CN1242377A - 壳聚糖、壳低聚糖的制备方法 - Google Patents

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本发明涉及一种壳聚糖和壳低聚糖的制备方法。本发明以青霉素、柠檬酸或乳酸发酵后的废丝状菌体为原料,分别经细胞破碎、脱乙酰化、萃取和细胞破碎、酸水解、脱酸、干燥制得壳聚糖和壳低聚糖。本发明的方法工艺简单、成本低、产品质量稳定、易于工业化,不但大大降低了生产成本,而且还变废为宝,对环境保护也非常有益。

Description

壳聚糖、壳低聚糖的制备方法
本发明涉及一种壳聚糖和壳低聚糖的制备方法。
壳聚糖，学名聚脱乙酰氨基葡萄糖，广泛存在于海洋节肢动物如虾、蟹和昆虫的外壳及真菌微生物的细胞壁中。壳聚糖在化学工业、医药、食品等领域具有广泛的应用，如用于水处理中的絮凝剂、食品添加剂、药物缓释剂等。
目前壳聚糖生产主要是以虾壳为原料，用稀酸将甲壳中的碳酸钙变成氯化钙去除，经水洗、干燥、粉碎后，再用稀碱溶液渍泡，在100℃处理48小时，用以除去蛋白质，得到甲壳素，一般碱处理需反复处理5次；甲壳素用浓碱溶液在60-80℃下处理数小时，完成脱乙酰基的操作，过滤去除杂质。以虾壳为原料生产壳聚糖具有以下几个缺点：①工艺繁琐，反应时间过长，难于工业化，原料有限且受季节限制，因而成本高；②质量不稳定，由于各地产的虾种类不同而导致生产的壳聚糖质量差异很大。
80年代后美国、日本相继开始研究用发酵法生产壳聚糖，如日本旭硝子公司开发了犁头霉发酵生产壳聚糖的工艺，见EP0531991A2专利，但专门用于生产壳聚糖的这种犁头霉菌的培养需要时间较长，一般为一周左右，而且需要消耗大量的培养基，因此这种方法耗时耗力成本高，因此至今尚未工业化。
壳低聚糖是指含有2～10个氨基葡萄糖的寡糖，壳低聚糖具有许多生物医药的功能，如降低血压、血脂等。通常壳低聚糖是以壳聚糖为原料经降解制得。降解的方法有化学法(酸法)及酶法等几种方法。见《化工进展》1994年1月“壳低聚糖的合成及其应用”一文所揭示的，无论方法如何，其生产原料全是以虾壳、蟹壳为原料进行生产的，因而生产成本较高。
本发明的目的是提供一种工艺简单、低成本、易于工业化的制备壳聚糖和壳低聚糖的方法，本发明以青霉素、柠檬酸或乳酸发酵后的废丝状菌体为原料生产壳聚糖及壳低聚糖，工艺简单，产品质量稳定，不但大大降低了生产成本，而且还变废为宝，对环境保护也非常有益。
本发明的要点如下：
一种壳聚糖的制备方法，依次包括以下步骤：
(1)细胞破碎：将丝状菌体中加入稀碱溶液，所说的丝状菌体为青霉素发酵的青霉菌、柠檬酸发酵的黑曲霉菌或乳酸发酵的根霉菌，所用的稀碱溶液没有特别要求，可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾，重量百分浓度最好在1-10％，加入量使碱与丝状菌体的重量比为：0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，搅拌10分钟-4小时，收集菌体，可以采用离心或过滤的方法收集菌体。碱液不但可以破碎细胞，而且可以萃取胞内核酸和蛋白质。
(2)脱乙酰化：目的是将甲壳素分子中的乙酰氨基脱乙酰后变成壳聚糖。在步骤(1)收集的菌体中加入重量百分浓度为10-70％的浓碱溶液，浓碱最好是氢氧化钠或氢氧化钾溶液，加入的量使碱与丝状菌体的重量比为：0.5∶1-14∶1，在50-200℃条件下，反应1-5小时，收集菌体。反应最好是在回流或密闭条件下进行，以防止溶液蒸发，降低碱的浓度。
为提高脱乙酰的效率，脱乙酰化的操作可以采用短时间多次处理的方法，如采用两次脱乙酰化，每次处理1-2小时，可显著提高壳聚糖的脱乙酰度，达85％以上。
(3)壳聚糖的萃取：在步骤(2)收集的菌体中加入重量百分浓度为1-30％的酸进行萃取，所用的酸最好为有机酸，如乙酸、乳酸、柠檬酸等，或盐酸，重量百分浓度最好为1-15％，加入的量使酸与丝状菌体的重量比为：0.05∶1-3∶1，萃取温度为20℃～100℃，搅拌萃取0.5～20小时，除去菌丝体残渣，收集上清液。
为了减少酸的用量，可将步骤(2)中收集的菌体用水洗至中性，再进行酸萃取。另外，为了提高萃取率，萃取过程还可重复2-3次，合并几次萃取液。
(4)壳聚糖的收集：可用碱法或有机溶剂沉淀萃取液中的壳聚糖，也可采用喷雾干燥或气流干燥直接将萃取液中的壳聚糖成球；碱法所用的碱液有氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和和碱性盐如磷酸盐等。具体的操作为：将萃取上清液的pH值用碱调节到大于等于6.0或加入C1-C6的醇或C3-C6的酮等有机溶剂进行沉淀，收集沉淀物制得壳聚糖。其中所用的有机溶剂最好为丙酮、乙醇或丙醇。
一种壳低聚糖的制备方法，依次包括以下步骤：
(1)细胞破碎：将丝状菌体中加入稀碱溶液，所说的丝状菌体为青霉素发酵的青霉菌、柠檬酸发酵的黑曲霉菌或乳酸发酵的根霉菌，所用的稀碱溶液没有特别要求，可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾，重量百分浓度最好在1-10％，加入量使碱与丝状菌体的重量比为：0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，搅拌10分钟-4小时，收集菌体，可以采用离心或过滤的方法收集菌体。
(2)酸水解：在步骤(1)收集的菌体中加入重量百分浓度为15-98％的酸，最好是15-37％的盐酸、或40-98％硫酸或硝酸，加入的量使酸与丝状菌体的重量比为：0.4∶1-15∶1，在50-100℃的条件下，水解反应1-10小时，除去残渣。反应最好是在回流或密闭条件下进行，以防止溶液蒸发，降低酸的浓度。
(3)脱酸：将步骤(2)的水解液脱酸，至pH值大于等于1.0。可采用真空减压蒸馏的方法除去酸水解后溶液中残余的酸，也可采用离子交换法脱酸。
(4)壳低聚糖的干燥：将(3)中的溶液干燥制得壳低聚糖。可采用真空干燥、喷雾干燥、气流干燥或冷冻干燥等干燥方法进行处理得到壳低聚糖产品。
本发明以青霉素、柠檬酸和乳酸发酵废菌丝体为原料生产壳聚糖及壳低聚糖的工艺，所得产品质量稳定，不仅大大降低了壳聚糖和壳低聚糖的生产成本、工艺简单，而且也是变废为宝，经分析青霉素、柠檬酸和乳酸发酵菌丝体中含有10％以上的壳聚糖。我国每年废弃的柠檬酸、青霉素或乳酸发酵的菌丝体就达30万吨以上，若用于制备壳聚糖和壳低聚糖，对环境保护具有重要意义。
菌丝体提取壳聚糖与虾壳提取的壳聚糖质量的比较如下：
 虾壳壳聚糖     菌丝体壳聚糖
      外观     白色     白色或淡黄色
    脱乙酰度  70％～80％        ＞85％
 氨基葡萄糖含量     65％       70％～80％
   粘均分子量   6.3×104   2.1×103～5×104
由此知菌丝体提取的壳聚糖分子量较低，但脱乙酰度较高。
下面结合实施例对本发明的方法作进一步的描述：
实施例1：青霉素发酵菌丝体1g，加入12mL 1％NaOH，在70℃下搅拌30分钟，离心除去上清液，在菌体中加入10mL 50％NaOH，在130℃下回流处理3小时，离心除去上清液，用水洗涤菌体到中性，加入10mL 2％HAc溶液，在80℃下搅拌1小时，离心除去菌体，收集上清液，用1mol/LNaOH调节pH到8.0～9.0，搅拌沉淀30分钟，离心收集沉淀，真空干燥后可得到60mg壳聚糖。
实施例2：柠檬酸发酵菌丝体1g，加入10mL 1％NaOH，在60℃下搅拌3小时，离心除去上清液并用水洗涤至上清液无色，加入35％NaOH 10mL在140℃下处理2小时，离心并洗涤菌体至中性，加入10mL5％乙酸，在100℃下搅拌3小时，离心收集上清液，用5mL 5％乙酸再次萃取一次，合并两次萃取液，经喷雾干燥可得到80mg壳聚糖。
实施例3：1g青霉素发酵菌丝体，加入120mL 1％NaOH在70℃下搅拌30分钟，离心除去上清液，在菌丝体中加入100mL浓盐酸(12moL/L)，在80℃下回流反应70分钟，过滤除去未反应的残渣，用旋转真空蒸发器在70℃下蒸干，加入50mL无离子水溶解后再次真空浓缩，如此反复数次浓缩直到溶液pH为2.0时，喷雾干燥即可得到壳低聚糖产品。
经分析知壳低聚糖的组成成分分布如下：
 壳低聚糖  一糖  二糖  三糖  四糖  五糖  六糖  ≥七糖
   含量  40％  20％  12％  6％  4％  2％   16％
实施例4：1g柠檬酸发酵菌丝体，加入100mL 5％NaOH在100℃下搅拌3小时，离心移取上清液。在菌丝体中加入120mL浓盐酸(12mol/L)，在70℃下回流反应100分钟，过滤除去未反应的残渣，上清液通过φ2.0cm×20cm的731树脂阴离子交换柱，收集流出液，真空浓缩至5mL，经冷冻干燥可得到壳低聚糖产品。

Claims (6)

1一种壳聚糖的制备方法，依次包括以下步骤：
   (1)将丝状菌体加入稀碱溶液中，碱与丝状菌体的重量比
为：0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，搅拌10分钟-4小时，收集
菌体；
   (2)在步骤(1)收集的菌体中加入重量百分浓度为10-70％
的浓碱溶液，碱与丝状菌体的重量比为：0.5∶1-14∶1，在50-
200℃条件下，反应1-5小时，收集菌体；
   (3)在步骤(2)收集的菌体中加入重量百分浓度为1-30％
的酸进行萃取，酸与丝状菌体的重量比为：0.05∶1-3∶1，收集
上清液；
   (4)将萃取上清液的pH值调节到大于或等于6.0或加入
C1-C6的醇或C3-C6的酮进行沉淀，收集沉淀物制得壳聚
糖。
2根据权利要求1的制备方法，其特征是：所说的丝状菌体为
 青霉素发酵的青霉菌、柠檬酸发酵的黑曲霉菌或乳酸发酵的
 根霉菌。
3根据权利要求1或2的制备方法，其特征是：步骤(1)中的稀碱溶液为重量百分浓度为1-10％的氨水、氢氧化钠、氢氧化钾溶液；步骤(2)中的浓碱溶液为重量百分浓度为30-60％的氢氧化钠或氢氧化钾溶液，且反应在回流或密闭条件下进行；步骤(3)中的酸为有机酸或盐酸，重量百分浓度为1-20％；步骤(4)中的有机溶剂为丙酮、乙醇或丙醇。
4一种壳低聚糖的制备方法，依次包括以下步骤：
   (1)将丝状菌体加入稀碱溶液中，碱与丝状菌体的重量比
为：0.05∶1-2∶1，在20-100℃下，搅拌10分钟-4小时，收集菌
体；
   (2)在步骤(1)收集的菌体中加入重量百分浓度为15-98％
的酸，酸与丝状菌体的重量比为：0.4∶1-15∶1，在50-100℃的
条件下，水解反应1-10小时，除去残渣；
   (3)将(2)的水解液脱酸，至pH值大于等于1.0；
   (4)将(3)中的溶液干燥制得壳低聚糖。
5根据权利要求3.的制备方法，其特征是：所说的丝状菌体为青霉素发酵的青霉菌、柠檬酸发酵的黑曲霉菌或乳酸发酵的根霉菌。
6根据权利要求3或4的制备方法，其特征是：步骤(2)中的酸为重量百分浓度为15％-37％的盐酸或40-98％的硫酸或硝酸，且水解反应在回流或密闭条件下进行，反应1-4小时；步骤(3)中水解液采用真空减压蒸馏或离子交换法脱酸。
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