。所述底物为：
5`-端：5`-CGCGGATCCAACAGCGGTCCAACTGTTG-3`，
3`-端：5`-GCGAATTCTTATCTTATGGGAGAGAG-3`，
250纳克模板DNA和用载体PET32a(Novagen，Inc.)在大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，Inc.，Wisconsin，USA)中表达。
按照美国Novagen，Inc的指导，将来自新制备的游离细胞的提取物通过键和到Talon树脂上(Clontech Laoratories Inc.，美国加尼福尼亚)并用限定级的Thrombin从金属亲合树脂上洗脱而得到纯化酶，该酶用作PET载体酶。所述酶可进一步按如下方法纯化：用10mM三盐酸平衡一个1毫升MonoQ柱(Pharmacia)，PH值为8.0，将新鲜的酶置于柱上，用氯化钠以1.0毫升/分钟的速度进行梯度淋洗(0～0.5M NaCl在10mM三盐酸中，PH＝8.0)。收集1毫升的流出组分。将酶在PH值的范围为3～7的McIlvaine缓冲溶液(柠檬酸/正磷酸氢二钠，数据见Biochemical Research(生化研究)，第3版，Dawson，Elliot，Elliot，Jones，牛津科学出版社，牛津大学印刷，1987年)或PH值的范围为8～9的含有氯化钾/硼酸的缓冲溶液中进行测定。该测定是在37℃和最终FAXX浓度为33μM的条件下进行的。根据Faulds，C.B.和Williamson，G.，在Microbiology(微生物学)，1994年，140卷，第779～787页上发表的方法对由FAXX释放出的阿魏酸在335nm处连续监测3分钟。
测定的结果示于图1中。从图1可以推导出，本发明的酶在PH约为5.5和约为8.5时表现出50％的活性。为了决定在用FAXX作为底物时本发明的酶的最适温度，将FAXX以33μM的浓度进行使用并且在PH＝6.0的100mM的MOPS缓冲溶液中进行测定。用恒温控制分光光度计将孵化温度从20℃～70℃变化。对由FAXX释放出的阿魏酸在335nm处按照上述方法进行测量。结果如图2所示。动力学
本发明酶的Km和Vmax用FAXX和Ara2F(O-[2-O-(反阿魏酰基)-α-呋喃型阿拉伯糖基]-(1-5)-L-呋喃型阿拉伯糖作为底物进行测定。使用FAXX的浓度范围为3.72～49.18μM，使用Ara2F的浓度范围为4.46～122.92μM。在温度为37℃，PH＝6.0的100mM的MOPS((3-[N-吗啉]-丙烷磺酸))带有90纳克酶的缓冲溶液中进行测定。对于在两种底物中的阿魏酸的释放在335nm处按照上述方法进行测量。
基于上述的实验结果所决定本发明酶的动力学常数如下：底物          Km                 VmaxFAX        3.0±0.3μM    35.6±0.9微摩尔/分钟/毫克Ara2F     234±27μM     19.6±1.7微摩尔/分钟/毫克
因此，当在上述条件下使用FAXX作为底物测量时本发明的酶具有约3.0的Km和约35的Vmax。
本发明的酶对阿魏酸甲酯、香豆酸基酯和P-香豆酸甲酯的特定活性的测定是在37℃，含有100mMMOPS缓冲溶液(带有0.02％的叠氮化合物)，PH＝6.0，44纳克酶和1mM的上述底物的条件下进行的。在孵化15分钟以后，煮沸终止该反应，并用反相HPLC测定所释放的自由酸(Kroon，P.A.和Williamson，G.，Biotechnol.Appl.Biochem.，1996年，23卷263～267页)。上述实验结果如下所示。
此外，本发明的酶对乙酸对硝基苯基酯、乙酸α-萘基酯、丁酸α-萘基酯、己酸α-萘基酯、辛酸α-萘基酯和月桂酸α-萘基酯的特异活性的测定根据Ferreira，L.M.A.等所描述的方法进行(Biochem.J.，1993年294卷，349～355页)。上述测定结果如下所示。
    底物     特异活性(U*/毫克)
    乙酸对硝基苯基酯     204.3
    乙酸α-萘基酯     121
    丁酸α-萘基酯     220
    己酸α-萘基酯     256
    辛酸α-萘基酯     54
    月桂酸α-萘基酯     6
    阿魏酸甲酯     10.6
    香豆酸基酯     10.5
    P-香豆酸甲酯     2.7
U*定义为给出1毫摩尔/分钟的酯水解的酶的量。序列清单(1)一般信息(i)申请人：
  (A)名字：生物技术和生物科学研究委员会
  (B)街区：Polaris House，North Star Avenue
  (C)城市：Swindon
  (D)州：
  (E)国家：英国
  (F)邮编：SN2 1UH(ii)发明名称：酚酸酯酶及其应用(iii)序列数：4(iv)可机读形式：
   (A)培养基类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征
  (A)长度：825个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(vi)最初来源：
  (A)生物体：Piromyces equi(ix)特征：(A)名字/键：CDS(B)座位：1..822(xi)序列描述：SEQ ID NO：1AAC AGC GGT CCA ACT GTT GAA TAC TCT ACT GAT GTT GAC TGT TCC GGT          48Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr Asp Val Asp Cys Ser Gly1               5                  10                  15AAG ACC CTT AAG AGT AAC ACC AAC CTT AAC ATC AAT GGT CGT AAG GTT          96Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn Ile Asn Gly Arg Lys Val
         20                  25                  30ATT GTA AAA TTC CCA AGC GGC TTC ACT GGT GAC AAG GCT GCT CCA CTT          144Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly Asp Lys Ala Ala Pro Leu
     35                  40                  45CTT ATT AAC TAC CAT CCA ATT ATG GGT AGT GCT TCT CAA TGG GAA AGT          192Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser Ala Ser Gln Trp Glu Ser
 50                  55                  60GGT TCT CAA ACT GCT AAG GCT GCT TTA AAT GAT GGT GCC ATC GTT GCT          240Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn Asp Gly Ala Ile Val Ala65                  70                  75                  80TTC ATG GAT GGT GCT CAA GGT CCA ATG GGA CAA GCT TGG AAC GTT GGT          288Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Gln Ala Trp Asn Val Gly
             85                  90                  95CCA TGT TGT ACT GAT GCT GAT GAT GTT CAA TTC ACT CGT AAC TTC ATT          336Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln Phe Thr Arg Asn Phe Ile
         100                105                 110AAG GAA ATC ACT AGT AAG GCT TGT GTT GAT CCA AAG CGT ATC TAT GCT          384Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp Pro Lys Arg Ile Tyr Ala
    115                 120                 125GCT GGT TTC TCT ATG GGT GGT GGT ATG TCT AAC TAT GCT GGT TGT CAA         432Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser Asn Tyr Ala Gly Cys Gln
130                 135                 140CTT GCT GAT GTT ATT GCT GCT GCT GCT CCA TCA GCC TTT GAT CTT GCC         480Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Phe Asp Leu Ala145                 150                 155                 160AAG GAA ATT GTT GAT GGT GGT AAA TGT AAA CCA GCT CGT CCA TTC CCA         528Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys Pro Ala Arg Pro Phe Pro
            165                 170                 175ATC CTT AAC TTC CGT GGT ACT CAA GAT AAC GTT GTT ATG TAC AAC GGT         576Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn Val Val Met Tyr Asn Gly
        180                 185                 190GGT CTT TCT CAA GTT GTT CAA GGT AAG CCA ATT ACT TTC ATG GGT GCC         624Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro Ile Thr Phe Met Gly Ala
    195                 200                 205AAG AAC AAC TTC AAG GAA TGG GCT AAG ATG AAC GGA TGT ACT GGT GAA         672Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met Asn Gly Cys Thr Gly Glu
210                 215                 220CCA AAA CAA AAC ACT CCA GGT AAC AAC TGT GAA ATG TAC GAA AAC TGT         720Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys Glu Met Tyr Glu Asn Cys225                 230                 235                 240AAG GGT GGT GTT AAG GTT GGT CTT TGC ACT ATC AAC GGT GGT GGT CAC         768Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr Ile Asn Gly Gly Gly His
            245                 250                 255GCT GAA GGT GAC GGT AAA ATG GGT TGG GAC TTT GTT AAA CAA TTC TCT         816Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp Phe Val Lys Gln Phe Ser
        260                 265                 270CTC CCA TAA                                                        825Leu Pro(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：274个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr Asp Val Asp Cys Ser Gly1               5                  10                  15Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn Ile Asn Gly Arg Lys Val
         20                  25                  30Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly Asp Lys Ala Ala Pro Leu
     35                  40                  45Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser Ala Ser Gln Trp Glu Ser
 50                  55                  60Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn Asp Gly Ala Ile Val Ala65                  70                  75                  80Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Gln Ala Trp Asn Val Gly
             85                  90                  95Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln Phe Thr Arg Asn Phe Ile
        100                 105                 110Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp Pro Lys Arg Ile Tyr Ala
    115                 120                 125Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser Asn Tyr Ala Gly Cys Gln
130                 135                 140Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Phe Asp Leu Ala145                 150                 155                 160Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys Pro Ala Arg Pro Phe Pro
            165                 170                 175Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn Val Val Met Tyr Asn Gly
        180                 185                 190Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro Ile Thr Phe Met Gly Ala
    195                 200                 205Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met Asn Gly Cys Thr Gly Glu
210                 215                 220Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys Glu Met Tyr Glu Asn Cys225                 230                 235                 240Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr Ile Asn Gly Gly Gly His
            245                 250                 255Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp Phe Val Lys Gln Phe Ser
        260                 265                 270Leu Pro(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：1611个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(vi)最初来源：(A)生物体：Piromyces equi(ix)特征：(A)名字/键：CDS(B)座位：1..1608(xi)序列描述：SEQ ID NO：3ATG AAG ACT AGC ATT GTA TTA TCT ATC GTT GCT TTA TTT TTA ACA TCC          48Met Lys Thr Ser Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Leu Phe Leu Thr Ser275                 280                 285                 290AAA GCT TCT GCT GAT TGT TGG TCA GAA AGA TTA GGT TGG CCA TGC TGT          96Lys Ala Ser Ala Asp Cys Trp Ser Glu Arg Leu Gly Trp Pro Cys Cys
            295                 300                 305AGT GAC AGC AAT GCC GAA GTA ATC TAC GTC GAT GAC GAT GGT GAT TGG          144Ser Asp Ser Asn Ala Glu Val Ile Tyr Val Asp Asp Asp Gly Asp Trp
        310                 315                 320GGT GTT GAA AAT AAT GAC TGG TGT GGT ATC CAA AAG GAA GAA GAA AAC          192Gly Val Glu Asn Asn Asp Trp Cys Gly Ile Gln Lys Glu Glu Glu Asn
    325                 330                 335AAT AAC TCA TGG GAT ATG GGT GAT TGG AAC CAA GGT GGT AAC CAA GGT          240Asn Asn Ser Trp Asp Met Gly Asp Trp Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly
340                 345                 350GGC GGT ATG CCA TGG GGC GAC TTT GGC GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG          288Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met355                 360                 365                 370CAA TGG GGT GAC TTC GGT GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGC         336Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly
            375                 380                 385GAC TTC GGT GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAC TTT GGC         384Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
        390                 395                 400GGT AAC CAA GGT GGT AAC CAA GGC GGT GGT ATG CCA TGG GGC GAC TTT         432Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe
    405                 410                 415GGA GGA AAC CAA GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAT         480Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp
420                 425                 430TTC GGA GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTT GGA GGA         528Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly435                     440             445                 450AAC CAA GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAT TTC GGA         576Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
            455                 460                 465GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTT GGA GGA AAC CAA         624Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln
        470                 475                 480GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAC TTC GGA GGT AAC         672Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn
    485                 490                 495CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAT TTC GGA GGT AAT CAA GGT GGT         720Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly
500                 505                 510GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTC GGC GGT AAC CAA GGA GGT AAC CAA GAT         768Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Asp515                 520                 525                 530TGG GGT AAC CAA GGT GGT AAC AGC GGT CCA ACT GTT GAA TAC TCT ACT         816Trp Gly Asn Gln Gly Gly Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr
            535                 540                 545GAT GTT GAC TGT TCC GGT AAG ACC CTT AAG AGT AAC ACC AAC CTT AAC         864Asp Val Asp Cys Ser Gly Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn
        550                 555                 560ATC AAT GGT CGT AAG GTT ATT GTA AAA TTC CCA AGC GGC TTC ACT GGT         912Ile Asn Gly Arg Lys Val Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly
    565                 570                 575GAC AAG GCT GCT CCA CTT CTT ATT AAC TAC CAT CCA ATT ATG GGT AGT         960Asp Lys Ala Ala Pro Leu Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser
580                 585                 590GCT TCT CAA TGG GAA AGT GGT TCT CAA ACT GCT AAG GCT GCT TTA AAT         1008Ala Ser Gln Trp Glu Ser Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn595                 600                 605                 610GAT GGT GCC ATC GTT GCT TTC ATG GAT GGT GCT CAA GGT CCA ATG GGA         1056Asp Gly Ala Ile Val Ala Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly
            615                 620                 625CAA GCT TGG AAC GTT GGT CCA TGT TGT ACT GAT GCT GAT GAT GTT CAA         1104Gln Ala Trp Asn Val Gly Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln
        630                 635                 640TTC ACT CGT AAC TTC ATT AAG GAA ATC ACT AGT AAG GCT TGT GTT GAT         1152Phe Thr Arg Asn Phe Ile Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp
    645                 650                 655CCA AAG CGT ATC TAT GCT GCT GGT TTC TCT ATG GGT GGT GGT ATG TCT        1200Pro Lys Arg Ile Tyr Ala Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser
660                 665                 670AAC TAT GCT GGT TGT CAA CTT GCT GAT GTT ATT GCT GCT GCT GCT CCA        1248Asn Tyr Ala Gly Cys Gln Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro675                 680                 685                 690TCA GCC TTT GAT CTT GCC AAG GAA ATT GTT GAT GGT GGT AAA TGT AAA        1296Ser Ala Phe Asp Leu Ala Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys
            695                 700                 705CCA GCT CGT CCA TTC CCA ATC CTT AAC TTC CGT GGT ACT CAA GAT AAC        1344Pro Ala Arg Pro Phe Pro Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn
        710                 715                 720GTT GTT ATG TAC AAC GGT GGT CTT TCT CAA GTT GTT CAA GGT AAG CCA        1392Val Val Met Tyr Asn Gly Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro
    725                 730                 735ATT ACT TTC ATG GGT GCC AAG AAC AAC TTC AAG GAA TGG GCT AAG ATG        1440Ile Thr Phe Met Gly Ala Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met
740                 745                 750AAC GGA TGT ACT GGT GAA CCA AAA CAA AAC ACT CCA GGT AAC AAC TGT        1488Asn Gly Cys Thr Gly Glu Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys755                 760                 765                 770GAA ATG TAC GAA AAC TGT AAG GGT GGT GTT AAG GTT GGT CTT TGC ACT        1536Glu Met Tyr Glu Asn Cys Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr
            775                 780                 785ATC AAC GGT GGT GGT CAC GCT GAA GGT GAC GGT AAA ATG GGT TGG GAC        1584Ile Asn Gly Gly Gly His Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp
        790                 795                 800TTT GTT AAA CAA TTC TCT CTC CCA TAA                                           1611Phe Val Lys Gln Phe Ser Leu Pro
    805                 810(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：536个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Met Lys Thr Ser Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Leu Phe Leu Thr Ser1               5                  10                  15Lys Ala Ser Ala Asp Cys Trp Ser Glu Arg Leu Gly Trp Pro Cys Cys
         20                  25                  30Ser Asp Ser Asn Ala Glu Val Ile Tyr Val Asp Asp Asp Gly Asp Trp
     35                  40                  45Gly Val Glu Asn Asn Asp Trp Cys Gly Ile Gln Lys Glu Glu Glu Asn
 50                  55                  60Asn Asn Ser Trp Asp Met Gly Asp Trp Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly65                  70                  75                  80Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met
             85                  90                  95Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly
        100                 105                 110Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
    115                 120                 125Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe
130                 135                 140Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp145                 150                 155                 160Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly
            165                 170                 175Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
        180                 185                 190Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln
    195                 200                 205Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn
210                 215                 220Gln Gly Gly Gly Me5 Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly225                 230                 235                 240Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Asp
            245                 250                 255Trp Gly Asn Gln Gly Gly Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr
        260                 265                 270Asp Val Asp Cys Ser Gly Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn
    275                 280                 285Ile Asn Gly Arg Lys Val Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly
290                 295                 300Asp Lys Ala Ala Pro Leu Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser305                 310                 315                 320Ala Ser Gln Trp Glu Ser Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn
            325                 330                 335Asp Gly Ala Ile Val Ala Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly
        340                 345                 350Gln Ala Trp Asn Val Gly Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln
    355                 360                 365Phe Thr Arg Asn Phe Ile Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp
370                 375                 380Pro Lys Arg Ile Tyr Ala Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser385                 390                 395                 400Asn Tyr Ala Gly Cys Gln Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro
            405                 410                 415Ser Ala Phe Asp Leu Ala Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys
        420                 425                 430Pro Ala Arg Pro Phe Pro Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn
    435                 440                 445Val Val Met Tyr Asn Gly Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro
450                 455                 460Ile Thr Phe Met Gly Ala Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met465                 470                 475                 480Asn Gly Cys Thr Gly Glu Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys
            485                 490                 495Glu Met Tyr Glu Asn Cys Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr
        500                 505                 510Ile Asn Gly Gly Gly His Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp
    515                 520                 525Phe Val Lys Gln Phe Ser Leu Pro
530                 535

Claims (23)

1.具有酚酸酯酶活性的酶，其特征在于当其在含有33μM FAXX作为底物的柠檬酸/正磷酸氢二钠的缓冲溶液中进行测定时，所述酶具有高于6.5的最适PH值和高于45℃的最适温度。
2.按照权利要求1的酶，其特征在于所述酶具有阿魏酸酯酶活性和/或香豆酸酯酶活性。
3.按照权利要求1或2的酶，其特征在于所述酶具有约7.0的最适PH值和/或约55℃的最适温度。
4.按照权利要求1～3的任意一种酶，其特征在于所述酶能从Piromyces SP.，优选在国际微生物研究所(IMI)登记号为375061保藏的Piromyces equi得到。
5.按照权利要求1～4的任意一种酶，其特征在于所述酶含有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中给出的氨基酸序列或其功能性衍生物。
6.按照权利要求1～5的任意一种酶，其特征在于所述酶用在SEQID NO：1或SEQ ID NO：3中给出的DNA序列、其功能性衍生物或同系物进行编码。
7.一种具有酚酸酯酶活性的用DNA分子编码的酶，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中给出的DNA序列、其功能性衍生物或同系物。
8.编码按照权利要求1～6的任意一种酶的DNA分子，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中给出的DNA序列、其功能性衍生物或同系物。
9.按照权利要求7或8的DNA分子还进一步含有能够在原核或真核宿主细胞中表达所述酶的载体序列。
10.含有按照权利要求7～9的一个或多个DNA分子的转化的原核细胞或真核细胞或生物。
11.制备具有酚酸酯酶活性的酶或酶制剂的方法，其特征在于所述酶是从按照权利要求10的细胞或生物中分离出来的。
12.一种酶制剂，该酶制剂含有按照权利要求1～6的任意一种酶和/或可通过按照权利要求11的方法获得的酶。
13.按照权利要求12的酶制剂，该酶制剂进一步含有一种或多种的多糖改性和/或降解的酶。
14.按照权利要求13的酶制剂，其特征在于所述多糖改性和/或降解的酶选自包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、内葡聚糖酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、果胶酶、乙酰酯酶、甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶和其它糖基水解酶的组中。
15.按照权利要求11～14的任意一种酶制剂，该酶制剂进一步含有一种或多种的选自包括淀粉酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、植酸酶和脂酶的组中的酶。
16.按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂在用于从含有酚酸部分的底物释放或制备酚酸的方法中的应用。
17.按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂在生产动物饲料中的应用。
18.按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂在生产食物中的应用。
19.按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂在生产纸张中的应用。
20.按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂在用于将植物材料或木质素纤维废物生物转化成糖的方法中的应用。
21.按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂在用于改善家蓄饲料的谷类植物的可消化性中的应用。
22.饲料添加剂，该添加剂含有按照权利要求1～6的任意一种酶和/或按照权利要求11～15的任意一种酶制剂。
23.一种饲料，该饲料含有按照权利要求22的饲料添加剂。
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