CN102145279B

CN102145279B - 磁响应性极高吸附容量溶菌酶分子印迹纳米粒子制备方法

Info

Publication number: CN102145279B
Application number: CN2010101112326A
Authority: CN
Inventors: 梅素容; 荆涛; 周宜开; 戴晴; 郝巧玲
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2030-02-05
Also published as: CN102145279A

Abstract

本发明提供了一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，它是以溶菌酶为模板分子，在适合的功能单体、交联剂、引发剂和其表面包被了SiO₂并进行了巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子存在的条件下进行模板聚合反应，在洗去模板分子后即得到具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子，本发明还提供了该纳米粒子的制备方法。本发明制备的溶菌酶分子印迹纳米粒子具有吸附容量高、制备简单、成本低廉、特异性吸附强、物理和化学稳定性高、可反复回收利用等特点。

Description

磁响应性极高吸附容量溶菌酶分子印迹纳米粒子制备方法

技术领域

本发明属于生物技术和新材料领域，涉及溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备，具体涉及具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，此纳米粒子既具有对溶菌酶的特异性吸附，又具有超顺磁性，可实现外界磁性作用下的快速分离，避免了传统的复杂前处理程序。

背景技术

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。目前，溶菌酶已成为当前各领域关注的热点。在医学领域，胃组织中溶菌酶的表达与胃癌的预后有十分密切的关系，血清中的溶菌酶与黑色素肿瘤免疫、白血病分型有关；在生物医药领域，溶菌酶可用于抗菌消炎、增强免疫剂；在食品安全领域，溶菌酶是一种抗菌保鲜的食品添加剂；因此，开展溶菌酶的提纯和检测具有十分重要的现实意义。

分子印迹技术，就是以目标分子为模板分子，将结构上具有互补的功能化聚合物单体通过共价或非共价键与模板分子结合，并加入交联剂进行聚合反应，反应完成后通过物理或化学方法将模板分子洗脱出来，形成的一种具有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的交联高聚物。此类聚合物既保持了高聚物操作较简单，产率高，物理和化学稳定性强，保存方便的优良特性，又具有生物抗体特有的亲和力和选择性，已成为当前目标物提纯和净化的首先方法。此外，磁性材料的引入可以赋予仿生人工抗体以磁性，实现在保持其特异性识别和专一性吸附特性的同时实现快速的磁分离，为分子印迹纳米粒子的应用提供一个广阔的发展空间。

目前，小分子的印记技术已趋于完善，而大生物大分子诸如蛋白、基因、细胞等的分子印记技术处于起步阶段，依然面临极大的挑战。最大的难题是由于生物蛋白分子庞大，构建的吸附位点较少，蛋白印迹的选择性不高。本发明拟利用纳米粒子比表面积大的特性，将分子印迹薄膜紧密生长其上，并利用多种作用力构建出对溶菌酶特异性吸附的三维孔穴结构，提高分子印迹聚合物的吸附容量，为大分子印记技术的发展提供一种思路，不仅具有较高的学术价值，也具有很好的经济和社会价值。

发明内容

本发明的任务是提供一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，使其具有制备简单、成本低廉，制备出的溶菌酶分子印迹纳米粒子集特异性吸附强、物理和化学稳定性高、可实现快速磁分离和反复回收利用等特点。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理，防止磁性纳米粒子相互聚集；

步骤二：在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO₂薄膜；以提供活性基团(-OH)和防止Fe₃O₄磁性纳米粒子的氧化；

步骤三：对表面包被有二氧化硅SiO₂薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰氧基修饰；磁性纳米粒子需要在其表面进行功能化修饰，以保证分子印迹膜的紧密生长；

步骤四：在包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子表面生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜。

上述步骤(一)所述的所述的采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理的方法是：将磁性纳米粒子分散到0.7～1mol/L的表面活性剂溶液中，所述的表面活性剂为柠檬酸钠或油酸，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1g/mL，40～60℃条件下，反应12～24小时后，采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度达到1g/mL。本发明实施例使用的磁性纳米粒子是Fe₃O₄磁性纳米粒子，购于南京工业大学纳米应用研究中心，磁性粒子的粒径为10-20nm，且具有超顺磁性。

上述步骤(二)所述的在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO₂薄膜的方法是：按乙醇与水的体积比为5∶1～3∶2的比例配制乙醇和水的混合溶液，将磁性纳米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5∶5～10∶0.6～3的质量比加入到所配制的乙醇和水的混合溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1g/mL，40～60℃条件下，反应12～24小时后，真空干燥，得到褐色粉末；

上述步骤(三)所述的对表面包被有二氧化硅SiO₂薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰氧基修饰的方法是；将等体积的γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到纯水中，使得每毫升纯水中含有5μL～10μL的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常温搅拌5～10小时后，在将此溶液滴加到相同体积的含有20～40mg/mL SiO₂薄膜包被的磁性粒子的纯水中，60～100℃条件下，反应12～24小时后，真空干燥，得到褐色粉末。

上述步骤(四)所述的在包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子表面生成溶菌酶分子印迹聚合物薄膜的方法是：以溶菌酶为模板分子，在适合的功能单体、交联剂、引发剂和表面包被了SiO₂并进行了巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子存在的条件下进行模板聚合反应，在洗去模板分子后即得到具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子；所述的适合的功能单体是能够与磁性纳米粒子表面修饰的丙烯酰氧基结合而固定在磁性纳米粒子表面的碱性功能单体丙烯酰胺或/和酸性功能单体甲基丙烯酸；所述的交联剂是甲叉丙烯酰胺；所述的引发剂是过硫酸铵；其具体操作方法是：

(1)将溶菌酶和碱性功能单体丙烯酰胺按摩尔比1000∶1～3000∶1的量加入到0.2～0.5mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 5.0～7.0)中，使得溶菌酶的最终浓度为2mg/mL～6mg/mL，超声5-10min；

(2)在上述溶菌酶溶液中依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子，加入的量为：交联剂甲叉丙烯酰胺与引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子的质量比依次为20～60∶1～4∶6～10∶80，并使得交联剂甲叉丙烯酰胺与碱性功能单体丙烯酰胺的质量比为1∶6～1∶10，制备成悬浮液，通氮气20～30min以除去氧气；

(3)向制备成的悬浮液中加入四甲基乙二胺，使四甲基乙二胺在悬浮液中的浓度为0.5～2μL/mL，密封后，在常温条件下机械搅拌12～24小时后，依次采用0.5～1mol/L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

本发明方法操作简单，成本低廉，本发明方法制备的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子用于溶菌酶的提纯和检测，具有特异性吸附强、物理和化学稳定性高、可反复回收利用等特点，大大提高对溶菌酶的吸附容量，并可实现快速的磁分离，避免了传统方法前处理操作繁琐、步骤复杂的不足，可节约成本，降低蛋白的污染，为生物大分子的净化和检测提供一种新方法。

实验资料

(1)磁性纳米粒子的分散及效果检测

具体的制备步骤：将Fe₃O₄磁性纳米粒子分散到0.7～1mol/L的表面活性剂溶液中(柠檬酸钠或油酸)，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1g/mL，40～60℃条件下，反应12～24小时后，采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度达到1g/mL。

由图1(A)显示磁性纳米粒子在常规条件下相互聚集。如果能对磁性纳米粒子进行分散，就可以获得粒径较小、比表面积更大的磁性纳米粒子，最终提高印迹粒子的吸附容量。图1(B)显示分散后的磁性纳米粒子粒径较小、分布均一。

(2)磁性粒子表面SiO₂薄膜的包被及验证

具体的制备步骤：将Fe₃O₄磁性纳米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5∶5～10∶0.6～3的质量比加入到含有乙醇/水(5/1～3/2，V/V)的混合溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1g/mL，40～60℃条件下，反应12～24小时后，真空干燥，得到褐色粉末；

红外谱图显示(图2)：在1105.1和952.8波长处可见Si-O-Si的偏振峰，同时在468.7波长处可见Fe-O偏振峰，证明SiO₂薄膜已经包被在磁性颗粒表面。

由于Fe₃O₄磁性纳米粒子极不稳定，容易被氧化而丧失超顺磁性。因此，SiO₂薄膜的包被，一方面可以保护Fe₃O₄，另一方面可以提供活性基团-OH，为以后磁性粒子表面基团修饰提供了可能。

(3)磁性粒子表面巯基和丙烯酰氧基的同时修饰及检验

具体的制备步骤：首先将等体积的γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到纯水中，使得每毫升水中含有5μL～10μL的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常温搅拌5～10小时后，在将此溶液滴加到相同体积的含有20～40mg/mL SiO₂薄膜包被的磁性粒子的纯水中，60～100℃条件下，反应12～24小时后，真空干燥，得到褐色粉末；

红外谱图显示(图2)：在1105.1和952.8波长处Si-O-Si的偏振峰的增宽，1720.4波长处C＝O偏振峰的出现，证明丙烯酰氧基已经修饰在磁性纳米粒子表面。

同时，通过巯基特征性显色反应(Ellman反应，反应方程式如下)和图3(A)证明巯基已经结合在磁性纳米粒子表面；

412nm处强吸收峰

磁性粒子表面巯基的修饰，目的是将溶菌酶固定在磁性纳米粒子表面，为溶菌酶特异性三维孔穴的形成提供模板；磁性粒子表面丙烯酰氧基的修饰，目的是将功能单体固定在磁性纳米粒子表面，使得分子印迹薄膜紧密生长在磁性纳米粒子表面，保证三维孔穴结构与溶菌酶完全匹配；此外，模板的固定和功能单体的同时修饰在理论上讲还可实现三维孔穴的规则排列。因为分子印迹纳米粒子对溶菌酶的吸附完全依靠于三维孔穴结构的形成，所以巯基和丙烯酰氧基的同时修饰必将提高分子印迹纳米粒子对溶菌酶的吸附容量。

(4)磁性微球表面分子印迹聚合物薄膜的生成及吸附容量检测

具体的制备步骤：将溶菌酶和碱性功能单体丙烯酰胺按摩尔比1000∶1～3000∶1的量加入到0.2～0.5mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 5.0～7.0)中，使得溶菌酶的最终浓度为2mg/mL～6mg/mL，超声5-10min；然后依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子，加入的量为交联剂甲叉丙烯酰胺∶引发剂过硫酸铵∶酸性功能单体甲基丙烯酸∶包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子的质量比20～60∶1～4∶6～10∶80，并使得交联剂甲叉丙烯酰胺与碱性功能单体丙烯酰胺的质量比为1∶6～1∶10，制备成悬浮液，通氮气20～30min以除去氧气；最后加入四甲基乙二胺，使其在悬浮液中的浓度为0.5～2μL/mL，密封后，在常温条件下机械搅拌12～24小时后，依次采用0.5～1mol/L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链，富含碱性氨基酸，等电点为10.8，分子量为14000。因此，本发明使用了酸碱两种功能单体和交联剂共同构建了对溶菌酶特异性吸附的三维孔穴结构，不仅与溶菌酶的三维空间结构相吻合，而且充分利用功能单体和溶菌酶之间的多种作用力。相比利用单一硅烷化试剂仅建立与溶菌酶空间结构吻合的孔穴，本发明的合成方法可以增强分子印迹粒子对溶菌酶的吸附容量。

将本发明方法制备的20mg溶菌酶分子印迹纳米粒子和不同浓度的溶菌酶共同孵育在5mL 0.3mol/L磷酸缓冲盐溶液中(pH＝6.0)，常温条件下振荡24小时；此外，将非印迹纳米粒子(制备方法和分子印迹纳米粒子相同，只是不加入模板分子溶菌酶)与溶菌酶按上述方法一起孵育作为空白对照。通过紫外光谱检测被纳米粒子吸附的溶菌酶含量。结果显示(图4)：每克分子印迹纳米粒子对溶菌酶的最大吸附容量达到750mg，是空白对照的7.4倍。由此可见，本发明方法成功制备了极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子，即本发明方法制备的溶菌酶分子印迹纳米粒子具有极高吸附容量。此外，磁滞曲线显示(图5)：本发明方法制备的溶菌酶分子印迹粒子的饱和磁强度达到22.1emu g^-1，表明该分子印迹粒子保持了磁性纳米粒子的超顺磁性，可以实现在外加磁场中分子印迹粒子的快速聚集。在实际应用中，可以大大缩短分析时间，节约分析成本。

总之，为应对生物大分子印迹的难题，提高印迹粒子的吸附容量。本发明从最先的磁性粒子的分散已获得较大的比表面，其次的巯基和丙烯酰氧基的同时修饰，保证三维孔穴结构与溶菌酶完全匹配，最后使用了酸碱两种功能单体和交联剂同时形成印迹薄膜，不仅可以与溶菌酶的三维空间结构相吻合，而且充分利用功能单体和溶菌酶之间的多种作用力，最终增强分子印迹粒子对溶菌酶的吸附容量。结果表明：吸附容量达到750mg/(g聚合物)，是空白对照的7.4倍。相关文献报道：刘秋叶、陈朗星等制备的复合分子印迹聚合物对溶菌酶的最大吸附量为30.75mg/g(刘秋叶、陈朗星等，高等学校化学学报，2008，29(3)：505-509)；Bereli等制备的超大孔分子印迹聚合物对溶菌酶的最大吸附量为22.9mg/g(Bereli N.，et al，Journal of chromatography A，2008，1190：18-26)；Basar等制备了磁响应性干溶胶用于溶菌酶的纯化，结果表明：干溶胶对溶菌酶的最大吸附量为342mg/g(Basar N.，et al，International journal of Macromolecules，2007，41：234-242)。由此可以证明，本发明制备的磁性分子印迹纳米粒子对溶菌酶表现出极高的吸附容量。

附图说明

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步说明。

图1是磁性纳米粒子的显微镜下照片(放大1000倍)；(A为未分散的Fe₃O₄；B为分散后的Fe₃O₄)

图2是磁性纳米粒子进行SiO₂包被和丙烯酰氧基修饰后的红外谱图；(A为SiO₂包被后磁性粒子的红外谱图；B为丙烯酰氧基修饰后磁性粒子的红外谱图)

图3是磁性纳米粒子表面修饰巯基后的显色反应(A)和制备的磁性分子印迹纳米粒子的照片；(B为粒子在磁场作用下的快速吸附；C为粒子的悬浮液)

图4是制备的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的等温吸附曲线；

图5是制备的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的磁滞曲线；

图6是本发明制备方法的流程图。

具体实施方式

下面结合实施方式对具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法做出详细说明。

实施例1

将1g磁性材料纳米Fe₃O₄和100mL 0.7mol/L的柠檬酸钠充分混匀，40℃条件下，反应12小时，然后用纯水多次洗涤，进而分散到乙醇溶液中。其次，将0.5g分散的磁流体、0.5g的氨水和0.6g四乙氧基硅烷加入到50mL乙醇和水的混合溶液中(5/1，V/V)，40℃条件下，反应12小时，在其表面包被SiO₂薄膜。随后，将0.05mL γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和0.05mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷分散到10mL纯水中，反应5小时后，缓慢滴入含有200mg包被了SiO₂薄膜的Fe₃O₄的10mL纯水中，60℃条件下，反应12小时，然后用纯水多次洗涤，真空干燥，形成褐色粉末。最后，将20mg模板分子溶菌酶和丙烯酰胺按摩尔比1000∶1的量溶解在10mL 0.2mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 5.0)中，超声10min，然后依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺100mg、引发剂过硫酸铵5mg、酸性功能单体甲基丙烯酸30mg、上述磁性纳米粒子400mg，制备成悬浮液，通氮气20min以除去氧气。最后加入5μL四甲基乙二胺，密封后，在常温条件下机械搅拌12小时后，依次采用0.5mol/L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

实施例2

将15g磁性材料纳米Fe₃O₄和300mL 0.8mol/L的柠檬酸钠充分混匀，40℃条件下，反应12小时，然后用纯水多次洗涤，进而分散到乙醇溶液中。其次，将5g分散的磁流体、5g的氨水和6g四乙氧基硅烷加入到100mL乙醇和水的混合溶液中(2/1，V/V)，40℃条件下，反应12小时，在其表面包被SiO₂薄膜。随后，将0.14mL γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和0.14mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷分散到20mL纯水中，反应5小时后，缓慢滴入含有600mg包被了SiO₂薄膜的Fe₃O₄的20mL纯水中，60℃条件下，反应12小时，然后用纯水多次洗涤，真空干燥，形成褐色粉末。最后，将40mg模板分子溶菌酶和丙烯酰胺按摩尔比2000∶1的量溶解在10mL 0.4mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 6.0)中，超声7min，然后依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺150mg、引发剂过硫酸铵15mg、酸性功能单体甲基丙烯酸40mg、上述磁性纳米粒子400mg，制备成悬浮液，通氮气20min以除去氧气。最后加入5μL四甲基乙二胺，密封后，在常温条件下机械搅拌14小时后，依次采用0.7mol/L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

实施例3

将50g磁性材料纳米Fe₃O₄和500mL 1mol/L的油酸充分混匀，40℃条件下，反应24小时，然后用纯水多次洗涤，进而分散到乙醇溶液中。其次，将20g分散的磁流体、40g的氨水和12g四乙氧基硅烷加入到200mL乙醇和水的混合溶液中(5/1，V/V)，60℃条件下，反应24小时，在其表面包被SiO₂薄膜。随后，将0.5mL γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和0.5mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷分散到50mL纯水中，反应10小时后，缓慢滴入含有2g包被了SiO₂薄膜的Fe₃O₄的50mL纯水中，100℃条件下，反应24小时，然后用纯水多次洗涤，真空干燥，形成褐色粉末。最后，将120mg模板分子溶菌酶和丙烯酰胺按摩尔比3000∶1的量溶解在20mL 0.5mol/L磷酸缓冲盐溶液(pH 7.0)中，超声10min，然后依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺300mg、引发剂过硫酸铵20mg、酸性功能单体甲基丙烯酸50mg、上述磁性纳米粒子400mg，制备成悬浮液，通氮气30min以除去氧气。最后加入40μL四甲基乙二胺，密封后，在常温条件下机械搅拌24小时后，依次采用1mol/L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

Claims

1.一种具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理；

步骤二：在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO₂薄膜；

步骤三：对表面包被有二氧化硅SiO₂薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰氧基修饰；

步骤四：将溶菌酶和碱性功能单体丙烯酰胺按摩尔比1000：1～3000：1的量加入到0.2～0.5mol/LpH为 5.0～7.0的磷酸缓冲盐溶液中，使得溶菌酶的最终浓度为2mg/mL～6mg/mL，超声5-10min；

步骤五：在上述溶菌酶溶液中依次加入交联剂甲叉丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子，加入的量为：交联剂甲叉丙烯酰胺与引发剂过硫酸铵、酸性功能单体甲基丙烯酸和包被有二氧化硅SiO₂薄膜并经巯基和丙烯酰氧基修饰的磁性纳米粒子的质量比依次为20～60﹕1～4﹕6～10﹕80，并使得交联剂甲叉丙烯酰胺与碱性功能单体丙烯酰胺的质量比为1﹕6～1﹕10，制备成悬浮液，通氮气20～30min以除去氧气；

步骤六：向制备成的悬浮液中加入四甲基乙二胺，使四甲基乙二胺在悬浮液中的浓度为0.5～2μL/mL，密封后，在常温条件下机械搅拌12～24小时后，依次采用0.5～1mol/L的氯化钠溶液、纯水洗涤以去除模板分子，真空干燥至衡重，即得具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特性在于，所述的磁性纳米粒子是Fe₃O₄磁性纳米粒子。

3.根据权利要求1或２所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特性在于，采用表面活性剂对磁性纳米粒子进行分散处理的方法是：将磁性纳米粒子分散到0.7～1mol/L的表面活性剂溶液中，所述的表面活性剂为柠檬酸钠或油酸，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1 g/mL，40～60℃条件下，反应12～24小时后, 采用纯水洗涤以去除表面活性剂，并重新分散到乙醇溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度达到1 g/mL。

4.根据权利要求1或2所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特性在于，在磁性纳米粒子表面包被二氧化硅SiO₂薄膜的方法是：将磁性纳米粒子、氨水和四乙氧基硅烷按照5：5～10：0.6～3的质量比加入到由乙醇和水按乙醇：水的体积比为5：1～3：2的比例组成的混合溶液中，使磁性纳米粒子的最终浓度为0.01g/mL～0.1 g/mL， 40～60℃条件下，反应12～24小时后，真空干燥，得到褐色粉末。

5.根据权利要求1或2 所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子的制备方法，其特征在于，对表面包被有二氧化硅SiO₂薄膜的磁性纳米粒子同时进行巯基和丙烯酰氧基修饰的方法是；首先将等体积的γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷加入到纯水中，使得每毫升水中含有5 μL～10μL的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，常温搅拌5～10小时后，在将此溶液滴加到相同体积的含有20～40mg/mL SiO₂薄膜包被的磁性纳米粒子的纯水中，60～100℃条件下，反应12～24小时后，真空干燥，得到褐色粉末。

6.权利要求１至5中任一项所述方法制备的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子。

7.权利要求6所述的具有磁响应性和极高吸附容量的溶菌酶分子印迹纳米粒子在溶菌酶的提纯或检测中的应用。