CN1945330A

CN1945330A - 磁－金核壳型复合纳米颗粒标记技术

Info

Publication number: CN1945330A
Application number: CN 200610126854
Authority: CN
Inventors: 聂棱
Original assignee: XINNAKANG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd HUBEI
Current assignee: XINNAKANG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd HUBEI
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2007-04-11

Abstract

本发明涉及一种磁－金核壳型复合纳米颗粒标记技术，将标记有待测目的蛋白的抗体或抗原的磁－金核壳型复合纳米颗粒去结合待测目的蛋白，结合了标记物的待测目的蛋白被检测带上的相应抗体或抗原所捕获，在肉眼对检测带进行初步定性的基础上，再以磁力测定仪对该检测带进行定量检测。本发明使用的磁－金核壳型复合纳米颗粒标记技术建立的诊断试剂盒，能定性及定量检测，外加磁场能富集待测目的蛋白，显著增加灵敏度，操作简单方便。

Description

磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术

[技术领域]

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及在医学检验中应用的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术及快速诊断试剂盒。

[背景技术]

免疫金标技术在生物医学领域，特别是医学检验中已经得到广泛的应用，胶体金具有高电子密度、能与多种大分子结合的特点，免疫金标技术正是利用了金颗粒的这一特征，当金标蛋白在相应的配体处大量聚集时呈现肉眼可见的红色斑点，因此可用于定性或半定量的快速免疫检测方法。与放免法、酶标法相比，具有操作简单、使用安全(无放射性物质污染)、适于单人份检测、和快速等优点，因此，金标诊断试剂盒在某些项目上已经逐渐取代了放免、酶标试剂盒，如早早孕试剂条等。

但目前免疫金标技术在实际运用中有下列缺点：

1.单纯以显色深浅来判断结果，只能作定性或半定量检测，而不能做定量检测，因此只适合于普查筛选。

2.由于方法学的限制，只使用免疫金标技术建立的快速诊断试剂盒的灵敏度较低；对于抗原或抗体含量低的样品，可能造成假阴性，从而降低检出率。

针对上述单一的免疫金标技术的不足，近来，有人提出免疫胶体金和免疫磁性粒子双标记技术，其技术要点是将待测目的蛋白的抗体或抗原标记磁性粒子，形成磁珠，再标记胶体金，使该抗体或抗原同时带有两个标记物，然后以此双标记了的抗体或抗原去结合待测样品中的目的抗原或抗体，最终被固定在膜上检测区的相应抗体或抗原所捕获，形成检测带，在肉眼对检测带进行初步定性或半定量检测的基础上，再以磁性测定仪对该检测带进行定量检测。

但上述双标记技术存在如下缺点：

1.由于须将待测目的蛋白的抗体或抗原标记磁性粒子，形成磁珠，然后再标记胶体金，两次标记过程，增加制备难度。

2.上述双标记的待测目的蛋白的抗体或抗原稳定性减低，须在干燥环境下待用。

[发明内容]

针对现有技术的上述缺点，本发明的目的在于提供一种高灵敏、稳定性好、操作简易的检测方法，技术方案如下：

1.磁-金核壳型复合纳米颗粒的制备。

2.标记：将复合纳米颗粒标记到待测目的蛋白的抗体或抗原上。

3.固相反应：将上述标记物喷到试剂条一端的玻璃纤维素膜上形成复合纳米颗粒垫，建立反应区，使之与待测样品中的目的蛋白结合；

4.液相反应及富集：上述标记物也可以在液相中与待测样品中的目的蛋白结合，外加磁场，分离得到沉淀，再分散到溶液中，制成富集待测目的蛋白的待检样品；

5.光学检测：上述富集或非富集的结合了标记物的待测目的蛋白最终被固定在试剂条另一端显色区的相应抗体或抗原所捕获，形成检测带，进行初步定性或半定量检测；

6.磁学检测：在上述光学检测的基础上，再以磁力测定仪对该检测带进行定量检测。

所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒是以磁纳米颗粒为核心，外壳为金所部分或全部包被的一种核壳型复合纳米颗粒(见图1、2)，其中金全部包被的复合纳米颗粒包括以下三种类型：核、壳分别为磁颗粒和金(如图1A)；核、壳分别为磁颗粒和金，核壳之间为中间层(如图1B)；核、壳分别为分散在中间层的磁颗粒和金(如图1C)。

所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒可根据要求制备成直径自10nm至1000nm之间任意大小的复合磁性粒子，将其标记到目的抗体或抗原相应的抗原或抗体上。

上述所形成的检测带是肉眼可见或不可见的检测带：可见检测带为样品中有目的蛋白并且浓度很高使检测带上集聚的复合纳米颗粒能为肉眼所见，不可见检测带为样品中无目的蛋白或者浓度很低使检测带上集聚的复合纳米颗粒不能被肉眼识别。

本发明使用的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术建立的诊断试剂盒，既能定性检测又能定量检测，液相反应液外加磁场能富集待测样品中的目的蛋白，显著增加检测灵敏度，操作简单方便。

使用本发明技术生产的试剂条，可先根据检测带的显色与否，肉眼判断结果的阴阳性。在检测灵敏度要求低的样本时，可只对阳性结果的检测条作进一步的定量检测，起到普查+精查的作用，省时省力，节约成本；在检测灵敏度要求高的样本时，可对显色阴性的检测条作进一步定量分析，从而降低漏检率。

使用本发明生产的快速诊断试剂盒，能检测全血、血清、血浆、体液等多种样品，可用于疾病诊断，快速筛查及细菌、病毒、毒品等目的蛋白的分离和检出，且能用于一项多检。

本发明的快速诊断试剂盒的组装是将各成分(底版、上端吸水纸、下端吸水纸、喷有特定抗体或抗原的膜、复合纳米颗粒垫、磁棒)组装、裁剪、包装。

[附图说明]

图1是金全部包被的磁-金核壳型复合纳米颗粒示意图。1，金；2，磁颗粒。

图2是金全部包被的磁-金核壳型复合纳米颗粒示意图，核、壳分别为磁颗粒和金，核壳之间为中间层。1，金；2，磁颗粒，3，中间层。

图3是金全部包被的磁-金核壳型复合纳米颗粒示意图，核、壳分别为分散在中间层的磁颗粒和金。1，金；2，磁颗粒，3，中间层。

图4是金部分包被磁-金核壳型复合纳米颗粒示意图。1，金；2，磁颗粒。

图5是本发明的磁-金核壳型复合纳米颗粒富集标记的待测目的蛋白的示意图。A，液相反应B，反应液外加磁场C，分离得到沉淀，再分散到溶液中。1，标记的磁-金复合纳米颗粒；2，待测目的蛋白，3，标记的磁-金复合纳米颗粒与待测目的蛋白结合；4，杂质(非待测目的蛋白)

图6是本发明的检测带为阳性时的示意图。1，反应区；2，检测带；3，对照带；4，显色区

图7是本发明用于一项多检的示意图。

1，反应区，2，显色区3，磁金复合纳米颗粒垫(反应区)；4，A阳性；5，B阳性；6，对照带；7，待测A；8，待测B；9，标记的磁金复合纳米颗粒；10，待测A的另一抗体；11，待测B的另一抗体；12，二抗。

检测实例1：

在献血流动车上，需对献血者的血液进行乙肝病毒HBV、丙肝病毒HCV、爱滋病病毒HIV、梅毒TP的快速检测。只有结果为阴性的血液才能被接受。利用本发明技术建立的试剂盒，可以先通过检测带显色来筛除阳性血样。

1.磁-金核壳型复合纳米颗粒的制备，四氧化三铁纳米颗粒10mg，0.5g葡萄糖，0.1％氯金酸溶液40ml，将上述物质混合后超声10分钟，加热反应4小时，形成直径为20nm-100nm的磁-金核壳型复合纳米颗粒(如图1A)。

2.标记：将HBV、HCV、HIV、TP抗体的抗体标记到上述复合纳米颗粒上。

3.将上述标记物喷到试剂条一端的玻璃纤维素膜上形成复合纳米颗粒垫，建立反应区，使之与待测样品中HBV、HCV、HIV、TP抗体反应。

4.将HBV、HCV、HIV、TP抗体的另一抗体及二抗固定在试剂条另一端的硝酸纤维素膜上的显色区，形成检测带及对照带，以中性蛋白封闭，干燥。

5.光学检测：上述结合了标记物的待测目的蛋白最终被固定在试剂条另一端显色区的相应抗体或抗原所捕获，形成检测带，进行初步定性成半定量检测；

检测实例2：

1.有中间层的磁-金核壳型复合纳米颗粒的制备，四氧化三铁10mg，加入正硅酸乙酯0.5ml及乙醇40ml搅拌2-7小时，形成直径为100nm-800nm的二氧化硅包附的四氧化三铁纳米颗粒，分离后的磁颗粒再加入0.5g葡萄糖，0.1％氯金酸溶液40ml，混合后超声10分钟，加热反应4小时，形成有中间层的磁-金核壳型复合纳米颗粒(如图1B、C)。

3.液相反应及富集：上述标记物在液相中与待测样品中的目的蛋白结合，外加磁场，分离得到沉淀，再分散到溶液中，制成富集特测目的蛋白的待检样品；

4.将HBV、HCV、HIV、TP抗体的另一抗体及二抗固定在硝酸纤维素膜上的显色区，形成检测带及对照带，以中性蛋白封闭，干燥。

5.光学检测：上述结合了标记物的待测目的蛋白最终被固定在试剂条显色区的相应抗体或抗原所捕获，形成检测带，进行初步定性或半定量检测；

Claims

1.一种磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其技术特征在于：将待测目的蛋白的抗体或抗原标记磁-金核壳型复合纳米颗粒，然后以此标记的抗体或抗原去结合待测样品中的目的蛋白；分别将待测目的蛋白相应的另一抗体或抗原及二抗固定在试剂条一端的硝酸纤维素膜上的显色区，形成检测带及对照带；结合了标记的复合纳米颗粒的待测目的蛋白被固定在膜上检测带的相应抗体或抗原所捕获，在肉眼对检测带进行初步定性或半定量检测的基础上，再以磁力测定仪对该检测带进行定量检测。

2.根据权利要求书1所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于磁-金核壳型复合纳米颗粒是以磁纳米颗粒为核心，外壳为金所全部包被的一种核壳型复合纳米颗粒。

3.根据权利要求书1所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于磁-金核壳型复合纳米颗粒是以磁纳米颗粒为核心，外壳为金所部分包被的一种核壳型复合纳米颗粒。

4.根据权利要求书1、2、3所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于，磁-金核壳型复合纳米颗粒可根据要求制备成直径自10nm至1000nm之间任意大小的磁性粒子，将其标记到待测目的蛋白的抗体或抗原上。

5.根据权利要求书1所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于，标记的复合纳米颗粒的固相化是将复合纳米颗粒标记到待测目的蛋白的抗体或抗原上，再喷到试剂条一端的玻璃纤维素膜上形成复合纳米颗粒垫，建立反应区，干燥下待用。

6.根据权利要求书1所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于，标记的复合纳米颗粒也可以与待测样品中的目的蛋白在液相中反应，反应液外加磁场分离得到沉淀，再分散到溶液中，制成富集的待测目的蛋白的待检样品。

7.根据权利要求书1所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于，分别将待测目的蛋白相应的另一抗体或抗原及二抗固定在试剂条另一端的硝酸纤维素膜上的显色区，形成检测带及对照带，以中性蛋白封闭，干燥。

8.根据权利要求书1所述的磁-金核壳型复合纳米颗粒标记技术，其特征在于，所形成的检测带是肉眼可见或不可见的检测带：可见检测带为样品中有目的蛋白并且浓度很高使检测带上集聚的复合纳米颗粒能为肉眼所见，不可见检测带为样品中无目的蛋白或者浓度很低使检测带上集聚的复合纳米颗粒不能被肉眼识别。