CN1226309C - 生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法。根据模板印迹(分子印迹)技术的原理，以不同的生物大分子做为模板分子，不同的金属(或其氧化物)做为磁性组分，采用种子反相悬浮聚合法制得对模板生物大分子具有专一识别性能并具有“动态”特性的生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球。该产品由于印迹发生在微球表面，避免了部分模板分子因包埋在微球内部而无法洗脱的问题。因此，种子反相悬浮聚合法制备微球表面印迹凝胶复合微球较普通的反相悬浮聚合法模板分子的用量少，吸附容量大，可用于生物大分子的分离，比以往的分离技术更加精确，并使以往的分离过程大大简化。
Description
技术领域
本发明属于材料科学与工程和生物分离工程领域，更确切的说是涉及一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法。
背景技术
分子识别和识别专一性是整个生物学普遍存在和特有的特点，在生物进化中起着特殊而重要的作用。模板印迹就是基于对生物学的仿生，采用人工方法制备对特定分子(模板分子或印迹分子)具有识别专一性的聚合物的技术。近来，以该技术制备的分子印迹聚合物(MIPs)已在分离提纯、免疫分析、模拟酶以及生物传感器等方面显示出广泛的应用前景，成为新世纪最具潜力的新材料之一。
目前，尽管模板印迹技术已在许多领域，诸如相似化合物的分离、抗体结合模拟、酶模拟、生物模拟传感器等很多方面得到了广泛而深入的研究，但模板分子的选择主要集中在小分子上。由于生物大分子的分子量大并具有生物活性而易变性，因此，其印迹与识别都是十分困难的，研究的广度和深度也远不如小分子。
目前，生物大分子模板印迹方法主要有包埋法、微球表面印迹法、平板表面印迹法和抗原决定簇法等。包埋法(Hjerten SJ，Liao JL，Nakazato K，WangY，Zamaratskaia G，Zhang H-X.Gels mimicking antibodies in theirselective recognition of protein，Chromatography，1997，44：227-234)制备过程简单，但后处理过程烦琐，须经模板分子的洗脱、研磨、筛分等过程才能完成，且造成部分模板分子因包埋在微球内部而无法洗脱的问题；平板表面印迹法(Shi H，Tsai W-B，Ferrari S，Ratner BD.Template imprintednanostructural surfaces for protein，Narure，1999，398：593-597.)无法得到印迹微球，只能得到片材(或膜材)而用于医学上的诊断和监测；抗原决定簇法(Rachkov A，Minoura N.Towards molecularly imprinted polymersselective to peptides and protein.The epitope approach，Biochimica etBiophysica Acta，2001，1544：255-266)因其采用本体聚合法，其实质也是包埋法，且只适用于暴露的片断结构非常清楚的生物大分子的印迹及暴露的片断结构完全不同的生物大分子的分离；微球表面印迹法(Glad M，Narrlow O，Sellergren B，Siegbahn N，Mosbach K.Use of silane monomers for molecularimprinting and enzyme entrapment in polysiloxane-coated porous silica，J Chromatogr，1985，347：11-23)是一种比较有前途的印迹方法，但由于其不含磁性组分无法用磁场进行简单和方便的分离，只适合用做色谱的固定相而进行静态分离。另外，该法得到的印迹聚合物为刚性聚合物，对于非刚性、体积庞大的模板生物大分子从印迹聚合物上洗脱和识别过程中模板生物大分子重新进入“结合孔穴”显然是不利和困难的。
当在聚合物微球内部埋入磁响应性材料，如铁、钴、镍或其氧化物时，复合微球则具有在外加磁场作用下简便、快速的磁分离特性(C Bor Fuh，S Y Chen.Magnetic split-flow thin fractionation：new technique for separation ofmagnetically susceptible particles，Journal of Chromatography A，1998，813：313-324)。当在模板印迹聚合物中埋入磁响应性材料后，便可在其完成对模板分子的“主动”吸附与识别后在外加磁场作用下很容易将其分离出来。
采用反相悬浮聚合可以直接制备凝胶微球。但现有技术制备的凝胶微球由于未经印迹无法进行精确的分离，并由于不含磁性组分无法用磁场进行简单和方便的动态分离，只能进行静态分离(D Wistuba，V Schurig.Enantiomerseparation of chiral pharmaceuticals by capillary electrochromatography，Journal of Chromatography A，2000，875：255-276)；若进行动态分离，则需经离心等过程分离掉模板印迹聚合物微球，操作过程烦琐、复杂。
发明内容
本发明旨在通过种子反相悬浮聚合法将模板印迹技术与磁敏感性相结合，制备出非刚性的生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球(简称表面印迹凝胶复合微球)，并赋予其一定的磁响应性，使制得的表面印迹凝胶复合微球在其完成对模板生物大分子的“主动”吸附与专一性识别后在外加磁场作用下很容易将其分离出来，达到主动识别和方便分离的目的；同时，解决反相悬浮法因部分模板分子包埋在微球内部而无法洗脱的问题，节省昂贵的生物大分子模板的用量。
本发明需要解决金属(或其氧化物)粉末与聚合物的相容性问题，实现聚合物凝胶对无机物的包埋，从而赋予表面印迹凝胶复合微球一定的磁响应性。
本发明需要解决壳层单体在较大粒径上的包覆问题，并同时完成对模板生物大分子的印迹过程，使表面印迹凝胶复合微球对模板生物大分子具有专一识别性能，达到特定分离的目的。
本发明需要解决表面印迹凝胶复合微球的有限溶胀问题，以确保在生物大分子的印迹和识别过程中印迹孔穴的形状和大小相对稳定。
本发明需要保证模板印迹过程中生物大分子的生物活性不改变。
本发明需要选择适合于反相悬浮聚合的分散剂，以确保表面印迹凝胶复合微球的种球和其自身的形成与稳定。
本发明根据模板印迹技术的原理，以不同的生物大分子做为模板分子，不同的金属(或其氧化物)做为磁性组分，不同的高分子稳定剂为分散剂，采用种子反相悬浮聚合法制得对模板生物大分子具有专一识别性能并具有“动态”特性的生物大分子微球表面印迹凝胶磁性复合微球。
本发明所制得的生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球，其特征是在生物大分子模板印迹凝胶微球中复合有磁性响应材料，生物大分子模板印迹在凝胶磁性复合微球的表面上。
本发明实施方法描述如下：
1)种子凝胶复合微球的制备
将非极性有机溶剂加入带有搅拌器、通气管的反应器中，加入分散剂，搅拌使之溶解；将丙烯酰胺(AM)、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)加入甲基丙烯酸钠水溶液中，溶解后加入经研磨的磁性粉末，搅拌分散均匀后加入反应器中，继续搅拌；将氧化剂和还原剂溶于水中后滴加到反应器中；通氮气除氧，常温反应0.5～4h；反应结束后，滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用0.1～2mol/L的盐酸溶液浸泡，浸泡2～24h后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱40～90℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球；
2)表面印迹凝胶复合微球的制备
将模板生物大分子、氧化剂和还原剂加入水中，溶解后加入干态的种球，待种球溶胀后加入到溶有分散剂的非极性有机溶剂中，搅拌条件下滴加AM、Bis的混合溶液；通氮气除氧，常温反应0.5～4h；反应结束后，滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球；
3)生物大分子的洗脱
将所制备的表面印迹凝胶复合微球用丙酮冲洗后，用蒸馏水反复冲洗；然后用0.1～2m/L的NaOH溶液浸泡并振荡，2～24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗；再用0.1～2m/L的盐酸溶液浸泡，浸泡2～24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后于40～90℃用真空烘箱干燥至恒重。
其中：
非极性有机溶剂为：苯、甲苯、煤油、汽油、环己烷、溶剂油；
分散剂为：甲基纤维素、乙基纤维素、丙基纤维素；
磁性材料为：Fe、Co、Ni或其氧化物、合金；
氧化剂为：过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵；
还原剂为：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠；
模板生物大分子为：蛋白质、多肽、核酸、细胞；
分散剂为：甲基纤维素、乙基纤维素。
本发明的创新点在于：
1.将磁敏感性(磁响应性)与模板印迹技术相结合制备出生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，可实现对生物大分子准确、快速的分离目的。
2.丙烯酰胺与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚物与金属(或其氧化物)粉末具有良好的相容性，具有包覆容易、制备方便等特点。
3.丙烯酰胺与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的共聚条件温和，能够保持生物大分子的生物活性而不变性。
4.本发明采用的的种子反相悬浮聚合法由于印迹发生在微球表面，避免了部分模板分子因包埋在微球内部而无法洗脱的问题，使得该法制备表面印迹凝胶复合微球较普通的反相悬浮聚合法模板分子的用量少，吸附容量大。
5.所制备的表面印迹凝胶复合微球，因其“结合孔穴”可根据环境的改变而变化，即具有刺激响应性，使得模板生物大分子洗脱较为容易。
6.所制备的表面印迹凝胶复合微球因其对生物大分子的识别主要靠模板生物大分子与“结合孔穴”在大小和形状上的相互吻合，故该印迹凝胶复合微球可分离分子量相同但形状(空间结构)不同的生物大分子，也可分离形状相同(或相近)但分子量不同的生物大分子。
本发明的表面印迹凝胶复合微球结合了模板印迹聚合物精确的专一性识别特性和磁性复合微球方便的外磁场分离特性双重功能，将在生物分离领域，特别是生物大分子，如蛋白质、多肽、细胞的分离等方面具有广阔的应用前景，并使以往烦琐的分离过程(如高速离心等)大大简化。现有用于生物分离工程领域的模板印迹聚合物微球由于不含磁性组分无法用磁场进行简单和方便的分离，且皆为刚性聚合物，对于非刚性、体积庞大的模板生物大分子从印迹聚合物上的洗脱和识别过程中模板生物大分子重新进入“结合孔穴”都是不利和困难的；而现有的磁性复合微球由于未经生物分子印迹不具有生物识别专一性，不能实现精确的分离。
本发明所选择的丙烯酰胺与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚物与金属(或其氧化物)粉末具有良好的相容性，具有包覆容易、制备方便等特点，且制备条件温和，能够保持生物大分子的生物活性而不变性。
本发明采用的的种子反相悬浮聚合法由于印迹发生在微球表面，避免了部分模板分子因包埋在微球内部而无法洗脱的问题，使得该法制备表面印迹凝胶复合微球较普通的反相悬浮聚合法模板分子的用量减少，吸附容量却增大。
本发明所制备的表面印迹凝胶复合微球可分离分子量相同但形状(空间结构)不同的生物大分子，也可分离形状相同(或相近)但分子量不同的生物大分子，适用范围较广。
本发明所制备的表面印迹凝胶复合微球，因其“结合孔穴”可根据环境的改变而变化，即具有刺激响应性，使得模板生物大分子洗脱较为容易。
附图说明
图1：实施例1所制得的生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球单个粒子的ESEM照片(湿态，平均粒径约360μm
图2：实施例1所制得的生物大分子表面印迹凝胶磁性复合微球的SEM照片(干态，平均粒径约300μm，Fe3O4含量2.06％)
具体实施方式
实施例1.牛血清白蛋白(BSA)模板表面印迹凝胶复合微球的制备
(1)种球的制备
将100ml甲苯加入带有搅拌器、通气管的250ml的三口烧瓶中，加入0.2g乙基纤维素，搅拌使之溶解。将1g甲基丙烯酸加入到11.6ml 1mol/L的NaOH溶液中，搅拌5min后加入8gAM、1g Bis和20ml水，溶解后加入0.2g经研磨的磁性Fe3O4粉末，搅拌分散均匀后加入三口烧瓶中，继续搅拌；将0.1g过硫酸钾和0.05g亚硫酸氢钠溶于10ml水中后滴加到三口烧瓶中。通氮气除氧，常温反应2h。反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用1mol/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡数小时后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱80℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球。
(2)BSA模板表面印迹凝胶复合微球的制备
将0.0330g BSA、0.05g过硫酸钾和0.03g亚硫酸氢钠加入20ml水中，溶解后加入5g干态的种球，待种球充分溶胀后加入到溶有0.2g乙基纤维素的100ml甲苯中，搅拌条件下滴加0.9gAM、0.1gBis的混合溶液10ml。通氮气除氧，常温反应2h。反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球。
(3)BSA的洗脱
将所制备的表面印迹凝胶复合微球用丙酮冲洗后，用蒸馏水反复冲洗。然后用0.1m/L的NaOH溶液50ml浸泡并振荡，24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗；再用0.1m/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡6h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
所制得的生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，是在牛血清白蛋白模板印迹凝胶复合微球中复合有Fe3O4磁性材料，Fe3O4含量为2.06％，其表面含有能识别生物大分子的印迹孔穴，分别以溶菌酶和卵白蛋白为对比分子，其对牛血清白蛋白的分离因子3.72和3.45。
实施例2.溶菌酶表面印迹凝胶复合微球的制备
(1)种球的制备
将100ml甲苯加入带有搅拌器、通气管的250ml的三口烧瓶中，加入0.25g乙基纤维素，搅拌使之溶解。将2g甲基丙烯酸加入到23.2ml 1mol/L的NaOH溶液中，搅拌5min后加入7gAM、1g Bis和10ml水，溶解后加入0.3g经研磨的磁性Fe3O4粉末，搅拌分散均匀后加入三口烧瓶中，继续搅拌；将0.1g过硫酸钾和0.05g亚硫酸氢钠溶于10ml水中后滴加到三口烧瓶中。通氮气除氧，常温反应2h。反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用1mol/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡数小时后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱80℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球。
(2)溶菌酶模板表面印迹凝胶复合微球的制备
将0.0144g溶菌酶、0.05g过硫酸钾和0.03g亚硫酸氢钠加入20ml水中，溶解后加入5g干态的种球，待种球充分溶胀后加入到溶有0.2g乙基纤维素的100ml甲苯中，搅拌条件下滴加0.9gAM、0.1gBis的混合溶液10ml。通氮气除氧，常温反应2h。反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球。
(3)溶菌酶的洗脱
将所制备的表面印迹凝胶复合微球用丙酮冲洗后，用蒸馏水反复冲洗。然后用0.1m/L的NaOH溶液50ml浸泡并振荡，24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗；再用0.1m/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡6h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
所制得的生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，是在溶菌酶模板印迹凝胶复合微球中复合有Fe3O4磁性材料，Fe3O4含量为2.45％，其表面含有能识别生物大分子的印迹孔穴，分别以BSA和卵白蛋白为对比分子，其对溶菌酶的分离因子5.07和4.15。
实施例3.卵白蛋白模板表面印迹凝胶复合微球的制备
(1)种球的制备
将120ml苯加入带有搅拌器、通气管的250ml的三口烧瓶中，加入0.25g甲基纤维素，搅拌使之溶解。将1g甲基丙烯酸加入到11.6ml 1mol/L的NaOH溶液中，搅拌5min后加入8gAM、1g Bis和20ml水，溶解后加入0.4g经研磨的磁性Fe2O3粉末，搅拌分散均匀后加入三口烧瓶中，继续搅拌；将0.1g过硫酸氨和0.05g亚硫酸钠溶于10ml水中后滴加到三口烧瓶中。通氮气除氧，常温反应2h。反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用1mol/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡数小时后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱80℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球。
(2)卵白蛋白模板表面印迹凝胶复合微球的制备
将0.0215g卵白蛋白、0.05g过硫酸氨和0.03g亚硫酸钠加入20ml水中，溶解后加入5g干态的种球，待种球充分溶胀后加入到溶有0.2g乙基纤维素的100ml甲苯中，搅拌条件下滴加0.9gAM、0.1gBis的混合溶液10ml。通氮气除氧，常温反应2h。反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球。
(3)卵白蛋白的洗脱
将所制备的表面印迹凝胶复合微球用丙酮冲洗后，用蒸馏水反复冲洗。然后用0.1m/L的NaOH溶液50ml浸泡并振荡，24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗；再用0.1m/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡6h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
所制得的生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，是在卵白蛋白模板印迹凝胶复合微球中复合有Fe2O3磁性材料，Fe2O3含量为1.95％，其表面含有能识别生物大分子的印迹孔穴，分别以BSA和溶菌酶为对比分子，其对卵白蛋白的分离因子4.07和3.26。
Claims (9)
1.一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球，其特征是在生物大分子模板印迹凝胶微球中复合有磁性响应材料，生物大分子模板印迹在凝胶磁性复合微球的表面上。
2.如权利要求1所述的一种生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，其特征是在牛血清白蛋白模板印迹凝胶复合微球中复合有Fe3O4磁性材料，Fe3O4含量为2.06％，其表面含有能识别生物大分子的印迹孔穴，分别以溶菌酶和卵白蛋白为对比分子，其对牛血清白蛋白的分离因子3.72和3.45。
3.如权利要求1所述的一种生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，其特征是在溶菌酶模板印迹凝胶复合微球中复合有Fe3O4磁性材料，Fe3O4含量为2.45％，其表面含有能识别生物大分子的印迹孔穴，分别以BSA和卵白蛋白为对比分子，其对溶菌酶的分离因子5.07和4.15。
4.如权利要求1所述的一种生物大分子模板印迹凝胶磁性复合微球，其特征是在卵白蛋白模板印迹凝胶复合微球中复合有Fe2O3磁性材料，Fe2O3含量为1.95％，其表面含有能识别生物大分子的印迹孔穴，分别以BSA和溶菌酶为对比分子，其对卵白蛋白的分离因子4.07和3.26。
5.权利要求1的一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法，包括以下步骤：
1)种子凝胶复合微球的制备
将非极性有机溶剂加入带有搅拌器、通气管的反应器中，加入分散剂，搅拌使之溶解；将丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺加入甲基丙烯酸钠水溶液中，溶解后加入经研磨的磁性粉末，搅拌分散均匀后加入反应器中，继续搅拌；将氧化剂和还原剂溶于水中后滴加到反应器中；通氮气除氧，常温反应0.5～4h；反应结束后，滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用0.1～2mol/L的盐酸溶液浸泡，浸泡2～24h后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱40～90℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球；
2)表面印迹凝胶复合微球的制备
将模板生物大分子、氧化剂和还原剂加入水中，溶解后加入干态的种球，待种球溶胀后加入到溶有分散剂的非极性有机溶剂中，搅拌条件下滴加丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的混合溶液；通氮气除氧，常温反应0.5～4h；反应结束后，滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球；
3)生物大分子的洗脱
将所制备的表面印迹凝胶复合微球用丙酮冲洗后，用蒸馏水反复冲洗；然后用0.1～2m/L的NaOH溶液浸泡并振荡，2～24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗；再用0.1～2m/L的盐酸溶液浸泡，浸泡2～24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后于40～90℃用真空烘箱干燥至恒重。
6.如权利要求5所述的一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法，
其特征为所述的：
非极性有机溶剂为：苯、甲苯、煤油、汽油、环己烷、溶剂油；
分散剂为：甲基纤维素、乙基纤维素、丙基纤维素；
磁性材料为：Fe、Co、Ni或其氧化物、合金；
氧化剂为：过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵；
还原剂为：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠；
模板生物大分子为：蛋白质、多肽、核酸、细胞；
分散剂为：甲基纤维素、乙基纤维素。
7.如权利要求5所述的一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法，包括以下步骤：
1)种球的制备
将100ml甲苯加入带有搅拌器、通气管的250ml的三口烧瓶中，加入0.2g乙基纤维素，搅拌使之溶解；将1g甲基丙烯酸加入到11.6ml 1mol/L的NaOH溶液中，搅拌5min后加入8g丙烯酰胺、1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和20ml水，溶解后加入0.2g经研磨的磁性Fe3O4粉末，搅拌分散均匀后加入三口烧瓶中，继续搅拌；将0.1g过硫酸钾和0.05g亚硫酸氢钠溶于10ml水中后滴加到三口烧瓶中；通氮气除氧，常温反应2h；反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用1mol/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡数小时后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱80℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球；
2)模板表面印迹凝胶复合微球的制备
将0.0330g BSA、0.05g过硫酸钾和0.03g亚硫酸氢钠加入20ml水中，溶解后加入5g干态的种球，待种球充分溶胀后加入到溶有0.2g乙基纤维素的100ml甲苯中，搅拌条件下滴加0.9g丙烯酰胺、0.1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的混合溶液10ml；通氮气除氧，常温反应2h；反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球；
3)生物大分子的洗脱
将所制备的表面印迹凝胶复合微球用丙酮冲洗后，用蒸馏水反复冲洗；然后用0.1m/L的NaOH溶液50ml浸泡并振荡，24h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗；再用0.1m/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡6h后滤去溶液，用蒸馏水反复冲洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
8.如权利要求7所述的一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法，其特征是所述的步骤1)、2)为：
1)种球的制备
将100ml甲苯加入带有搅拌器、通气管的250ml的三口烧瓶中，加入0.25g乙基纤维素，搅拌使之溶解；将2g甲基丙烯酸加入到23.2ml 1mol/L的NaOH溶液中，搅拌5min后加入7g丙烯酰胺、1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和10ml水，溶解后加入0.3g经研磨的磁性Fe3O4粉末，搅拌分散均匀后加入三口烧瓶中，继续搅拌；将0.1g过硫酸钾和0.05g亚硫酸氢钠溶于10ml水中后滴加到三口烧瓶中；通氮气除氧，常温反应2h；反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用1mol/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡数小时后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱80℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球；
2)溶菌酶模板表面印迹凝胶复合微球的制备
将0.0144g溶菌酶、0.05g过硫酸钾和0.03g亚硫酸氢钠加入20ml水中，溶解后加入5g干态的种球，待种球充分溶胀后加入到溶有0.2g乙基纤维素的100ml甲苯中，搅拌条件下滴加0.9g丙烯酰胺、0.1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的混合溶液10ml；通氮气除氧，常温反应2h；反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球。
9.如权利要求7所述的一种生物大分子模板表面印迹凝胶磁性复合微球及其种子反相悬浮聚合制备方法，其特征是所述的步骤1)、2)为：
1)种球的制备
将120ml苯加入带有搅拌器、通气管的250ml的三口烧瓶中，加入0.25g甲基纤维素，搅拌使之溶解；将1g甲基丙烯酸加入到11.6ml 1mol/L的NaOH溶液中，搅拌5min后加入8g丙烯酰胺、1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和20ml水，溶解后加入0.4g经研磨的磁性Fe2O3粉末，搅拌分散均匀后加入三口烧瓶中，继续搅拌；将0.1g过硫酸氨和0.05g亚硫酸钠溶于10ml水中后滴加到三口烧瓶中；通氮气除氧，常温反应2h；反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，然后将凝胶微球用丙酮冲洗后，用水反复洗涤后，用1mol/L的盐酸溶液50ml浸泡，浸泡数小时后滤去盐酸溶液，用水反复洗涤至中性，然后于真空烘箱80℃干燥至恒重，得到用于制备表面印迹凝胶复合微球的种球；
2)卵白蛋白模板表面印迹凝胶复合微球的制备
将0.0215g卵白蛋白、0.05g过硫酸氨和0.03g亚硫酸钠加入20ml水中，溶解后加入5g干态的种球，待种球充分溶胀后加入到溶有0.2g乙基纤维素的100ml甲苯中，搅拌条件下滴加0.9g丙烯酰胺、0.1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的混合溶液10ml；通氮气除氧，常温反应2h；反应结束后，用180目筛网滤除有机溶剂部分，得到表面印迹凝胶复合微球。
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