CN1238514C - 一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法 - Google Patents

一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法 Download PDF

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一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法，含下列工序：微生物菌体的培养，菌体重悬液的制备，以及用游离菌体作为生物催化剂进行丙烯腈水合反应生产丙烯酰胺，分离反应所得的丙烯酰胺水合液。其特征是用微滤膜来净化洗涤发酵液中的菌体制备菌体重悬液，用超滤膜来分离丙烯酰胺水合液与生物杂质。采用本发明工艺生产丙烯酰胺可以明显提高生产效率和菌体利用率，同时水合液产品中的生物杂质含量降低，得到的丙烯酰胺质量好、纯度高。

Description

一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法
技术领域
本发明涉及膜技术在微生物转化生产丙烯酰胺中的应用方法，主要包括微滤膜在游离细胞洗涤过程中的应用、超滤膜在游离细胞催化水合反应过程中的应用以及这两部分工艺组成的整个丙烯酰胺微生物转化的生产工艺流程。属于生物化工技术领域。
背景技术
微生物转化法是目前新一代的工业化生产丙烯酰胺的方法，所采用的工艺主要以海藻酸盐固定化的细胞为生物催化剂、采用批式反应方式进行的。其工艺流程分为发酵、造粒、水合、精制、浓缩、结晶、离心、干燥8个部分。在其水合工段中，固定化颗粒与水合液通过筛网分离。目前工艺中存在的主要问题是：细胞固定化的过程比较复杂，也增加了设备投资和生产成本；固定化后细胞的酶活性降低很多，影响了酶活的利用；固定化介质在催化过程中会破裂，产生有机和无机杂质、影响反应液的质量；因此，水合反应液需进行多步精制才能达到质量要求，使精制工艺的负担较重等等。为此，生产工艺需要进一步的改进，生产效率和菌体利用率需要进一步提高。此外，有的生产工艺也开始直接采用菌体发酵液的游离细胞作为生物催化剂，催化水合过程，水合反应后通过高速离心机分离丙烯酰胺水合液和游离细胞。这种工艺过程需用高速离心机，设备投资大，设备维修复杂、能耗高，而且所得丙烯酰胺产品中的生物杂质含量也较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法。本方法可以叙述为：微生物的发酵培养，得到的发酵液经过离心分离和微滤膜洗涤净化得到菌体重悬液，所得的菌体重悬液作为生物催化剂进行催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺的水合反应，所得的反应混和体系经过超滤膜的分离得到高纯度的丙烯酰胺水合液。
微滤膜的应用主要是为了净化发酵液中的菌体。由于发酵原液中含有残留的发酵培养基，大量的生物杂质以及细胞色素等，这些杂质会对游离细胞水合过程以及分离过程产生影响，也会影响水合液的质量。通过微滤膜可以在截留菌体的同时，将体系中的大部分杂质分离除去，并经过无离子水的多次循环洗涤后，发酵原液可以成为较纯净的菌体重悬液，生物杂质(杂蛋白)降低到10ppm以下，而菌体酶活性基本保持不变。
应用超滤膜与生物反应体系的耦合，则可以实现游离细胞催化反应过程。通过一定截留分子量的超滤膜，在截留菌体和分离水合液的同时，也可以截留在水合过程中细胞产生的一些生物杂质，使得到的产品-水合液不仅电导率低，色度低，而且生物杂质含量低。
本发明所涉及的微滤膜组件和超滤膜组件的形式包括中空纤维膜、卷式膜、平板膜和管式膜器。所涉及的膜材料包括聚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯和聚丙烯等有机高分子材料。
通过膜技术的应用，使原有的工艺过程在以下几个方面得到了改进：(1)省略了细胞固定化的步骤，简化了生产设备和工艺；(2)用游离细胞替代固定化细胞进行催化水合，提高了反应效率和菌体利用率；(3)通过膜分离过程降低了产品的色度和生物杂质的含量，提高了产品水合液的质量，使产品质量达到国际先进水平；(4)在降低设备投资的同时，提高了生产能力、生产效率和降低了劳动强度；(5)简化了后续反应液精制过程中的离子交换步骤，降低了离子交换处理的负荷，提高了生产效率；(6)在游离细胞反应和膜分离技术耦合的基础上，可以进一步开发多级连续化工艺过程，以代替现有的批式操作工艺。
附图说明
图1为应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的工业化应用装置流程图。
具体实施方式
实施例一
应用中空纤维微滤膜和中空纤维超滤膜的工业化流程包括：发酵原液中菌体的膜分离净化部分和与膜分离耦合的游离细胞催化水合反应部分。菌体净化部分主要由：菌体液罐、洗涤液罐、预过滤器、中空纤维微滤膜组件和离心泵组成。水合部分主要由游离细胞催化反应釜、预过滤器、中空纤维超滤膜组件、离心泵和洗涤液罐等组成。工业化实验流程如图1所示，流程中主要设备如表1所示。
编号 名称 设备参数
1 发酵罐 3m3
2 菌体洗涤罐 2m3带冷却夹套
3 中空纤维微滤膜组件 4m2×10，截留孔径0.1μm，操作压力小于0.1MPa
4 微滤膜清洗罐 1m3
5 菌体重悬液储罐 带冷却夹套，湿菌体含量约10％
6 丙烯腈计量罐 2m3，带计量管
7 去离子水计量罐 6m3，带计量管
8 游离细胞反应釜 6m3，带搅拌桨，冷却夹套
9 中空纤维超滤膜组件 4m2×40，截留分子量10000-50000，操作压力小于0.1MPa
10 超滤膜清洗罐 2m3
11 过滤水合液出口 Φ50，过滤速度达到5-6m3/h
12 发酵液入口管 Φ50
13 菌体洗涤液出口管 Φ50
14 去离子水入口管 Φ75
15 丙烯腈入口管 Φ25
16 冷却水入口管 Φ50，冷盐水
17 冷却水出口管 Φ50，冷盐水
18 预过滤器 200目筛网
19 离心泵1 1.5kw，流量12.5m3，扬程20m
20 离心泵2 5.5kw，流量50m3，扬程20m
菌体重悬液的制备：
(1)菌体于28℃下，在3m3发酵罐中进行培养，培养基的主要成分为：葡萄糖20g/L；酵母浸粉5g/L；尿素7.5g/L；谷氨酸钠1g/L；K2HPO4 0.5g/L；KH2PO4 0.5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；诱导剂60ppm。调节pH值为7.5，培养56小时后，共得到菌体重悬液1.2吨左右，湿菌体含量为120g/L，酶活力达到2669U/mL。
(2)用泵将菌体重悬液送至菌体洗涤罐，洗涤罐的冷却夹套中通入冷却盐水，使洗涤过程中菌液的温度控制在4-10℃。
(3)启动循环泵，转速2900rpm，流量为12.5m3/h，将菌体重悬液通过中空纤维微滤膜进行过滤和浓缩过程，过滤液排入污水处理系统，过滤液流量为1.5-2.3m3/h。分析过滤液中蛋白浓度和色度的变化，以及菌体截留情况。
(4)当循环体系的浓缩比达到5时，停止循环泵和过滤过程。往菌体洗涤罐中加入无离子水，至2.0吨，重新启动循环泵，继续进行过滤、洗涤过程。过滤液流量为1.7-3.0m3/h。分析过滤液中蛋白浓度和色度变化以及菌体截留情况。当浓缩比达到5后，重新稀释并再过滤、洗涤一次。
(5)经过以上的多次过滤和洗涤，完成了菌液的洗涤过程。考虑到膜清洗时间以及辅助时间，整个微滤膜洗涤菌体的工效约为0.4吨原始发酵液/小时。
(6)完成洗涤后，菌体重悬液中的湿菌体浓度达到120g/L，酶活力达到1100U/mL，和洗涤前相比，酶活没有下降。其他各项洗涤指标，如下表所示。菌体重悬液用泵送至水合工段的菌体重悬液储罐，并用冷盐水控制温度至4℃。
                 表2发酵液过滤、洗涤前后的技术指标
  项目     酶活U/mL   电导率μs/cm   pH     色度   蛋白ppm
  发酵原液     2669   ＞500   9.0     ＞100   600
  洗涤后的菌液     2579   130   8.7     10   5
丙烯酰胺水合液的制备：
(1)初始反应体系的配制。在6m3反应釜中加入250kg菌体重悬液，并加入4750kg去离子水，将初始体系稀释到湿菌体的含量为0.5％。往冷却夹套中通入冷却盐水，将反应体系初始温度控制至15-16℃。
(2)非稳态反应过程。开始流加丙烯腈，调节丙烯腈流量至0.5-1.0m3/h左右，流加速度从高向低逐步调小。每20分钟取样，用气相色谱测定体系中丙烯酰胺和丙烯腈浓度，以保证体系内不出现过高的丙烯腈浓度(丙烯腈浓度小于2-3％)，防止菌体的突发性失活。体系温度维持在20℃左右。大约120min以后，当测定的丙烯酰胺浓度达到25％(W/V％)，丙烯腈浓度小于0.01％(W/V％)时，第一批非稳态反应结束。
(3)启动中空纤维超滤膜分离系统的循环泵，额定转速2900rpm，额定流量为50m3/h。开始水合液的膜分离过程，过滤液流量为5-6m3/h。分析过滤液中蛋白浓度，色度以及电导率等质量指标。大约经过60min的膜分离过程，浓缩比达到10左右时，停止膜分离。
(4)用去离子水反洗、正洗中空纤维超滤膜，将菌体冲回反应釜。加去离子水，将反应釜中菌体稀释至0.5％，并再次控制温度至15-16℃，进入第二批反应和分离过程。
(5)由于菌体酶活性的降低，后一次催化反应的速度比前一次慢，所用的时间比前一次长。大约可进行以上的催化反应过程四个批次，直至反应所需的时间大大增加(大于三小时)，酶活的利用价值已经不大时，可以考虑换用新的催化剂。即第四批反应与分离结束后，用一定的去离子水洗涤剩余菌体浓缩液，洗涤液回收。菌体经洗涤后，作为废渣处理。
在20℃下，共进行了非稳态反应四个批次，反应时间加上分离时间和辅助时间总共为15.9小时。整个反应分离过程中，丙烯腈的转化率为99.9％，菌体利用率为196.85gAM/gcell，生产效率为12.38gAM/gcell.hr。和现有的固定化细胞催化工艺比较，在操作时间和转化率基本相同的基础上，应用中空纤维膜的游离细胞生物反应工艺的菌体利用率和生产效率都比固定化细胞催化反应工艺要高。生产效率提高了137％，菌体利用率提高了76％。
                表3本发明工艺与固定化工艺得到的产品液的质量参数比较
  工艺过程   色度   电导率变化μs/cm     水合液中其他杂质   产品凝胶     蛋白含量ppm
  固定化细胞工艺   20-30   ＞1000     多   半透明     ＞10
  本发明工艺   10-15   500＜     少   透明     ＜5

Claims (1)

1.一种应用膜技术的微生物转化生产丙烯酰胺的方法，含下列工序：微生物菌体的培养，菌体重悬液的制备，以及用游离菌体作为生物催化剂进行丙烯腈水合反应生产丙烯酰胺，分离反应所得的丙烯酰胺水合液，其特征是用微滤膜来净化洗涤发酵液中的菌体制备菌体重悬液，用超滤膜来分离丙烯酰胺水合液与生物杂质，所说的微滤膜为中空纤维微滤膜，所说的超滤膜为中空纤维超滤膜。
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