CN1239907C - 一种蛋白芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤：A：准备好含有足够量的活化基团活化处理的玻璃芯片片基；B：将待点样的蛋白质抗原和质控蛋白用点样缓冲液进行梯度稀释；C：点样设计：按如下表格：质控蛋白线见右下式，E：点样：按本发明的图案设计点样，室温下(25℃)放置3小时；F：封闭：用含1%BSA的PBS封闭1小时；G：干燥：在真空干燥箱内干燥后装于有干燥剂的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6个月。该蛋白芯片的检测结果会以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”的图案显示出来，利于显微镜或扫描仪观察分析。与习用相比，本发明可实现生物芯片技术的普及化和结果判断方法的简单实用化的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片，尤指一种蛋白质芯片的制备方法。
背景技术
在现阶段，临床检验人员及科研人员都习惯用“+”、“-”的形式来判定免疫学凝集试验和荧光试验的结果。例如：在玻片上进行的凝集实验，就以“-”代表试验阴性；“+”代表阳性(一个加号)；“++”代表中阳性(两个加号)；“+++”代表中强阳性(三个加号)；“++++”代表强阳性(四个加号)；从“+”到“++++”的变化代表被检测物质含量的变化，以此来进行标本的半定量分析。同样，在免疫荧光技术中，更常用“+”的形式来判定显微镜下视野中荧光分子的数量。如若满视野均见荧光染色，可判为“++++”，而每个视野只看到一、两个的荧光染色，则判一个“+”；否则为“-”阴性结果。
如同一份标本，经两次检测后显色由“+++”变成“+”，表示待检标本中某种抗原或抗体的量由多变少，以利于临床医生判断治疗的效果等。
上述方法显示结果的共同点是均由肉眼来主观判定，人为的误差因素较多，不同的观察者，观察的结果差异很大，造成观察结果不客观。
生物芯片技术的发展，使原来分多次检测的步骤只需一次即可完成，实现了高通量并行检测的目的，不但效率高，且节约试剂和人力。但就目前来说，生物芯片检测结果的判断均以荧光点的出现与否及荧光分子的数量获取为主要方法，必须依靠需要精密仪器和配套软件方可作出最后的分析，这对大多数没有精密仪器和分析软件的用户来说，无疑是不现实的，且只适用于科研，不适用于临床应用，处理结果属静态分析，而无动态分析的任何因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质芯片的制备方法，其可实现生物芯片技术的普及化和结果判断方法的简单实用化。
本发明的目的是这样实现的：
一种蛋白芯片的制备方法，其包括如下步骤：
A：准备好含有足够量的活化基团活化处理的玻璃芯片片基；
B：准备待点样的蛋白质抗原：将待点样的蛋白质用点样缓冲液进行梯度稀释；
C：准备质控蛋白：一般要经过多次实验，使其与标记物能够足量而稳定地结合，无论待检样品是阳性还是阴性，均能够出现质控线，当某一浓度点样后在扫描仪或显微镜下能够清楚地观察到即可，此蛋白同样用点样缓冲液进行梯度稀释；
D：点样设计：按如下表格：
质控蛋白线
E：点样：将竖向点样蛋白和横向质控蛋白分别按上述图案点样于设计好的方格内，室温下放置3小时；
F：封闭：用含1％BSA的PBS封闭1小时；
G：干燥：在真空干燥箱内干燥后装于有干燥剂的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6个月。
其中，所述的玻璃芯片片基为带有能与蛋白质结合的活性基团的片基。
更优的，所述的玻璃芯片片基为醛基片或赖氨酸片。
该蛋白芯片的检测结果会以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”的图案显示出来，利于显微镜或扫描仪观察分析。
所述步骤E的点样方式为用人工点样或用生物芯片点样机点样。
采用上述制备方法后，将传统的临床医生普遍使用的“++++”→“+”的判断方法设计在蛋白质芯片上，并且通过普通显微镜、荧光显微镜、灰度摄相仪及生物芯片扫描分析仪均可分析结果，这种结果是客观的，彻底消除了人为因素造成的判断误差，直接在视野里或显示器上显示“++++”、“+”→“-”的变化符号，临床人员只需登记或打印结果而已，这些变化符号本身就含有量的成分，让实验员只测一次就有一个含量的指标；另外，这种判断方法非常适合于临床疾病治疗过程中的疗效观察和治疗前后的对比分析，结果一目了然，没有模糊之处，具有动态分析的优点；比精密仪器和软件所获取的荧光分子数量等静态的、死板的方法更贴近临床实用，从而达到生物芯片技术的普及化和结果判断方法的简单实用化的目的。
附图说明
图1为使用本发明后芯片的显示结果与传统判断结果及其所代表的临床意义对比示意图。
具体实施方式
实施案例：最典型的为HP感染和IAA的测定用蛋白芯片。
实施例1
HP蛋白芯片的制备：临床上大多数检测工作需要观察动态的变化过程
HP蛋白芯片的制备方法包括以下步骤：
A：准备好含有足够量的活化基团的醛基化玻璃芯片片基；
B：将HP抗原(如CagA)用点样缓冲液(一般为PH9.5的CB或PH7.4的PBS含40％的甘油)系列稀释，共四个浓度梯度，如：
1∶20、1∶40、1∶80、1∶160
C：准备质控蛋白：一般要经过多次实验，使其与标记物能够足量而稳定地结合，无论待检样品是阳性还是阴性，均能够出现质控线，当某一浓度点样后在扫描仪或显微镜下能够清楚地观察到即可，此蛋白同样用点样缓冲液进行梯度稀释；
D：点样设计：按如下表格：
质控蛋白线
(注：此图案是点在1×1cm的方格内放大后的示意图)
E：点样：将竖向点样蛋白和横向质控蛋白分别按上述图案点样于设计好的方格内(1×1cm大小)，室温下(25℃)放置3小时；
F：封闭：用含1％BSA的PBS封闭1小时；
G：干燥：在真空干燥箱内干燥后装于有干燥剂的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6个月。
VacA和Ure-B的芯片制备同上法。
消化性溃疡及部分胃癌的发病与幽门螺杆菌(HP)的感染有很大关系，HP感染后患者体内有HP-IgG的存在。临床上一般以根除HP作为治愈的标准。因此在治疗过程中需要监测血中HP-IgG的动态变化，直至HP-IgG消失为准。可以将HP的抗原成分CagA、VacA、Ure-B等以本发明的设计方法点样，制成蛋白芯片试剂，来监测相应的抗体变化。如图1所示，A代表芯片的显示结果，B代表传统的判断结果，C代表临床意义，X1表示待测物质含量为四个“+”号(强阳性)，X2表示待测物质含量为三个“+”号(中强阳性)，X3表示待测物质含量为两个“+”号(中阳性)，X4表示待测物质含量为一个“+”号(阳性)，X5表示待测物质含量为阴性；此显示为质控线，质控线在每次情况下均应出现，若不出现，则说明芯片失效。若治疗前HP-IgG测定结果为“++++”，而治疗一段时间后变成“+”说明治疗有效，可继续治疗直至检测为“-”。这样每检测一次即可同时观测HP三种抗原CAgA、VacA、Ure-B的消减情况，以使临床医生能够更好地采取治疗方案。
实例2
IAA+ICA+GAD三联蛋白芯片的制备：
IAA+ICA+GAD三联蛋白芯片的制备方法包括以下步骤：
A：准备好含有足够量的活化基团的醛基化玻璃芯片片基；
B：将点样抗原(如IAA等)用点样缓冲液(一般为PH9.5的CB或PH7.4的PBS含40％的甘油)系列稀释，共四个浓度梯度，如：
1∶20、1∶40、1∶80、1∶160
C：准备质控蛋白：一般要经过多次实验，使其与标记物能够足量而稳定地结合，无论待检样品是阳性还是阴性，均能够出现质控线，当某一浓度点样后在扫描仪或显微镜下能够清楚地观察到即可，此蛋白同样用点样缓冲液进行梯度稀释；
D：点样设计：按如下表格：
质控蛋白线
(注：此图案是点在1×1cm的方格内放大后的示意图)
E：点样：将竖向点样蛋白和横向质控蛋白分别按上述图案点样于设计好的方格内(1×1cm大小)，室温下(25℃)放置3小时；
F：封闭：用含1％BSA的PBS封闭1小时；
G：干燥：在真空干燥箱内干燥后装于有干燥剂的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6个月。
ICA和GAD可以用同样方法点样，三者可以放在一个方格内。
抗胰岛素抗体(IAA)存在于胰岛素治疗的糖尿病患者血清中，接受胰岛素治疗后，IAA一般在3-6个月出现，9-12个月时达到高峰；如停止用药，则3-9个月内抗体可消减直至消失。停药后一段时间，若再次使用胰岛素治疗，则IAA浓度迅速上升；因此，IAA这种动态变化的过程最适合于动态显示测定方法。测定IAA为改进糖尿病治疗方案提供了重要的依据，也是评价药用胰岛素的质量(免疫原性和纯度)的一种可靠指标。本发明已用于糖尿病患者血清IAA的测定，共测定了500例，已显示良好的一致性。++++到+、-的变化非常适用于上述疾病的检测。
本发明方法完全可以应用于IAA的检测，并以动态方法显示结果。用本发明方法更可以将IAA、ICA(抗胰岛细胞抗体)和GAD(抗谷氨酸脱羧酶抗体)同时测定，以更全面地观察糖尿病患者IAA、ICA、GAD的变化。对糖尿病的分型和治疗有非常实用的价值。若用胰岛素治疗前用蛋白芯片检测到IAA为“+”，而治疗过程中检测IAA时已升至为“++”或“+++”，则证明该患者对胰岛素已不敏感，或胰岛素质量不符合标准，应停药另设计治疗方案或换药。这在糖尿病治疗中非常重要。
当应用于患者样品检测时，待检测样品在本芯片上反应完毕后加如已标记的示踪物，通过检测荧光或酶与底物的反应颜色即可观察到++++到+、-的变化。
上述点样抗原的四个浓度是经过与传统方法多次对比后选择出来的，不是随便一个浓度就适合点样，要充分考虑到检测的灵敏度和特异性。生产不同品种的芯片所用的点样浓度范围是不同的，也与蛋白质的含量有直接关系。
本发明非常切合临床检验人员对实验结果判断的传统习惯，易于推广和接受，结果直观、客观，并有动态分析的优点和临床实用价值。在将来成套试剂盒中可以直接使用这种方法来生产蛋白质芯片检测试剂。也为生物芯片试剂真正走上临床应用开辟了新途径。
Claims (4)
1、一种蛋白芯片的制备方法，其特征在于：包括有如下步骤：
A：准备好含有足够量的活化基团活化处理的玻璃芯片片基；
B：准备待点样的蛋白质抗原：将待点样的蛋白质用点样缓冲液进行梯度稀释；
C：准备质控蛋白：一般要经过多次实验，使其与标记物能够足量而稳定地结合，无论待检样品是阳性还是阴性，均能够出现质控线，当某一浓度点样后在扫描仪或显微镜下能够清楚地观察到即可，此蛋白同样用点样缓冲液进行梯度稀释；
D：点样设计：按如下表格：
E：点样：将竖向点样蛋白和横向质控蛋白分别按上述图案点样于设计好的方格内，室温下放置3小时；
F：封闭：用含1％BSA的PBS封闭1小时；
G：干燥：在真空干燥箱内干燥后装于有干燥剂的袋中密封4℃冰箱保存，至少保存6个月。
2、如权利要求1所述的一种蛋白芯片的制备方法，其特征在于：所述的玻璃芯片片基为带有能与蛋白质结合的活性基团的片基。
3、如权利要求2所述的一种蛋白芯片的制备方法，其特征在于：所述的玻璃芯片片基为醛基片或赖氨酸片。
4、如权利要求1或2所述的一种蛋白芯片的制备方法，其特征在于：该蛋白芯片的检测结果会以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”的图案显示出来，利于显微镜或扫描仪观察分析。
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