CN1240355A - 蛋白激酶c抑制剂增强溶癌剂和放射治疗的临床功效的用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种治疗肿瘤的方法,尤其是使用β－同工酶选择性PKC抑制剂(S)－3,4－[N,N′－1,1′－((2″－乙氧基)－3″′(O)－4″′－(N,N－二甲基氨基)－丁烷)－双－(3,3′－吲哚基)]－1(H)－吡咯－2,5－二酮或其盐,该PKC抑制剂增强溶癌剂和放射治疗的临床功效。

Description

蛋白激酶C抑制剂增强溶癌剂和放射治疗的临床功效的用途

本申请要求1996年5月1日提出的美国临时申请系列号60/016，658的优先权。

本发明广义上涉及一种用PKC抑制剂增强化学治疗和放射治疗的抗瘤效果的方法。本发明尤其涉及蛋白激酶C(PKC)抑制剂，特别是一类特定的同工酶选择性PKC抑制剂与溶癌剂或γ-照射结合增强它们在治疗肿瘤中的抗肿瘤效果的用途。

多年来已开发出了一些治疗肿瘤的方法。有两种主要的治疗肿瘤的方法：1)采用溶癌剂的化学治疗法，和2)放射治疗，如γ-照射。溶癌剂和γ-照射优选对肿瘤细胞产生细胞毒性，并导致细胞死亡。

研究表明γ-照射和一些类别的溶癌剂通过活化编程性细胞死亡或凋亡来发挥它们的细胞毒性效果。凋亡和抗凋亡细胞内信号转导途径之间的平衡对于细胞应答于上述化学治疗以及放射治疗而决定走向编程性细胞死亡是非常重要的。

已建议PKC抑制剂用于癌症治疗，例如参见美国专利5,552,391，已表明PKC活性产生抗编程性细胞死亡效果，尤其是对放射治疗，如γ-照射发生应答时。尤其是，研究已表明PKC的治化抑制由抗瘤剂，如Ara-c，2-氯-2-脱氧腺苷，9-β-D阿拉伯糖基-2-氟腺嘌呤和γ-照射治疗诱导的编程性细胞死亡。还表明肿瘤细胞中的PKC活性的减量调节增强由溶癌剂刺激的编程性细胞死亡。PKC的活化已表明弱化γ-照射诱导的细胞死亡。

本领域中需要开发增强细胞凋亡信号转导途径并从而增强溶癌剂和放射治疗的临床功效的治疗剂。

本发明的一个目的是提供治疗肿瘤的方法。

本发明的另一个目的是提供增强溶癌剂的抗肿瘤效果的方法。

本发明的另一个目的是提供增强放射治疗的抗肿瘤效果的方法。

本发明的这些和其它目的由下述的一个或多个具体实施方案来提供。

在本发明的一个具体实施方案中，提供一种治疗肿瘤的方法，它包括将蛋白激酶C抑制剂与溶癌剂或γ-照射结合在一起对需要这种治疗的哺乳动物给药。

在本发明另一个具体实施方案中，提供一种增强化学治疗和放射治疗的抗肿瘤效果的方法，它包括将蛋白激酶C抑制剂与所述溶癌剂或放射治疗结合在一起给药。

本发明对对本领域提供一种提高细胞中的编程性细胞死亡效果并因此在增强化学治疗和放射治疗的抗肿瘤效果方面有效的方法。

附图简要说明

图1表明苔藓抑制素(bryostatin)1对PKC同工酶的剂量效应。

图2证明与苔藓抑制素1的保温时间对PKC同工酶的影响。

图3证明PKC-β的减量调节增强γ-照射的功效。

图4表明PKC-β的高表达对辐射刺激的细胞死亡产生抗性。

本发明的一个发现是在细胞中PKC抑制剂，尤其是一类特定的蛋白激酶C抑制剂降低或抑制抗凋亡效果的用途。因此，这些化合物可被用来增强化学治疗和放射治疗的抗肿瘤效果。

本发明的方法可采用任何现有技术中已知的PKC抑制剂，包括不同同工酶的非特异性PKC抑制剂和特异性PKC抑制。现有技术中很容易获得关于PKC抑制剂及其制备方法的信息。例如，不同种类的PKC抑制剂及它们的制备描述在美国专利5621101，5621098，5616577，5578590，5545636，5491242，5488167，5481003，5461146，5270310，5216014，5204370，5141957，4990519和4937232中，它们均被本文引作参考。本发明优选使用有效抑制β同工酶的那些蛋白酶C抑制剂。一组适宜的化合物在现有技术中通常被以双吲哚马来酰亚胺或大环双吲哚马来酰亚胺描述。现有技术公认的双吲哚马来酰亚胺包括描述在美国专利5621098，5552396，5545636，5481003，5491242和5057614中的那些化合物，其中所有均被本文引作参考。大环双吲哚马来酰亚胺具体地由式I化合物所代表。这些化合物及其制备方法已公开在被本文引作参考的美国专利5,552,396中。根据本发明，这些化合物与其它抗肿瘤疗法结合在一起对需要这种治疗的哺乳动物进行给药。尤其是，这些化合物可被用来增强化学治疗和放射治疗的抗肿瘤效果。

用于本发明方法的一类优选的化合物具有下面结构式：

其中

W为-O-、-S-、-SO-、-SO₂-、-CO-、C₂-C₆亚烷基、取代的亚烷基、C₂-C₆亚烯基、-芳基-、-芳基(CH₂)_mO-、-杂环-、-杂环-(CH₂)_mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH₂)_mO-、-NR³、-NOR³-、-CONH-、或-NHCO-；

X和Y独立地为C₁-C₄亚烷基、取代的亚烷基，或X，Y和W结合在一起形成-(CH₂)_n-AA-；

R¹为氢或至多四个任选的独立选自卤素、C₁-C₄烷基、羟基、C₁-C₄烷氧基、卤代烷基、硝基、NR⁴R⁵或-NHCO(C₁-C₄烷基)的取代基；

R²为氢、CH₃CO-、NH₂或羟基；

R³为氢、(CH₂)_m芳基、C₁-C₄烷基、-COO(C₁-C₄烷基)、-CONR⁴R⁵、-(C＝NH)NH₂、-SO(C₁-C₄烷基)、-SO₂(NR⁴R⁵)或-SO₂(C₁-C₄烷基)；

R⁴和R⁵独立地为氢、C₁-C₄烷基、苯基、苄基或和与它们键合的氮结合在一起形成饱和或不饱和的5或6元环；

AA为氨基酸残基；

m独立地为0，1，2或3；和

n独立地为2，3，4或5，或其药物可接受的盐，前药或酯。

用于本发明的更为优选的一类化合物由式I表示，其中-X-W-Y-部分包含4-8个原子，且可被取代或未被取代。最优选地，-X-W-Y-部分包含6个原子。

用于本发明方法中的其它优选的化合物为式I的那些化合物，其中R¹和R²为氢；W为取代的亚烷基、-O-、-S-、-CONH-、-NHCO-或-NR³-。尤其优选的化合物为式Ia化合物：

其中Z为-(CH₂)_p-或-(CH₂)_p-O-(CH₂)_p-；R⁴为羟基、-SH、C₁-C₄烷基、(CH₂)_m芳基、-NH(芳基)、-N(CH₃)(CF₃)、-NH(CF₃)，或-NR⁵R⁶；R⁵为氢或C₁-C₄烷基；R⁶为氢、C₁-C₄烷基或苄基；p为0，1或2；和m独立地为2或3，或其药物可接受的盐，前药或酯。式Ia最优选的化合物为其中Z为CH₂；和R⁴为-NH₂-、-NH(CF₃)或-N(CH₃)₂的那些。

用于本发明方法的其它优选化合物为其中式I中的W为-O-，Y为取代的亚烷基，及X为亚烷基的化合物。这些优选的化合物由式Ib表示：

其中Z为-(CH₂)_p-；R⁴为-NR⁵R⁶、-NH(CF₃)，或-N(CH₃)(CF₃)；R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₄烷基；p为0，1或2；及m独立地为2或3，或其药物可接受的盐，前药或酯。最优选的式Ib化合物为其中p为1；及R⁵和R⁶为甲基的那些。

由于它们包含碱性部分，因此式I，Ia和Ib化合物还以药物可接受的酸加成盐形式存在。通常采用的形成这些盐的酸包括无机酸，如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，以及有机酸，例如对甲苯磺酸，甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸和相关的无机和有机酸。这些药物可接受盐因此包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸单氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、2-丁炔-1，4-二酸盐，3-己炔-2，5-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯二甲酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸、乳酸盐、马尿酸盐、β-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘基-1-磺酸盐、萘基-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。尤其使用盐酸盐和甲磺酸盐。

除开药物可接受的盐，还可存在其它盐。它们可在化合物纯化，其它盐的制备、或在化合物或中间体的鉴定和表征中起中间体的作用。

式I，Ia和Ib化合物的药物可接受的盐还可以各种溶剂化物的形式存在，例如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯等。也可制备这些溶剂化物的混合物。这些溶剂化物的来源可来自结晶溶剂，这是制备或结晶溶剂中固有的或这些溶剂中偶然含有的。

式I，Ia和Ib化合物的各种立体异构体形式可能存在；例如W可在取代的亚烷基部分包含手性碳原子。一般将化合物制备成外消旋物并可方便地以这种形式使用。另一方面，如果需要，可用常规方法分离或合成各种对映体。这些外消旋物和各种对映体及其混合物形成用于本发明方法中的化合物的一部分。

用于本发明的化合物还包含式I，Ia和Ib化合物的药物可接受的前药。前药为一种已被化学修饰且在其作用位点可能无生物活性，但可被一种或多种酶或其它体内过程降解或修饰成为母体具有生物活性形式的药物。该前药还可具有与母体不同的药物动力学分布图，使得更为容易地透过粘膜上皮吸收，更好的成盐性或溶解性，和/或提高系统中的稳定性(例如血浆半衰期延长)。通常，这些化学修饰包括下面：1).可被酯酶或脂酶裂解的酯或酰胺衍生物；2).可被特异性或非特异性蛋白酶识别的肽；或3).前药物形式或修饰的前药物形式通过膜选择在作用位点积累的衍生物；或上文1-3的任何组合。选择和制备适宜前药衍生物的方法描述在例如H.Bundgaard，前药物的设计(Design of Prodrugs)中(1985)。

各种双吲哚-N-马来酰亚胺衍生物的合成描述在Davis等的美国专利5,057,614中，适用于本发明的优选化合物的合成描述在前面提到的美国专利5,552,396和Faul等的欧洲专利申请公开号0657411A1中，其均被本文引作参考。

用于本发明方法中的一个尤其优选的蛋白激酶C抑制剂为描述在上面提到的美国专利5,552,396实施例5g中的化合物((S)-3，4-[N，N′-1，1′-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲基氨基)-丁烷)-双-(3′，3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮盐酸盐)。该化合物为有效的蛋白激酶C抑制剂。它对蛋白激酶C的选择性高于对其它激酶且为高度同工酶选择性的，即它选择β-1和β-2同工酶。该化合物的其它盐也是有利的，尤其是甲磺酸盐。

优选的甲磺酸盐可通过在非反应活性有机溶剂中，优选有机溶剂/水混合物，最优选水-丙酮中，将式II化合物与甲磺酸反应。其它溶剂，如甲醇、丙酮、乙酸乙酯和其混合物是可行的。溶剂与水的比例不是关键并通常由试剂的溶解性决定，优选的溶剂与水的比例通常为0.1∶1-100∶1溶剂比水(体积计)。比例优选为1∶1-20∶1，最优选为5∶1-10∶1。最佳比例取决于选择的溶剂，优选丙酮溶剂与水的比例为9∶1。

虽然其它比例，尤其是其中甲磺酸为过量时的那些是可行的，但反应通常涉及大约等摩尔量的两种试剂。加入的甲磺酸的速度对反应不是关键的，并可迅速(＜5分钟)或在6小时或更长时间内缓慢加入。在0℃至回流温度范围下进行反应。搅拌反应混合物直至如用X-射线粉末衍射测定的完成盐的形式，这可能需要5分钟至12小时。

本发明的盐优选并易于制备成结晶形式。通过干燥或暴露于20-60％相对湿度时，可容易地将盐的三水合物转化为一水合物。该盐基本上是显示确定熔点、双折射和X-射线衍射图谱的晶体。通常，晶体具有少于10％的无定形固体，优选少于5％，最优选少于1％的无定形固体。

通过本领域中已知的过滤或其它分离方法直接从反应混合物中分离甲磺酸盐，产率范围为50％至100％。如果需要，本领域中已知的重结晶和其它纯化方法可被用来进一步纯化该盐。

PKC抑制剂，包括上述化合物与常规抗肿瘤疗法结合被用来治疗患肿瘤的哺乳动物，尤其是人类。常规抗肿瘤疗法，包括化学疗法如使用溶癌剂和辐射疗法如γ-照射的方法，是已知且易获得的，并在本领域中常规地实施，例如参见Harrison内科原理(Harrison’s PRNCIPLES OFINTERNAL MEDICINE)，第11版，McGraw-Hill Book Company。

肿瘤的特征在于通常导致的正常组织侵袭的异常生长，如原发肿瘤或扩散至远处器官，如肿瘤转移。通过本发明可增强常规抗肿瘤疗法对任何肿瘤的治疗。这些肿瘤生长包括但不局限于原发肿瘤，用外科技术未完全除去的原发肿瘤，已经适当治疗但具有很大的后来发展成肿瘤转移疾病危险的原发肿瘤以及已确定为肿瘤转移的疾病。

具体地说，上述PKC抑制剂可增强溶癌剂的抗肿瘤效果。根据本发明，可用各种可获得的溶癌剂用于组合治疗。在一个优选的具体实施方案中通过活化编程性细胞死亡或凋亡来发挥它们的细胞毒性的溶癌剂与描述的PKC抑制剂一起结合使用。这包括但不局限于1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶或Ara-c，依托泊甙或VP-16，顺-二氯化二氨铂(II)或顺铂，阿霉素或亚德里亚霉素，2-氯-2-脱氧腺苷，9-β-D-阿拉伯糖基-2-氟腺嘌呤和糖皮质激素。

所有可用这些溶癌剂治疗的肿瘤疾病可根据本发明通过使用PKC抑制剂与一种或多种溶癌剂的组合来进行治疗。溶癌剂在各种特定肿瘤疾病中发挥细胞毒性或抗肿瘤效果。例如Ara-c通常用来治疗幼儿无效的急性淋巴细胞白血病(ALL)，胸腺ALL，B-细胞ALL，急性骨髓白血病，急性粒细胞白血病和其变异形式，非Hodgkin氏淋巴瘤，骨髓单核细胞白血病，急性巨噬细胞白血病和Burkitt氏淋巴瘤，成人-B-ALL，急性骨髓白血病。慢性淋巴细胞白血病，慢性骨髓白血病和T-细胞白血病。VP-16通常用于治疗睾丸癌，小和大型非小型细胞肺癌，Hodgkin氏淋巴瘤，非Hodgkin氏淋巴瘤，绒毛膜癌，Ewing氏肉瘤，和急性粒细胞白血病。顺铂可用于治疗睾丸癌，胚细胞肿瘤，卵巢癌，前列腺癌，肺癌，肉瘤，颈癌，子宫内膜癌，胃癌，乳腺癌和头颈癌。2-氯-2-脱氧腺苷和9-β-D-阿拉伯糖基-2-氟腺嘌呤可用来治疗慢性淋巴细胞白血病，淋巴癌和毛状细胞白血病。阿霉素可用来治疗急性粒细胞白血病及其变异形式，ALL，乳腺癌，膀胱癌，卵巢癌，甲状腺癌，肺癌，Hodgkin氏淋巴瘤，非Hodgkin氏淋巴瘤，肉瘤，胃癌，前列腺癌，子宫内膜癌，Wilin氏肿瘤和成神经细胞瘤。溶癌剂在包括上面讨论的所有可用溶癌剂治疗的肿瘤疾病中的临床效果可根据本发明通过使用与确定的PKC抑制剂的结合治疗而得以增强。

本发明确定的PKC抑制剂还可以增强放射治疗的抗肿瘤效果。通常γ-照射被直接用来治疗实体肿瘤部位。

本发明提供的实验结果证明蛋白激酶C-β的完全减量调节或损失与人白血病细胞中的溶癌剂诱导的编程性细胞死亡的协同性增强相关(图1)。相似地，U937人白血病细胞中的蛋白激酶C-β的显著的减量调节增加辐射刺激细胞的死亡(图2)。过度表达蛋白激酶C-β的U937人白血病细胞显示出对辐射刺激细胞死亡的抗性(图3)。这些数据提供一个有力的说明，即PKC抑制剂，尤其是本发明优选使用的β同工酶选择抑制剂可增强化学治疗和放射治疗的杀伤肿瘤或抗肿瘤效果，并提高对这些目前采用的治疗方式的临床应答。

本发明的PKC抑制剂与包括溶癌剂和放射治疗的其它抗肿瘤疗法一起结合施用。词语“与其它疗法结合”指可在这些其它抗肿瘤疗法稍前，稍后，或同时施用化合物。化合物可与一种以上的抗肿瘤疗法一起结合施用。在一个优选的具体实施方案中，在任何化学疗法之前2周至1天，或在任何辐射疗法之前2周至1天施用化合物。另一方面，在化学疗法和辐射疗法期间可施用PKC抑制剂。如果在化学疗法或辐射疗法之后施用，应在初次治疗之后的1-14天内给药PKC抑制。

本领域技术人员将理解根据本发明的与其它抗肿瘤剂或疗法结合施用的PKC抑制剂的量为足以增强溶癌剂或辐射疗法抗肿瘤效果的量或足以诱导细胞凋亡或细胞死亡的量。尤其是，取决于肿瘤的大小和类型，化合物在治疗制剂中的浓度，采用的具体抗肿瘤剂，相对于其它疗法的施用PKC抑制剂的时间选择以及病人的年龄、体重和状况，可改变此量。

体内和体外试验可被用来评价用于诱导细胞凋亡所需的化合物的量。例如，人白血病细胞可在体外在存在或不存在用于本发明的PKC抑制剂化合物时，暴露于各种浓度的溶癌剂中如Ara-c或暴露于辐射中。适宜的肿瘤细胞类型可被选择用于不同的溶癌剂。其它蛋白激酶C选择性抑制剂也可用于比较。在各种时间点，用常规方法或在现有技术中可获得的任何方法检测细胞的存活率。可通过现有技术任何已知方法测定细胞凋亡或细胞死亡，可借助于台盼蓝排阻法测定和定量细胞死亡，以及在软琼脂中测定和定量克隆发生的减少。如本领域技术人员熟知的，细胞凋亡是一种特定类型的细胞死亡，由包括但不局限于内切酶裂解(DNA阶梯)、异常DNA断裂和染色质和细胞质凝聚(凝聚和点状核)的形态学、生物化学及分子变化的特征性方式所识别。这些变化可容易地通过现有技术已知的任何方法来检测，如显微镜；基于DNA对变性的敏感性增加和光散射性质改变的流式细胞法；由琼脂糖凝胶电泳分析的DNA片段化；末端DNA转移酶分析(TdT分析)和切口翻译分析(WT分析)。

使用将肿瘤异种移植物接种到免疫低下或Sygenic动物中可进行体内研究。在接种及初级移植物生长之后，在暴露于所需溶癌剂或放射治疗之前，将动物用本发明化合物处理。在存在和不存在本发明化合物时各种处理前后的肿瘤移植物的大小可被用作该处理治疗功效的指标。

通常，与其它抗肿瘤疗法结合施用的蛋白激酶C抑制剂的量由诊疗医生根据情况决定。作为指导，当决定适宜剂量时，除其它因素将考虑肿瘤的范围、病人体重及年龄。通常，本发明的PKC抑制剂可望将溶癌剂和辐射疗法的抗肿瘤效果提高约2倍至约10倍。

通常，适宜剂量为在肿瘤细胞部位导致蛋白激酶C抑制剂浓度为0.5nM-200uM，较通常为20nM-80nM范围的剂量。预计在大多数情况中40nM-150nM的血清浓度应当是足够的。

为了获得治疗浓度，对可能需要治疗的病人给药在约0.1mg/天/Kg体重至1.5mg/天/Kg体重之间。通常，应需要不大于约1.0mg/天/Kg体重的蛋白激酶C抑制剂。如上所述，上面的量可随情况而变化。

优选在给药前配制式I化合物和式Ia和Ib的优选化合物。通过已知方法使用熟知及易得的成分制得适宜的药物制剂。在制备适用于本发明方法的组合物时，通常将活性成分与载体混合，或用载体稀释，或密封在可为胶囊、药袋、纸或其它容器形式的载体中。当载体起稀释剂作用时，它可为作为活性成分的载体、赋形剂或介质的固体、半固体或液体物质。因此，该组合物可为用于口服和局部施用的片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、烟雾剂(作为固体或在液体介质中)、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉剂形式。

适宜载体、赋形剂和稀释剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍糖、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂可另外包括润滑剂、湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、增甜剂或调味剂。可配制本发明组合物以在病人服用后提供迅速、持续或延迟的活性成分的释放。优选将组合物配制成单剂形式，每剂包含约0.05mg-约3g，较通常为约64mg的活性成分。然而，应理解治疗剂量将由医生根据包括治疗疾病的严重性、给药化合物的选择以及选择的给药途径的相关情况来决定。因此，上面的剂量范围不以任何方式限制本发明。术语“单剂形式”指医生确定的适宜作为用于人和其它哺乳动物的单元剂量的单位，其中每个单位包含与适宜药物载体结合的已计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质。

除开其中大多数均可被口服的上面的制剂，用于本发明方法中的化合物还可局部给药。局部给药制剂包括软膏、乳膏和凝胶。

通常使用(1)油性基质，即由固定油或烃组成，如白矿脂或矿物油，或(2)吸收基质，即由无水物质或可吸收水的物质组成，如无水羊毛脂来制备。通常，在形成基质后，无论是含油或吸收性的，均加入活性成分(化合物)至一定量以提供所需浓度。

乳膏为油/水乳液。它们由油相(内部相)和水相(连续相)组成，其中油相通常包括固定油、烃等、如蜡、矿脂、矿物油等，水相包括水和任何水溶性物质，如加入的盐。通过使用乳化剂，例如表面活性剂，如十二烷基硫酸钠；亲水胶体，如阿拉伯胶体粘土、V形树胶等来稳定两相。在形成乳液时，通常加入获得所需浓度的量的活性成分(化合物)。

凝胶包含选自含油基质、水或乳液-悬浮液基质的基质。向基质中加入在基质中形成基体的胶凝剂以增加其粘度。胶凝剂的例子为羟基丙基纤维素、丙烯酸聚合物等。通常，在开始加入胶凝剂之前，以所需浓度向制剂中加入活性成分(化合物)。

掺入到局部制剂中的化合物的量不是关键；浓度应在足以允许制剂以将化合物的所需量运送到所需治疗部位的量便利地施用于患病组织区域的范围内。

施用于患病组织的局部制剂的通常量将取决于患病组织大小和制剂中化合物的浓度。通常，制剂以提供约1-约500μg化合物/cm²患病组织的量施用于患病组织。优选地，化合物的施用量在约30-约300μg/cm²，较优选地在约50-约200μg/cm²，最优选地在约60-约100μg/cm²之间变化。

下面的制剂实施例仅仅说明而绝不以任何方式限制本发明的范围。制剂1

使用下列成分制备硬明胶胶囊：

                     量

                  (mg/胶囊)

活性剂              250

淀粉，干的          200

硬脂硬镁             10

总计                460mg

将上面成分混合并以460mg的量填至硬明胶胶囊中。制剂2

使用下列成分制备片剂

                    量

                  (mg/胶囊)

活性剂              250

微晶纤维素          400

二氧化硅，发烟的     10

硬脂酸                5

总计                665mg

将各成分混合并挤压形成各片重665mg的片剂。制剂3

如下制备每片含60mg活性成分的片剂：

                      量

                    (mg/片剂)

活性制                60mg

淀粉                  45mg

微晶纤维素            35mg

聚乙烯吡咯烷酮

(为10％的水溶液)       4mg

羧甲基淀粉钠         4.5mg

硬脂酸镁             0.5mg

滑石                   1mg

总计                 150mg

将活性成分、淀粉和纤维素通过NO.45号U.S.筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与产生的粉末混合，接着通过NO.14号U.S.筛。将如此产生的颗粒在50℃下干燥并通过NO.18号U.S.筛。接着将羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和事先通过NO.60号U.S.筛的滑石加入到颗粒中，在混合后，其被在造粒机上压制产生每片重150mg的片剂。实施例实施例1.苔藓抑制素对PKC同工型的作用

本实验证明苔藓抑制素对PKC同工型的剂量及时间效果。

将0.5×10⁶量的人白血病细胞U937用各种量的苔藓抑制素1处理24小时。随后，根据常规方法，稳定细胞以用于制备蛋白样品。如以前描述在Ways等，细胞生长和分化(Cell Growth & Differentiation)1994，5：1195-1203中的方法，接着将来自苔藓抑制素处理的细胞的蛋白样品用于使用蛋白激酶C-β特异性抗血清的蛋白质印迹分析中。如图1和2所示，苔藓抑制素1处理导致PKC-β活性在一定的时间内降低，即10nM苔藓抑制素1在2小时内影响PKC-β，或1nM苔藓抑制素1在24小时内影响PKC-β。在重复实验中，获得了类似结果。实施例2.由PKC-β减量调节导致的γ-照射的功效增强

本实验证明PKC-β减量调节增强γ-照射的功效。

将人白血病细胞U937用3nM苔藓抑制素1或对照溶液即苔藓抑制素1的载体处理24小时，接着将细胞用500或1000拉德γ-射线照射。照射后72小时，使用碘丙锭排阻法检测并用如以前描述在Ways等，细胞生长和分化1994，5：1195-1203中的FACS分析定量细胞存活力。将存活力分析进行三次。如图3中所示，在当使用苔藓抑制素1将PKC-β明显地减量调节的条件下，增强了γ-照射诱导的编程性细胞死亡。在几个重复实验中获得了类似的结果。实施例4.细胞过度表达PKC-β显示对辐射刺激的细胞死亡的抗性

将亲代U937细胞和U937PKC-ζ过度表达细胞(PKC-ζ细胞)用0,500或1000拉德γ-照射处理。已知PKC-ζ细胞显示出增加水平的PKC-β(Ways等，细胞生长和分化，1994，5：1195-1203)。照射后72小时，使用碘丙锭排阻法测定并用如以前描述在Ways等，细胞生长和分化，1995，6：371-382中的FACS法定量细胞存活力。将存活力分析重复三次。如图4所示，具有高水平PKC-β的细胞显示出对辐射刺激的细胞死亡的抗性。在几个重复实验中获得类似结果。

在前面说明书中已描述了本发明的原理、优选的具体实施方案和操作方式。然而，本申请要保护的本发明不应被认为是局限于所公开的具体形式中，因为它们应被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本发明实质的前提下，本领域技术人员可作出各种变化和改变。

Claims (15)

1.一种治疗肿瘤的方法，其包括将具有抗肿瘤效果的溶癌剂与蛋白激酶C抑制剂结合施用于需要这种治疗的哺乳动物，其中蛋白激酶C抑制剂增强溶癌剂的抗肿瘤效果。

2.权利要求1的方法，其中蛋白激酶C抑制剂为蛋白激酶C的β同工型的抑制剂并为双吲哚基马来酰亚胺或大环双吲哚基马来酰亚胺。

3.权利要求1的方法，其中蛋白激酶C抑制剂为同工酶选择性的，且其中同工酶选择性选自β-1和β-2同工酶。

4.权利要求3的方法，其中蛋白激酶C抑制剂具有下面的结构式

其中W为-O-、-S-、-SO-、-SO₂-、-CO-、C₂-C₆亚烷基、取代的亚烷基、C₂-C₆亚烯基、-芳基-、-芳基(CH₂)_mO-、-杂环-、-杂环-(CH₂)_mO-，-稠合双环-、-稠合双环-(CH₂)_mO-、-NR³、-NOR³-、-CONH-或-NHCO-；X和Y独立地为C₁-C₄亚烷基、取代的亚烷基或X，Y和W结合在一起形成-(CH₂)_n-AA-；R¹为氢或至多四个任选的独立选自卤素、C₁-C₄烷基、羟基、C₁-C₄烷氧基、卤代烷基、硝基、NR⁴R⁵或-NHCO(C₁-C₄)烷基的取代基；R²为氢、CH₃CO-、NH₂或羟基；R³为氢、(CH₂)_m芳基、C₁-C₄烷基、-COO(C₁-C₄烷基)、-CONR⁴R⁵、-(＝NH)NH₂、-SO(C₁-C₄烷基)、-SO₂(NR⁴R⁵)或-SO₂(C₁-C₄烷基)；R⁴和R⁵独立地为氢、C₁-C₄烷基、苯基、苄基、或和与它们键合的氮结合在一起形成饱和或不饱和的5或6元环；AA为氨基酸残基；m独立地为0，1，2或3；及n独立地为2，3，4或5，或其药物可接受的盐，前药或酯。

5.权利要求4的方法，其中蛋白激酶C抑制剂具有下面的结构式其中Z为-(CH₂)_p-或-(CH₂)_p-O-(CH₂)_p-；R⁴为羟基、-SH、C₁-C₄烷基、(CH₂)_m芳基、-NH(芳基)、-N(CH₃)(CF₃)、-NH(CF₃)或-NR⁵R⁶；R⁵为氢或C₁-C₄烷基；R⁶为氢、C₁-C₄烷基或苄基；p为0，1或2；及m独立地为2或3，或其药物可接受的盐，前药或酯。

6.权利要求4的方法，其中蛋白激酶C抑制剂具有下面的结构式：

其中Z为-(CH₂)_p-；R⁴为-NR⁵R⁶、-NH(CF₃)或-N(CH₃)(CF₃)；R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₄烷基；p为0，1或2；及m独立地为2或3，或其药物可接受的盐，前药或酯。

7.权利要求4的方法，其中蛋白激酶C抑制剂包括(S)-3，4-[N，N′-1，1′((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲基氨基)-丁烷)-双-(3，3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮或其药物可接受的盐。

8.权利要求1的方法，其中溶癌剂选自Ara-c，VP-16、顺铂、阿霉素、2-氯-2-脱氧腺苷、9-β-D-阿拉伯糖基-2-氟腺嘌呤和糖皮质激素。

9.一种治疗肿瘤的方法，其包括将具有抗肿瘤效果的γ-照辐与蛋白激酶C抑制剂结合施用于需要这种治疗的哺乳动物，其中蛋白激酶C抑制剂增强γ-照射的抗肿瘤效果。

10.权利要求9的方法，其中蛋白酶C抑制剂为蛋白激酶Cβ同工酶的抑制剂，且为双-吲哚基马来酰亚胺或大环双吲哚基马来酰亚胺。

11.权利要求9的方法，其中蛋白激酶C抑制剂为同工酶选择性的，且其中同工酶选择性选自β-1和β-2同工酶。

12.权利要求11的方法，其中蛋白激酶C抑制剂具有下面的结构式

其中W为-O-、-S-、-SO-、-SO₂-、-CO-、C₂-C₆亚烷基、取代的亚烷基、C₂-C₆亚烯基、-芳基-、-芳基(CH₂)_mO-、-杂环-、-杂环-(CH₂)_mO-、-稠合双环-，-稠合双环-(CH₂)_mO-、-NR³-、-NOR³-、-CONH-或-NHCO-；X和Y独立地为C₁-C₄亚烷基、取代的亚烷基或X，Y和W结合在一起形成-(CH₂)_n-AA-；R¹为氢或至多四个任选的独立选自卤素、C₁-C₄烷基、羟基、C₁-C₄烷氧基、卤代烷基、硝基、NR⁴R⁵，或-NHCO(C₁-C₄)烷基的取代基；R²为氢、CH₃CO-、NH₂或羟基；R³为氢、(CH₂)_m芳基、C₁-C₄烷基、-COO(C₁-C₄烷基)、-CONR⁴R⁵、-(C＝NH)NH₂、-SO(C₁-C₄烷基)、-SO₂(NR⁴R⁵)或-SO₂(C₁-C₄烷基)；R⁴和R⁵独立地为氢、C₁-C₄烷基、苯基、苄基或和与它们键合的氮结合在一起形成饱和或不饱和5或6元环；AA为氨基酸残基；m独立地为0，1，2或3；及n独立地为2，3，4或5或其药物可接受的盐，前药或酯。

13.权利要求12的方法，其中蛋白激酶C抑制剂具有下面的结构式：

其中Z为-(CH₂)_p-或-(CH₂)_p-O-(CH₂)_p-；R⁴为羟基、-SH、C₁-C₄烷基、(CH₂)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH₃)(CF₃)、-NH(CF₃)，或-NR⁵R⁶；R⁵为氢或C₁-C₄烷基；R⁶为氢、C₁-C₄烷基或苄基；p为0，1或2；及m独立为2或3，或其药物可接受的盐，前药或酯。

14.权利要求12的方法，其中蛋白激酶C抑制剂具有下面的结构式

其中Z为-(CH₂)_p-；R⁴为-NR⁵R⁶、-NH(CF₃)或-N(CH₃)(CF₃)；R⁵和R⁶独立地为H或C₁-C₄烷基；p为0，1或2；及m独立地为2或3，或其药物可接受的盐，前药或酯。

15.权利要求12的方法，其中蛋白激酶C抑制剂包括(S)-3，4-[N，N- 1，1-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N，N-二甲基氨基)-丁烷)-双-(3，3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2，5-二酮或其药物可接受的盐。

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