CN1239708C - 一种β－琼胶酶基因agaA及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的β-琼胶酶基因agaA是编码假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因，用其生产的重组β-琼胶酶温度和pH稳定性好，活性高，能降解琼脂糖，降解产物主要为聚合度2-6的新琼寡糖，因此可以用于新琼寡糖的制备以及从琼脂糖凝胶中回收DNA。本发明的大肠杆菌重组株pEAG/BL21所表达的重组β-琼胶酶占总蛋白的24%，表达水平高，易于纯化，且连续传代20代后表达量未有降低，所以通过本发明可以大量生产重组β-琼胶酶，成本较低。

Description

一种β-琼胶酶基因agaA及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种海洋假别单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CY24的β-琼胶酶基因agaA。本发明还公开了含有该基因的载体和大肠杆菌重组株及其表达产物的生产方法和应用。
背景技术
琼胶主链由1，3连接的β-D-吡喃半乳糖和1，4连接的3，6-内醚-α-L-吡喃半乳糖反复交替连接而成。近几年来，随着糖生物学和化学研究的飞速发展，人们发现不同聚合度的琼胶寡糖具有重要的药用价值，如抗肿瘤、抗衰老、预防糖尿病等，有望发展为新一代海洋药物。琼胶寡糖的制备主要有酶法和酸水解法，而酶解法优于酸水解法，有利于高纯度单一寡糖制备，对琼胶的结构化学和应用研究具有重要作用。琼胶酶根据作用方式的不同可分为α-琼胶酶和β-琼胶酶两大类，前者裂解α-1，3糖苷键，生成琼寡糖系列；后者裂解β-1，4糖苷键，生成新琼寡糖系列。迄今从海洋微生物中发现的琼胶酶由于活性低，特异性差，严重阻碍了琼胶糖类化合物的构效关系研究乃至进一步应用开发的深入开展。另外，琼胶酶在基因组研究中高分子量DNA制备以及藻类原生质体的制备方面也发挥着重要作用。因此，高活性、高特异性的琼胶酶的寻找就成了当务之急。到目前为止，实现产业化生产的只有从大西洋假单胞菌(Pseudomonas atlantica)中分离的β-琼胶酶(Morrice，1983)，但价格昂贵、活性低，应用范围也仅限于科研工作中，大大阻碍了琼胶寡糖的开发与应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种假别单胞菌CY24的β-琼胶酶基因agaA及其制备方法和应用，它能弥补现有技术的上述不足。
一种β-琼胶酶基因agaA，其特征在于它是编码假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因。
一种β-琼胶酶基因agaA的制备方法，其特征在于以鸟枪法克隆假别单胞菌CY24的β-琼胶酶基因agaA。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于制备大肠杆菌克隆载体pA5。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于制备大肠杆菌重组株pA5/DH5α。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于制备大肠杆菌表达载体pEAG。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于制备大肠杆菌重组株pEAG/BL21。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于制备重组β-琼胶酶。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于降解琼脂糖制备新琼寡糖。
将本发明的β-琼胶酶基因agaA用于从琼脂糖凝胶中回收DNA。
本发明的β-琼胶酶基因agaA是编码假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因，用其生产的重组β-琼胶酶温度和pH稳定性好，活性高，能降解琼脂糖，降解产物主要为聚合度2-6的新琼寡糖，因此可以用于新琼寡糖的制备以及从琼脂糖凝胶中回收DNA。本发明的大肠杆菌重组株pEAG/BL21所表达的重组β-琼胶酶占总蛋白的24％，表达水平高，易于纯化，且连续传代20代后表达量未有降低，所以通过本发明可以大量生产重组β-琼胶酶，成本较低。
附图说明
附图1为β-琼胶酶基因agaA的核苷酸序列。
附图2为根据β-琼胶酶基因agaA的核苷酸序列推测的氨基酸序列。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1β-琼胶酶基因agaA的克隆
采用鸟枪法克隆假别单胞菌CY24的β-琼胶酶基因agaA，具体操作为：在含1％(重量百分浓度)NaCl的Luria-Bertani(LB)培养基中培养假别单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CY24至对数末期，提取基因组DNA。用限制性内切酶HindIII酶切该基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳，回收2.5～7kb的片断，与用HindIII完全酶切并经去磷酸化处理的pBluescript II KS(+)质粒片段连接。然后将连接产物按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，在琼脂为唯一碳源的固体培养基(含有氨苄青霉素、X-gal、IPTG)上培养，利用是否产生水解圈筛选有琼胶酶活性的阳性转化子。培养其中一个阳性转化子，用标准的碱裂解法提取其质粒DNA，测序分析，建立亚克隆并测定酶活性，最终通过生物信息学分析，确定假别单胞菌CY24的β-琼胶酶基因agaA全核苷酸序列(附图1)，序列全长1362bp，编码一个453个氨基酸的蛋白质(附图2)。将该阳性转化子命名为pA5/DH5α，将其含有的质粒命名为pA5。
实施例2大肠杆菌表达载体pEAG的构建
根据已经得到的β-琼胶酶基因agaA全序列设计上游引物(5’GGAATTCCATATGAAAGGATTCACTAAG3’)和下游引物：(5’CCGCTCGAGCTGGAATTTAAAACGTTG3’)，以假别单胞菌CY24的基因组DNA为模板，利用PCR扩增得到β-琼胶酶基因全序列。该PCR的条件为：94℃预变性3min，随后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示1.36kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，用NdeI和XhoI酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收1.36kb的DNA片断。将大肠杆菌表达载体pET-24a(+)同样用NdeI和XhoI酶切，琼脂糖电泳分离，回收5.3kb的.DNA片段，将其与上述所得1.36kb的DNA片段连接后，按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌DH5α中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NdeI和XhoI酶切得到1.36kb和5.3kb两个片段，分别与β-琼胶酶基因agaA全长片段与表达载体pET-24a(+)大小相同，证明β-琼胶酶全长序列已克隆到表达载体pET-24a(+)中，将此重组质粒命名为pEAG。
实施例3  能高效表达β-琼胶酶的大肠杆菌工程菌株pEAG/BL21的构建
将表达载体pEAG按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NdeI和XhoI酶切得到1.36kb和5.3kb两个片段，分别与β-琼胶酶基因agaA全长片段与表达载体pET-24a(+)大小相同，证明获得了能高效表达β-琼胶酶的大肠杆菌重组株pEAG/BL21。
实施例4  利用大肠杆菌重组株pEAG/BL21生产重组β-琼胶酶
挑取大肠杆菌重组株pEAG/BL21单克隆接种在2ml含有30μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃(200r/min振荡培养过夜。按1∶50接种至100ml含有30μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养至OD600为0.6，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3h，4℃ 5000xg离心30min收集菌体，重悬于结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)。将菌悬液于冰上超声破碎细胞15min，每作用10s暂停10s。4℃ 12000xg离心30min去除细胞碎片，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤出液上至用结合缓冲液平衡好的PreBondTM column(Invitrogen)。用结合缓冲液和冲洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)冲洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用5ml pH6、pH4的缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液/0.5M NaCl)洗脱，SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液。用Lowry法测定目的蛋白浓度，分装后冻存于-80℃。
实施例5  利用重组β-琼胶酶生产新琼寡糖
重组β-琼胶酶能降解琼脂和琼脂糖。制备新琼寡糖时，将琼脂糖溶于0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.5)，配成重量百分比浓度为0.1％～0.5％的溶液，按重量比0.1-1∶100加入实施例4中所得的重组β-琼胶酶，混合均匀后在37℃温浴6～24h，70％-90％的产物为聚合度2-6的新琼寡糖。
实施例6  利用重组β-琼胶酶从琼脂糖凝胶中回收DNA
将0.5μg质粒pBluescript II KS(+)在重量百分比浓度为0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离，切下3kb的条带，称重为50mg。将其悬浮于50μl 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)，按重量比0.1-1∶100加入实施例4中所得的重组β-琼胶酶，37℃温浴2小时。12000×g离心10min，上清中加入等体积的体积百分比为25∶24∶1的苯酚/氯仿/异戊醇，混合均匀后12000xg离心10min，上清中加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)、两倍体积的无水乙醇，混合均匀后在-20℃放置30min，12000xg离心10min，沉淀用体积百分比为70％的乙醇洗涤一次，晾干，溶于10μl TE缓冲液中。测试结果表明：DNA回收率为85％，纯度为95％。

Claims (9)

1、一种β-琼胶酶基因agaA，其特征在于它是编码假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因，并且具有如图1所示的核苷酸序列。
2、权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaA的制备方法，其特征在于以鸟枪法克隆假别单胞菌CY24的β-琼胶酶基因agaA。
3、大肠杆菌克隆载体pA5，其含有权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaA。
4、大肠杆菌重组株pA5/DH5α，其含有权利要求3所述的大肠杆菌克隆载体pA5。
5、大肠杆菌表达载体pEAG，其含有权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaA。
6、大肠杆菌重组株pEAG/BL21，其含有权利要求5所述的大肠杆菌表达载体pEAG。
7、重组β-琼胶酶，其由权利要求6所述的大肠杆菌重组株pEAG/BL21发酵产生。
8、权利要求7所述的重组β-琼胶酶在降解琼脂糖制备新琼寡糖中的应用。
9、权利要求7所述的重组β-琼胶酶在从琼脂糖凝胶中回收DNA中的应用。
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