CN1224428A - 细胞损伤应答元件及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种载体,它具有编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列,所述DNA序列为GADD153启动子内转录起始位点起－74至－35位的核苷酸。该载体包括与编码所述启动子的DNA序列操作性连锁的复制起始位点。此外,宿主细胞以所述的载体转染,并表达细胞损伤应答元件启动子。

Description

细胞损伤应答元件及其用途
                    发明背景
发明领域
本发明主要涉及癌症化学治疗的分子生物学和药理学。更具体地说，本发明涉及一种新型细胞损伤应答元件及其用途。
有关技术说明
用基因毒性药物处理哺乳动物细胞会引起许多“损伤应答”基因mRNA水平增高(参见Holbrook和Fornace(1))。许多这类基因也可以用佛波酯处理来诱导。其中对佛波酯处理没有反应的那些细胞，有此可被肿瘤抑制物基因p53，例如WAF1和GADD45(2,3)激活。可是，仍然有许多DNA损伤诱导基因其激活信号是未知的，GADD153就是其中之一。GADD153特别受到注意，因为细胞损伤之后GADD153mRNA的增加量高于大多数其它“损伤应答”基因。
GADD153起初是从正在增殖的中国仓鼠卵巢细胞中去除UV处理产生的杂交而克隆得到的。GADD153是如下基因的一个亚组，这类基因可用UV照射或其它形式的DNA损伤来诱导，但不被热休克或佛波酯处理所诱导(4)。发现这一亚组的基因受许多损伤DNA或诱导细胞周期终止药物的协同调节(5)。现在它们的人类相应物已被克隆并定位于第12号染色体的12q13.1-q13.2区域(6)。该基因是高度保守的，人基因表现出与仓鼠基因78％的核苷酸一致性。
GADD153基因产物的作用还没有完全确定，但有一些证据表明它们在细胞损伤应答期间在细胞周期的控制上起着一定的作用。当转染细胞后在组成型活泼启动子调控下，GADD153的表达阻止了人卵巢癌细胞增殖形成集落的能力。Zhan等报道，GADD153-表达载体与含有可选择性新霉素抗性基因的载体共转染，使H1299和HeLa细胞的接种效率减低至单用新霉素质粒所得接种率的30％(7)。Barone等给细胞微注射含有GADD153编码区的表达质粒或纯化的GADD153蛋白(8)。据5-溴脱氧尿苷掺入法测定，该质粒和纯化蛋白都阻止了细胞从G1期进入紧接着的S期。这此结果引起的以下争论，即GADD153基因的产物也许涉及DAN损伤或其它类型细胞损伤后，导致中止G1/S过度的细胞机制。
此前已在细胞系和异源移植体中证明，GADD153信号增加的程度与化疗药物顺铂和paclitaxel导致的细胞损伤程度密切相关，这两种药物以不同的信号传导途径转录激活GADD153启动子(9)。要更详细地确定这此途径的起始步骤，必须分析GADD153启动子，明确paclitaxel产生转录激活所必须的成份。
现有技术中缺乏对paelitaxel激活GADD153启动子所需的细胞损伤应答元件(CIRE)的验定和特征描述。本发明填补了该领域长期以来的这一需求。
                       发明概述
paclitaxel诱导的损伤在转录水平激活GADD153启动子。启动子中从转录起始位点起的-786至-85碱基对的缺失对激活作用没有明显影响，但是缺失至TATA盒则破坏了该启动子。将-74至TATA盒的39个碱基(细胞损伤应答元件；CIRE)置于腺病毒E4 TATA盒的上游，就提供了paclitaxel诱导性。存在于细胞损伤应答元件内唯一目前已知的共有序列是Sp1位点；该位点的突变将抑制paclitaxel的激活作用。paclitaxel不能激活含有5个Sp1序列的SV40驱动的荧光素酶结构，GADD153启动子内更为上游的Sp1位点是激活作用非必须的。纯Sp1和非损伤细胞及paclitaxel损伤细胞核提取物，保护非编码链-62至-48碱基，和编码链-74至-53碱基之相同区域。在凝胶迁移试验中，核提取物使细胞损伤应答元件迁移的程度与纯Sp1相同，但是对Sp1位点突变的细胞损伤应答元件没有作用。Sp1的免疫缺失不发生迁移；抗Sp1的抗体产生超迁移。以上信息表明，paclitaxel通过组成型方式占据-61碱基的Sp1位点来激活GADD153启动子。
本发明证明，一段短的39个碱基对DNA序列已获鉴定，它在人细胞和组织中起着诱导性启动子的作用。该启动子可明显地被某些类型的细胞损伤，包括癌症化疗药物和UV照射引起的损伤所激活。该序列已被鉴定称为“细胞损伤应答元件(CIRE)”。该DNA片段与一报告基因偶连后可在体外测试系统中用于检测和定量细胞损伤的程度(不仅如此)。
已经明确细胞损伤激活所需序列的最小长度，以及激活需要细胞损伤应答元件内完整Sp1结合位点。动物模型的研究已经完成，显示，以细胞损伤应答元件为其关键性功能元件的全长GADD153启动子，可用于体内定量检测细胞损伤的程度。此外，一项临床试验也已完成，证明，在头颈癌患者中，GADD153启动子的诱导程度可预示临床反应。
对细胞损伤应答元件的认识，可作为开发与癌症治疗及基因疗法广阔领域相关的诊断策略的基础。可能的用途包括但不限于以下所述：细胞损伤应答元件可用来确定和引导抗癌新药的开发。临时性或永久性转染报告基因与细胞损伤应答元件连续结构的细胞，可用于大量筛选天然产物、新类型药物以及现有药物的类似物。报告基因的代表性例子对本领域一般技术人员来说是众所周知的。
细胞损伤应答元件可用来筛检药物的细胞毒性。临时性或永久性转染了和报告基因连锁的细胞损伤应答元件结构的细胞，可用于大量筛检以去除引起细胞损伤的药物。
细胞损伤应答元件可用于激活有助于细胞从损伤中恢复的基因。已知，此基因在表达后能够防止受损细胞的死亡。利用现有的基因治疗技术，此细胞损伤应答元件可与这些保护基因偶联插入正常组织(例如骨髓)以帮助抵抗诸如癌症化疗药物或放射治疗之类的伤害性。这些保护性基因的代表性的实例包括胰岛素、G-CSF或血小板生成素(的基因)。
此细胞损伤应答元件可用来放大损伤信号，使得细胞仅受轻微损伤即死亡。如果细胞损伤应答元件与一毒素基因偶联，那么即使很轻微的损伤也能令细胞死亡。这可以用作治疗癌症的基因疗法的一部分，它包括将细胞损伤应答元件-毒素基因结构插入恶性细胞，来放大无论是常规化疗或放疗所引起的损伤。这种毒素基因的代表性实例包括gelonin、蓖麻毒蛋白和皂角苷，以及其它本领域普通技术人员所知的药物。
本发明实施方案之一中，提供了一载体，该载体包含编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列，所述启动子包含GADD153转录起始位点起-74至-35位的核苷酸，所述载体能在宿主内复制，它操作性连接有：
a)复制起始点；
b)启动子；
c)编码所述启动子的DNA序列。
在本发明另一实施方案中，提供了一种被本发明载体转染的宿主细胞，所述载体表达细胞损伤应答元件启动子，所述启动子包含GADD153转录起始位点起-74至-35位的核苷酸。
为了公开本发明，以下对本发明的优选实施方案进行说明，本发明的其它内容、特征和优点将由此可见。
                       附图简述
为了清晰、得到和详细理解以上所述的本发明特点、优点和目标，参照本文有附图说明的某些实施方案，可以对以上简要归纳的本发明进行更具体的描述。这些附图属于说明书的一部分。但需要指出的是，附图说明的是本发明的优选实施方案，所以，不能将其理解为对本发明范围的限定。
图1显示paclitaxel处理后，GADD153启动子活性和内源mRNA水平的相对升高。用pGADD-LUC脂质转染细胞，用paclitaxel处理，24小时后测定荧光素酶活性(圆形，1)或内源GADD153 mRNA水平(方块，n)。每个数据点代表一式二份实验的平均值±SEM。
图2显示缺失突变对paclitaxel激活GADD153启动子作用的影响。采用PCR为基础的方法产生GADD153启动子pGADD-LUC内的缺失突变，脂质转染到2008细胞内。用70nM的paclitaxel处理该细胞，24小时后测定荧光素酶活性。通过以CCTAGA替换野生型的CCGCCC来产生Spl突变。每个数据点代表至少一式三份实验的平均值+SD。
图3显示paclitaxel对置于一异源启动子上游的细胞损伤应答元件的激活作用。细胞损伤应答元件被置于腺病毒E4早期启动子TATA(转录起始位点起的第-33至+17位碱基)驱动的荧光素酶结构体的5’端，脂质转染到2008细胞内。用70nM的paclitaxel处理该细胞，24小时后测定荧光素酶活性。实心柱表示含有细胞损伤应答元件和TATA区的结构体，空心柱表示仅含TATA区的结构体。每根柱都表示一式二份实验的平均值±SD。
图4显示70nM的paclitaxel对其它含Spl的启动子的激活作用。受GADD153启动子、GADD153的TATA区、SV40早期启动子和细胞色素p45驱动的荧光素酶报告结构体被脂质转染到2008细胞系内，用70nM的paclitaxel处理细胞，24小时后测定荧光素酶活性。每根柱表示一式三份实验的平均值±SD。
图5显示细胞损伤应答元件的DNAseⅠ足迹。转录起始位点起-185至+21位碱基的GADD153启动子区，在编码链SEQ.ID.NO:1或非编码链SEQ.ID.NO:2上用32p标记，与单纯缓冲液(无蛋白质)、2足迹单位的纯化Sp1蛋白(纯Sp1)、10微克未处理细胞的核提取物(未处理)或70nM paclitaxel处理细胞的核提取物(paclitaxel)孵育24小时。各复合物与DNAseⅠ孵育1分钟，用苯酚/氯仿萃取DNA，在6％聚丙烯酰胺/脲凝胶上分离。通过双脱氧测序法来确定位置。Sp1共有位点加以下划线。
图6显示接头扫描突变对paclitaxel激活pGADD-LUC(-185)的影响。用PCR产生在DNAse足迹试验Ⅰ中被保护区域的接头扫描突变。图6A的SEQ.ID.NO:1,SEQ.ID.NO:2和SEQ.ID.NO:3显示了细胞损伤应答元件内的突变部位。大写的碱基是在核提取物的DNAseⅠ消化中被保护的，Sp1位点加了下划线，突变以粗体表示。图6B展示了所述突变的影响。这些突变脂质转染到2008细胞内，用70nM的paclitaxel处理细胞，24小时后测试荧光素酶活性。每个数据点都代表一式二份实验的平均值±SD。
图7显示细胞损伤应答元件和CIRE-Sp1突变体的凝胶迁移率迁移试验。用32p末端标记细胞损伤应答元件(泳道1至6)和CIRE-Sp1突变体(泳道7至12)，与无蛋白(泳道1和7)、纯Spl(泳道2和8)、未处理细胞的核提取物(泳道2,4,9和10)和经paclitaxel处理细胞的核提取物(泳道5,6,11和12)孵育，然后在4％聚丙烯酰胺/0.5％TBE凝胶上分离。
图8显示用免疫缺失了Spl的核提取物进行的细胞损伤应答元件的超迁移和凝胶迁移率迁移试验。如上所述，用32P末端标记细胞损伤应答元件，与无蛋白(泳道1和2)、未处理细胞的核提取物(泳道3和4)、或paclitaxel处理细胞的核提取物(泳道5和6)、和非特异性家兔抗体(泳道1,3和5)或家兔α-Sp1抗体(泳道2，4和6)孵育。还将细胞损伤应答元件与模拟缺失核提取物(泳道7)和Sp1-缺失核提取物(泳道8)一起孵育。
                       发明详细说明
根据本发明，在此可能用到本领域技能中的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有全面的说明。参见，例如，Maniatis,Fritsh&Sambrook,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；“DNA Cloning:APractical Approach,”第Ⅰ卷和第Ⅱ卷(D.N.Glover编辑，1985)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；“Transcription and Translation”[B.D.Hames 8 S.J.Higgins编辑(1984)]“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney编辑(1986)]；ImmobilizedCells and Enzymes[IRL Press(1986)]；B.Perbal,“A Practical Guide To MolecularCloning”(1984)。
所以，在此出现的术语具有以下定义。
在此所述的氨基酸以“L”异构体形式的为佳。但是，“D”异构体形式的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要该多肽保留了所需的功能性质。NH2指多肽氨基末端的游离氨基。COOH指多肽羧基末端的游离羧基。为与标准多肽命名保持一致，以下表格中列出了氨基酸残基的相应缩写(J Biol Chem,243:3552-59,1969)：
                对应表格
     代码                     氨基酸
    单字母       三字母
      Y            Tyr         酪氨酸
      G            Gly         甘氨酸
      F            Phe         苯丙氨酸
      M            Met         甲硫氨酸
      A            Ala         丙氨酸
      S            Ser         丝氨酸
      I            Ile         异亮氨酸
      L            Leu         亮氨酸
      T            Thr         苏氨酸
      V            Val         缬氨酸
      P            Pro         脯氨酸
      K            Lys         赖氨酸
      H            His         组氨酸
      Q            Gln         谷胺酰胺
      E            Glu         谷氨酸
      W            Trp         色氨酸
      R            Arg         精氨酸
      D            Asp         天冬氨酸
      N            Asn         天冬酰胺
      C            Cys         半胱氨酸
应当注意的是，本文所有的氨基酸残基序列都按照从左到右为从氨基末端到羧基末端的常规方向表示。而且，应当指出，氨基酸残基序列开头或末尾的短划表示肽另与一个或多个氨基酸残基序列连续。以上表格将单字母命名与三字母命名相对应，它们可能在本文中交替出现。
“复制子”是在体内起DNA自主复制单位作用的基因元件(例如质粒、染色体、病毒)，即，能够在自己的调控下复制。
“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒(cosmid)，可将其它DNA片段与之连接以引起所连DNA片段的复制。
“DNA分子”指单链形式或双链螺旋形式的脱氧核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。此术语仅指分子的一级和二级结构，不限定于任何具体的三级形式。所以，该术语具体包括在线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA，等。在本文讨论结构时，根据常规，只沿DNA非转录链(即，序列与mRNA相同的链)的5’至3’方向给出序列。
“复制起始点”指参与DNA合成的DNA序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，在体内，它在合适的调控序列控制下，经转录和翻译成为多肽。编码序列的边界由5’(氨基)末端的一个起始密码子和3’(羧基)末端的一个翻译终止密码子确定。编码序列包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核生物(例如哺乳动物)的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’末端。
控制转录和翻译的序列即DNA调控序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸信号、终止子等，它们使得编码序列在宿主细胞内得以表达。
“启动子序列”是一种能够结合蛋白质复合物的DNA调控区，起着启动下游(3’方向)编码序列转录的作用。为了明确本发明，启动子在其3’端与转录起始位点连接，向上游(5’方向)延伸，至包括启动可测水平的(高于背景)转录所必需的最少数量的碱基或元件。启动子序列内是一转录起始位点(通常利用核酸酶Sl酶切图谱法确定)，和蛋白质结合结构域(共有序列)，该结构域结合组装转录起始复合物所需的RNA聚合酶和蛋白质。真核生物启动子经常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核生物启动子除-10至-35位的共有序列之外，还含有Shine-Dalgarno序列。
“表达调控序列”是控制和调节另一段DNA序列的转录和翻译的一段DNA序列。在细胞内，当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后后者被翻译成由编码序列编码的蛋白质时，则称编码序列“在转录和翻译调控序列调控之下”。
“信号序列”可以包括在编码序列之前。该序列编码一信号肽，位于多肽其它结构域的N末端，它向宿主细胞发出信息，将多肽引向细胞表面或分泌到培养基中，而且，在蛋白质离开细胞前，该信号肽被宿主细胞切除。
本文用的术语“寡核苷酸”指本发明的探针，即包含两个或更多个，最好是三个以上核糖核酸的分子。它的确切大小取决于多种因素，这些因素又取决于该寡核苷酸的最终功能和用途。
本文用的术语“引物”指天然存在于纯化的限制性酶消化产物中的，或者合成的一段寡核苷酸，它能够在诱导引物延伸产物(与某核酸链互补)合成的条件下(即存在核苷酸和DNA聚合酶之类的诱导剂和在适当的温度和pH下)，起到合成起始位点的作用。引物可以是单链或双链的，长度必须足够在诱导剂存在下引导所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。例如，就诊断性用途而言，取决于目标序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含15至25个或更多个核苷酸，虽然它也可含少一些的核苷酸。
本文选出的引物是与不同的具体目标DNA序列链“基本”互补的。即，引物必须具有足够的互补性与其对应的链杂交。所以，引物序列不需要反映模板的准确序列。例如，一段非互补性核苷酸片段可以接在引物的5’端，而引物序列的其余部分与此链是互补的。或者，非互补性碱基或较长的序列可以插在引物中间，只要引物序列与该序列具有足够的互补性，或可以与之杂交，由此形成合成延伸产物用的模板。
本文用的“限制性核酸内切酶”或“限制性酶”，指细菌的酶，这两种酶各自能在某一特定核苷酸序列处或附近切断双链DAN。
当外源或异源性DAN被引入细胞后，就称该细胞被所述DNA“转化”。转化DNA可能，也可能不整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如在原核细胞、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可能保持在质粒之类游离体上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞即转化DNA整合到染色体中，由此通过染色体复制而被子代细胞所继承。真核细胞能够形成由一群含有转化DNA的子代细胞组成的细胞系或克隆，可证明这种稳定性。“克隆”是由单个细胞或一个共同的祖细胞有丝分裂形成的一群细胞。“细胞系”是一个原代细胞克隆，能够在体外稳定生长许多代。
两段DNA序列中有一定长度的DNA序列(至少约75％，较好至少80％，最好至少90％或95％)的核苷酸相互匹配则称为“基本同源”。序列是否基本同源可以用序列信息库中的标准软件通过序列比较，或在就具体系统而言的严谨条件下，作Southern杂交实验来确定。确定合适的杂交条件是本领域的常规技术。参见，Maniatis等，(同上)；DNA Cloning，第Ⅰ和Ⅱ卷，(同上)；核酸杂交，(同上)。
DNA结构的“异源”区指大DNA分子中一段可辨认的节段，该节段在天然情况下不与该大DNA分子相联。这样，当异源区编码一个哺乳动物基因时，该基因两侧通常不是源生物基因组中哺乳动物基因组DNA两侧的DNA。在另一例子中，编码序列是一结构体，编码序列本身不是天然存在的(例如，包括内含子的基因组编码序列的cDNA，或具有不同于天然基因的密码子合成序列)。等位变异或天然突变都不产生本文所述的DNA异源区。
所述研究中最常用的标记是放射性元素、酶、接触紫外光而发荧光的化合物或其它物质。有许多荧光物质是已知的，可用作标记。例如，其中包括，荧光素、罗丹明、金色胺、Texas红、AMCA蓝和萤光素黄。一种特殊的检测材料是在山羊中制备并通过异硫氰酸盐与荧光素偶联的的抗-家兔抗体。
同样，酶标记也可使用，可用目前的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流测定法或气体定量法来检测。通过与碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛之类的桥连分子反应，将酶与选定的颗粒偶联。许多用于此类程序的酶都是已知，可以使用。较好的是过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。有关其它标记材料和方法的例子，可参见美国专利3,654,090,3,850,752和4,016,043所公开的内容。
本领域开发和使用的一种特殊的试验系统是受体试验。在受体试验中，待测物质被适当标记，然后定量与某种细胞测试集落一起孵育，然后进行结合研究以确定标记物质与细胞受体结合的程度。如此可以确定物质间的亲和力差异。
所以，本发明是涉及包含编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列的载体，所述载体包含GADD153启动子的转录起始位点起第-74至-35位核苷酸，所述载体能够在宿主内复制，它连锁地包含：a)复制起始点；b)启动子；c)编码所述启动子的DNA序列。较好的是，该载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体和质粒。具体地说，该载体含有序列如SEQ ID NO:9所示的启动子。
本发明还涉及用权利要求1所述的载体转化的宿主细胞，所述载体表达细胞损伤应答元件启动子，所述启动子包含GADD153启动子的转录起始位点起第-74至-35位核苷酸。较好的是，宿主细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
本发明新的CIRE可用来激活编码分泌激素、生长因子、细胞因子、趋化因子或其它多肽的基因的表达。例如，可将载体插入某机体细胞，含有的CIRE驱动一个基团，该基团产物是某种有用蛋白(例如胰岛素、G-CSF或血小板生成素)。然后可以调节所产生蛋白的量，并用局部加热，照射(UV、微波、γ)，或者甚至可能用机械创伤，轻微损伤含插入载体的细胞，使蛋白质释放到机体的其余部分。
在另一种方法中，本发明的CIRE可用来激活产物为转录因子，或能调节其它基因、基因族表达，分化路径或代谢通路的其它蛋白质的基因表达。所以，CIRE可用来启动调控蛋白的表达，该调节蛋白能够调节全组基因或全部通路的活性。CIRE的启动机制与前文所述的相同(加热，照射等)。在该实施方案中，可以激活(1)生物合成通路，例如，用以产生更多的甾体类分子，或(2)降解途径，例如代谢去除体内累积的毒素。而且，CIRE可用来启动导致细胞增殖的转录因子的表达(例如E2F-1或myc)。这样就能够在将插入了CIRE-基因结构的细胞输回机体后外部控制该细胞群的繁殖速度。
本发明的另一实施方案是用CIRE启动黑色素合成途径中限速酶的合成，由此，一旦细胞受到UV照射(日晒)，它将通过启动黑色素合成来自动地保护自己。
在本发明另一实施方案中，CIRE被用来启动编码细胞表面和胞内受体的基因的表达。CIRE与受体基因偶联，当细胞略受损伤时即表达该受体，从此对环境中存的激素、生长因子等变得能产生应答反应。这可能是另一种控制细胞繁殖的方法。例如，如果启动VEGF受体的表达，就可以使得细胞在新生血管部位增殖。如果启动甾体受体基因的表达，就能使细胞对糖皮质激素等产生应答。
以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，但不是对本发明任何形式的限定。
                     实施例1
化合物
Paclitaxel得自Calbiochem(San Diego,CA)。虫荧光素得自AnalyticalLuminescence(San Diego,CA)。DNAseⅠ得自Sigma(St.Louis,MO)。
                     实施例2
细胞培养物
人卵巢癌细胞2008(10)在潮湿的37℃。5％CO2孵育箱内，在添加了5％胎牛血清和2mM谷胺酰胺的RPMI1640中形成呈指数生长的单层细胞。
                     实施例3
载体的构建
pGADD-LUC，受GADD153启动子驱动的荧光素酶受体结构，是如下构建的：将含有仓鼠GADD153启动子的p9000(由Dr.N.J.Holbrook赠与，NIA,NIH,Baltimo,MD)的ClaⅠ/HindⅢ片段连接到pB-LUC(11)的AccⅠ/HindⅢ位点。pB-LUC含有连接在pBluescript KS(Dr.Linda Quattrochi赠与)的BamHⅠ位点的萤火虫荧光素酶基因。用以PCR为基础的方法产生缺失突变。用含有XhoⅠ接头的引物和pBluescript多克隆区内的一反义引物，来产生该启动子的缺失片段。这些片段用XhoⅠ和Hind Ⅲ剪切，并接入pB-LUC的XhoⅠ/Hind Ⅲ位点。自转录起始位点起算-59位，用TCC TAG ACC替代TCC CGC CCC产生Sp1结合位点内的突变。用含有Sp1突变(上述)，或含转录起始位点起算-61位3’突变(CCTCTC TAG替换CCA AAA GAG)的有义和反义取向的引物，产生接头扫描突变。所产生的片段从突变位置至pBluescript的克隆区，和从突变位置至转录起始位点起算-185位(具有XhoⅠ接头)。将这些片段混合，用作模板，与从-185位(具有XhoⅠ接头)至pBluescript克隆区的引物反应。这些片段用XhoⅠ和HindⅢ剪切，并接入pB-LUC的XhoⅠ/HindⅢ位点。
                         实施例4
荧光素酶试验
按Rose等所述方法(12)的改进法，用pGADD-LUC结构转染细胞。将细胞铺平板，每35mm的培养皿3×105个细胞，18小时后在37℃与5微克质粒DNA和30微升脂质体一起培养在1毫升RPMI1640中。3小时后，去除脂质，用paclitaxel处理细胞24小时。在100至500微升裂解缓冲液(25mM N-甘氨酰甘氨酸，pH7.8,15mM MgSO4,4mM EGTA,1％Triton X-100,1mM二硫苏糖醇)中裂解细胞。对Brasier等所述的方法(13)加以改进，用以测定荧光素酶的活性。将50微升细胞裂解液加入反应缓冲液(加入15mM磷酸钾，pH7.8，和2mM ATP的裂解缓冲液)。在裂解液/反应液混合物中注入100微升萤光素后，用Monolight2001(Analytical Luminescence,San Diego,CA)测量光发射。
                      实施例5
核蛋白的提取
沉淀出108个细胞，重悬在A缓冲液(10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl2,10mM KCl和1mM DTT)中制备核提取物。细胞置冰上平衡10分钟，500×g离心5分钟收集。置冰上，在B缓冲液(在A缓冲液中加入0.2％Nonidet P-40(乙基苯基聚乙二醇)，1mM PMSF,10微克/毫升亮抑蛋白酶肽和10微克/毫升抑蛋白酶肽)中裂解细胞10分钟。1000×g离心10分钟来收集细胞核。将细胞核重悬在C缓冲液(20mM HEPES,pH7.9,20％乙二醇，100mM KCl,0.2mM EDTA,1mM二硫苏糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，10微克/毫升亮抑蛋白酶肽和10微克/毫升抑蛋白酶肽)中，然后将KCl最终浓度调至0.4M,4℃振荡30分钟进行裂解。在Beckman台式离心机中以65,000RPM(175,000×g)离心40分钟沉淀出基因组DNA。回收含细胞核蛋白质的上清液，加入乙二醇至终浓度40％。与抗人Sp1蛋白520-538氨基酸的家兔多克隆抗体(PEP2,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)在4℃孵育1小时，从提取物中免疫去除Sp1。用蛋白A/Sepharose(Sigma,St.,Louis,MO)澄清裂解液。
                     实施例6
DNAseⅠ足迹
利用PCR产生一段与转录起始位点起-185至+21位碱基相对应的DNA片段。用XhoⅠ或EcoRⅤ剪切该片段，去除一个引物，利用T4聚核苷酸激酶(Promega,Madison,WI)在单链上进行32P标记，沉淀去除没被标记的核苷酸，然后重悬。将10微克提取物、2足迹单位的纯化Sp1(Promega,Madison,WI)，或无蛋白对照，用Z缓冲液(25mM HEPES,pH7.5,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10μM ZnSO4,20％乙二醇，0.1％Nonidet P-40)稀释至25微升。将25微升含10微升10％聚乙烯醇(Sigma,St.Louis,MO),1毫克聚dI/dC和≥10,000cpm(10-25fmol)标记的DNA，加入蛋白质混合物中，室温下孵育15分钟。加入50微升5mM CaCl2/10 MgCl2混合物，孵育1分钟。然后，加入2微升DNAseⅠ(Sigma,10mg/ml，稀释度从1∶2000至1∶100,000)，再孵育1分钟。加入90微升终止液(20mM EDTA,pH8.0,1％SDS,0.2M NaCl,250μg/ml糖原)来停止反应。用5微升10mg/ml的蛋白激酶K消化蛋白质，并用苯酚萃取将其去除。DNA沉淀并重悬在3微升甲酰胺上样缓冲液中。在6％聚丙烯酰胺/脲测序凝胶上进行条带的分离，暴光于Biomax MS胶片。利用适用于末端标记引物的方案，以Promega Femptomole测序试剂盒(Promega,Madison,WI)进行测序。
                       实施例7
凝胶迁移转移试验
在University of California,San Diego分子生物学核心室构建出与细胞损伤应答元件对应的寡核苷酸，在65℃加热5分钟一齐退火，并在10mM Tris pH7.8,0.1M NaCl和lmM EDTA中37℃孵育过夜。用乙醇沉淀双链细胞损伤应答元件(或突变的Spl细胞损伤应答元件)，重悬在水中并用T4聚核苷酸激酶(Promega,Madison,WI)32p末端标记，沉淀去除未掺入的核苷酸，然后重悬至500pg/μl(约50,000CPM/μl)中。
将50,000CPM细胞损伤应答元件，1μg聚dI/dC,10μg核提取物或2足迹单位人Spl蛋白(Promega,Madison,WI)悬浮在12.5mM HEPES,pH7.8,50mM KCl,6.25mM MgCl2,5μM ZnSO4,10％乙二醇和0.05％Nonidet P-40中，室温孵育30分钟。在4％聚丙烯酰胺/0.5×TBE(45mM Tris-硼酸盐，10mM EDTA)凝胶上进行条带分离，干燥，用Molecular Imager System(Bio-Rad,Hercules,CA)显现。如上在孵育30分钟后加入0.05g抗Spl抗体(PEP2,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)或非特异性兔抗体到该反应混合物中，再孵育30分钟，其余如上所述，进行超迁移试验。
                         实施例8
Northern印迹
提取全细胞RNA，按标准方法(14)用MagnaGraph尼龙薄膜(MSI,Westboro,MA)制备Northern印迹。用Molecutar Imager System(Bio-Rad,Hercules,CA)定量测定杂交程度。人GADD153探针由Dr.J.J.Holbrook(NIA,NIH,Baltimore,MD)提供。通过与β肌动蛋白探针相同的杂交印迹比较来校正泳道的上样量差异。
                         实施例9
paclitaxel对GADD153启动子和内源性GADD153mRNA的作用
在卵巢癌细胞系2008中研究paclitaxel对GADD153启动子驱动的荧光素酶结构和内源性GADD153mRNA的作用。用5微克pGADD-LUC转染细胞，然后与paclitaxel接触24小时，此刻测定荧光素酶的活性和内源GADD153mRNA的水平。如图1所示，paclitaxel诱导了GADD153启动子活性和内源GADD153mRNA水平二者的浓度依赖性提高，提高的数量级相同。
如图2所示，用PCR产生了GADD153启动子内的缺失。将这些结构转染到2008细胞内，测定其在与70nMpaclitaxel接触后的可诱导性(与只用云载体处理的细胞比较)。从转录起始位点起-786至-85的缺失对paclitaxel激活GADD153启动子没有明显影响。至-74碱基对的缺失则提高了可诱导性近2倍，提示-74位5’端的11个碱基含有转录抑制物。启动子进一步缺失至-35位碱基(只剩下TATA盒)则降低paclitaxel诱导性2.2倍。这提示，从-74位至TATA盒的39碱基对中含有负责paclitaxel诱导的GADD35启动子活性提高的元件。仅含TATA盒的结构体被激活2倍，这一发现提示paclitaxel诱导的损伤对基本转录机制有轻微正效应。
                       实施例10
将paclitaxel-应答元件转移到异源启动子作中
为了确定从-74位至TATA盒的39碱基是否足以使其它启动子具有对paclitaxel的应答性，这些碱基被转移到含腺病毒E4-TATA盒的启动子中。这39个碱基与-TATA盒的相应位置保持一致。如图3所示，这39个碱基使E4-TATA区具有了paclitaxel诱导性，诱导的程度与用-74GADD-LUC结构产生的相似。将此39碱基对区确定为细胞损伤应答元件(CIRE)。CIRE的序列为SEQ ID NO:9:
AGG CTC CTG GGT CCC GCC CCC CAA AAG AGG GGA CGG GCC完整启动子源序列见Luethy等，J.Biol.Chem,(265(27))16521-26(1990)。
                      实施例11
CIRE内的Sp1位点突变
从-74至-35的细胞损伤诱导元件区内只含有一个已知转录因子识别序列，即Sp1结合位点。用基于PCR的系统将该位点从CCCGCCCC突变成CCTAGACC，并测试该结构的活性。如图2下方所示，该突变使paclitaxel激活启动子的能力由20.0倍降低至5.3倍，表明，Sp1位点是提供paclitaxel敏感性的序列中的必需部分。
                      实施例12
paclitaxel对其它含Spl启动子的作用
既然Sp1看来是paclitaxel诱导启动子活性最大增加所需要的，故对paclitaxel是否激活所有含Sp1的启动子进行了测定。用含5个功能性Sp1位点的SV40即刻早期启动子，和也含5个Sp1位点的细胞色素p450 CYPlAl启动子对比进行了研究(15)。如图4所示，paclitaxel对这些结构体中的启动子只提高活性2倍，这与仅含一个TATA盒的启动子所见的提高相同。所以，虽然知道Sp1是paclitaxel激活作用所需要的，但并不充分，相对TATA盒的Sp1位点的确切定位可能是至关重要的。
                     实施例13
GADD153启动子的DNAseⅠ足迹分析
为了确定细胞损伤应签元件中哪些碱基参与了对paclitaxel的应答，进行了DNAseⅠ保护试验。转录起始位点起-185至+21碱基的GADD153启动子区以32P作末端标记，与单纯缓冲液、或与2足迹单位纯Sph蛋白，10微克未处理细胞的核提取物，或与10微克70nMpaclitaxel处理细胞的核提取物孵育24小时。
如图5所示，纯Sp1和未处理和处理细胞的核提取物，都保护非编码链上从-62至-48碱基的相同区域。核提取物保护编码链上-74至-53碱基；纯Sp1的保护方式类似，保护第-71至-53碱基。两条链上的被保护区域包含了始于-61位碱基的Sp1位点。该信息揭示，Sp1，一种含Sp1的蛋白质复合物，或一种结合特性与Sp1相同的蛋白与细胞损伤应答元件组成型地结合。
                     实施例14
对在足迹试验中被保护位点的接头扫描突变
为了确定在DNAse保护试验中，被保护的各位点是否是paclitaxel激活GADD153启动子所需要的，还是简单地以非特异性方式被保护，使用接头扫描法对Sp1位点和Sp1位点3’方向的碱基进行了突变。图6上部列出了细胞损伤应答元件和所构建的突变的序列。如图6下部所示，Sp1位点的突变使这些结构的可诱导性减低至仅含TATA盒的-35pGADD-LUC的水平。Sp1位点3’方向的碱基突变对paelitaxel激活启动子没有明显的影响。这些信息表明，paclitaxel激活GADD153启动子所需要的是Sp1位点，而不是Sp1位点3’方向的被保护位点。
                       实施例15
凝胶迁移转移试验
为了进一步证明细胞损伤应答元件与未处理和paclitaxel处理细胞核蛋白之间的相互作用，进行了凝胶迁移转移试验。核提取物与32P标记的细胞损伤应答元件一起孵育，在0.5×TBE/4％聚丙烯酰胺凝胶上分离。如图7所示，5微克和10微克未处理或paelitaxel处理细胞的核提取物，使细胞损伤应答元件和纯化Sp1蛋白发生相同程度的迁移(以Ⅰ标识，泳道2至6)。但是，当核提取物与Sp1突变细胞损伤应答元件一起孵育时，没有观察到迁移(在图7和图8中以A标识，在图7和图8中一条非特异性迁移条带以A标识)。所以，负责细胞损伤应答元件凝胶迁移的蛋白质的结合，依赖于细胞损伤应答元件内功能性Sp1位点的存在。
既然表观分子量迁移依赖于功能性Sp1位点，那么与核提取物孵育后，对Sp1是否与细胞损伤应答元件结合进行了测定。如图8所示，将接触核提取物的细胞损伤应答元件与免抗人Sp1蛋白520-538氨基酸(PEP2)的多克隆抗体共同孵育，引起了超迁移，并提高了迁移复合物的表观分子量(以Ⅱ标识，泳道4和6)，而非特异性兔抗体对复合物的迁移率没有影响(以Ⅰ标识，泳道3和5)。这表明，Sp1蛋白是引起细胞损伤应答元件迁移的复合物的一部分。
为了确定Sp1蛋白是否是形成引起细胞损伤应答元件迁移的复合物形成所需要的，利用PEP2抗Sp1抗体从核提取物中免疫去除Sp1。该模拟缺失的提取物使细胞损伤应答元件迁移的程度与未处理核提取物引起的相同(泳道7)。然而，Sp1免疫缺失不引起迁移(泳道8)。所以，Sp1蛋白是形成引起细胞损伤应答元件迁移的复合物所需要的。
本发明证明，用化疗药物paclitaxel治疗卵巢癌细胞，至通过一个鉴定为细胞损伤应答元件(CIRE)的成分激活了GADD153启动子，该成分不到39个碱基，紧靠TATA盒的5’端。有三条证据确认，本发明的细胞损伤应答元件对于转录激活该启动子是必需而且充分的。首先，细胞损伤应答元件的缺失去除了paclitaxel激活GADD153启动子的能力，不超过用仅含TATA盒的启动子所观察到的水平。其次，该元件内关键性的Sp1位点的突变抑制了paclitaxel激活该启动子的能力。第三，将细胞损伤应答元件转移到异源启动子的5’端产生了paclitaxel诱导性。
Sylvester等的工作揭示，用脂多糖处理后转录激活GADD153启动子，需要转录因子与启动子内转录起始位点起-332至-323的C/EBP元件结合(15)。不过，该元件似乎不参与细胞对paclitaxel的应答。这一信息与此现象一致，即多条路径可介导GADD153的诱导，路径的不同取决于生长抑制刺激物种类的不同(9,16)。
介导paclitaxel转录激活作用的细胞损伤应答元件，含有一个位于转录起始位点起-61碱基处的Sp1共有序列(CCCGCC)。如直接突变和接头扫描突变所示，该位点是paclitaxel激活启动子所需要的，而该启动子内更靠5’方向的3个Sp1位点显然是不需要的，而且不能取代细胞损伤应答元件内的那个Sp1位点。细胞损伤应答元件内的Sp1位点的特殊性还进一步被以下事实所证明：paclitaxel不能激活sv40早期启动子，表明仅仅Sp1位点不足以引起完全的激活作用。该结果为以下结论提供了强有力的证据，即负责paclitaxel激活GADD153启动子的转录因子是Sp1，或是一种极密切相关蛋白质。在DNAesⅠ保护试验中，纯Sp1的足迹与该启动子区域内的核提取物的相似。核提取物中的一个蛋白或几个蛋白结合了细胞损伤应答元件，使得DNA的迁移程度与纯Sp1蛋白的相同，但不能使Sp1位点内含有突变的细胞损伤应答元件迁移。针对Sp1的抗体引起核提取物/细胞损伤应答元件复合物的超迁移，这表明Sp1是该复合物的一部分。是这一结合所必需的，因为从核提取物中免疫去除Sp1不能引起凝胶迁移。这些实验强有力地提示Sp1是结合细胞损伤应答元件的蛋白。另有一种很小的可能性，即某种与Sp1抗体交叉反应的蛋白是结合细胞损伤应答元件的蛋白。最近的证据揭示有一个蛋白质家族，它们可结合Sp1共有序列(17-20)，可是PEP2抗Sp1抗体是高度特异性的而且不与其它家族内成员交叉反应这个事实，使该家族内其它已知成员参与此事是不可能的。
起初认为Sp1是仅涉及基因的组成型表达的一个普遍存在的转录因子(21)，然而最近的证据提示在有些情况下，Sp1对调控表达十分重要。为了获得组织特异性表达，Sp1可与一种细胞特异性蛋白一齐起作用。Sp1和甾醇调控结合蛋白Ⅰ，都是低密度脂蛋白受体启动子的正常甾醇-介导调控所需要的(22)。该调节方法还被用于TF-1红白血病细胞系中。在该系统中，Sp1在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子刺激后与p53复合，这在不改变总Sp1蛋白水平的情况下导致了Spl与其共有序列结合的增加(23,24)。Sp1参与组织特异性转录的第三个实例是，对髓细胞整合蛋白CD11b启动子的接头扫描突变证明，Sp1位点的突变破坏了髓细胞特异性启动子的活性(25)。有趣的是，使用体外足迹法，发现Sp1与HeLa细胞和髓细胞内的这种共有序列都结合，但是Sp1位点仅在髓细胞内的体内足迹法中受到保护。在单核细胞系内也证明了相似的发现。单核细胞标记基因CD14内的Sp1位点突变降低了单核细胞启动子的活性，并且对HeLa细胞的此种活性只有很小的作用(26)。所以，现在有数个转录激活启动子的例子，其中Sp1是必须成份，然而涉及的是调控型而非组成型表达。
尽管证据表明细胞损伤应答元件内的Sp1结合位点是paclitaxel诱导GADD153启动子活化所必需的，但paclitaxel并不改变Sp1与共有序列的表观结合。采用来自未处理和接触过paclitaxel的两种细胞的核提取物，Sp1都存在于这两种细胞的核提取物与paclitaxel细胞损伤应答元件形成的复合物中。在体外DNAseⅠ保护实验中两种细胞的核提取物都产生与Sp1相一致的足迹。可是，有证据表明这样的组成型结合存在于几种其它Sp1依赖性诱导系统中。成视网膜细胞瘤蛋白通过成视网膜细胞瘤调节了元件(RCE)调控许多基因的表达，其中包括c-fos,c-jun,c-myc,IGF-Ⅱ和TGF1(27,28)。在IGF-Ⅱ和c-jun启动子中，Sp1蛋白与RCE组成性地结合(27,28)。在c-jun启动子内，这种结合的量在对RB的表达应答中增加，这可能是通过RB蛋白与Sp1结合抑制物的相互作用，但是在IGF-Ⅱ启动子中，用凝胶迁移或DNAseⅠ足迹法测量都没有观察到在RB表达之后，SPI结合的改变(27)。
显然，在GADD153启动子中，必需有Sp1位点并且含有Sp1的复合物的形成，这些本身并不足以激活此启动子，提示激活还需要其它过程，例如Sp1本身的磷酸化，或其与之联合的一种TAF的磷酸化。最近的信息提示，paclitaxel可激活许多蛋白质激酶(29,30)。已经表明，paclitaxel可引起巨噬细胞TNF释放的增加和TNF受体的上调(31)。对细菌LPS低反应的小鼠缺乏这种效应，提示paclitaxel和LPS作用于相同的效应物。最近发现，paclitaxel和LPS激活巨噬细胞相同的基因，可能是通过41KD和42KD蛋白的酪氨酸磷酸化(32)。Liu等记载道，paclitaxel通过诱导凋亡杀死细胞(30)，并且在凋亡反应过程中，抑制物bcl-2减少。染料木黄酮(genistein)或除莠霉素(herbamycin)可阻断凋亡的增加和bcl-2表达的减少，提示paclitaxel是通过酪氨酸激酶起着这样的作用。Haldar和Croce已经证明，paclitaxel处理使bcl-2磷酸化并失活，所以激活了凋亡反应(29)。用100nMpaclitaxel处理24小时，增加了组蛋白H3的磷酸化(未给出数据)。所以，paclitaxel处理激活许多不同的激酶，这些激酶负责Sp1组成性结合DNA后转录的激活。
有证据表明，Sp1的磷酸化会改变它的转录活性。冈田软海绵酸通过Sp1位点刺激HIV LTR，但是Sp1与启动子的结合特性并不改变(33)。利用Western印迹法发现，冈田软海绵酸处理造成Sp1由低磷酸化状态(95kD)完全转化成高磷酸化状态(105kD)。为了确定Sp1的磷酸化是否引起与TBP或与TBP相连的蛋白(TAFs)相互作用的变化，TATA盒被换以非TBP结合性TATA盒。这一改变极大地降低了冈田软海绵酸的诱导性。作者假设，Sp1的磷酸化加强了与TBP或TAFs的相互作用，这导致了转录活性的提高。
可能Sp1组成性地结合位于转录起始位点起-61位的Sp1位点，然后在paclitaxel处理后，发生了翻译后修饰作用，这令Sp1激活了转录。由于paclitaxel处理不改变Sp1的磷酸化依赖性电泳迁移率，所以，可能，如果涉及磷酸化的话，那可能基本目标是一种TAFs。或者，活化作用是由于Sp1内磷酸化位点分布的改变，这种改变不改变Sp1的电泳迁移率。这种磷酸化的改变使得与Sp1相作用的TAF(例如TAFⅡ110(34))既结合Sp1也结合TATA结合蛋白，从而引发转录。另一种解释是，paclitaxel处理对Sp1蛋白没有作用，但修饰了TAFⅡ110或另一种TAFs，使得它们能够与Sp1和TBP结合，加强转录。虽有其它提示Sp1可能作为诱导性基因的转录因子的观察所见，但不知道为什么同一启动子内某一Sp1位点可引发转录激活，而其它Sp1位点则不然。GADD153启动子内-61位的Sp1位点具有某些特殊性质，对于它的阐明将有助于解答以上困惑。
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本文提及的所有专利或出版物都反映了本发明所述领域技术人员的水平。本文对这些专利或出版物进行了相同程度的引用和参考，比如，每一出版物都被具体和单独地列出过作为参考一样。
本领域技术人员很容易理解，本发明可以很好的实现本发明的目的，并获得所提及的以及隐含的那些结果和好处。本文就方法、程序、处理、分子和具体化合物所举的例子代表了本发明的优选实施方案，它们是范例性的，而不是要限定本发明的范围。对本领域技术人员来说，对本发明的改动和其它应用，都包括在本发明权利要求的宗旨和范围之内。
                 序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：研究发展基金会(ⅱ)发明名称：新的细胞损伤应答元件(ⅲ)序列数量：6(ⅳ)通讯地址：
   (A)收件人：James F.Weiler，律师
   (B)街道：One Rieverway,Suite 1560
   (C)城市：Houston
   (D)州：Texas
   (E)国家：USA
   (F)邮政编码：77056(ⅴ)计算机可读形式：
   (A)媒质类型：DS,HD1.44Mb/1.44Mo
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：WordPerfect 6.0(ⅵ)目前申请信息：
   (A)申请号：
   (B)申请日期：
   (C)分类：(ⅷ)律师/代理人信息：
   (A)姓名：Weiler,James F.
   (B)注册号：16,040
   (C)参考/卷宗号：D5890(ⅸ)电讯信息：
   (A)电话：713-626-8646
   (B)电传：713-963-5853(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GGCAGGCTCC TGGGTCCCGC CCCCCAAAAG AGGG    34(3)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:CCGTCCGAGG ACCCAGGGCG GGGGGTTTTC TCCC    34(4)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3：GGCAGGCTCC TGGGTCCCGC CCCCCAAAAG AGGG    34(5)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否   (ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CCGTCCGAGG ACCCAGGGCG GGGGGTTTTC TCCC    34(6)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
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   (D)发育阶段：
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   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:GGCAGGCTCC TGGGTCCCTA CACCCAAAAG AGGG    34(7)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:CCGTCCGAGG ACCCAGGGAT CTGGGTTTTC TCCC    34(8)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:GGCAGGCTCC TGGGTCCCGC CCCCCTCTCT AGGG      34(9)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：34
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
   (B)菌株：
   (C)单独分离株：
   (D)发育阶段：
   (F)组织类型：
   (G)细胞类型：
   (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:CCGTCCGAGG ACCCAGGGCG GGGGGAGAGA TCCC     34(10)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：39
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：其它核酸(ⅲ)推定：否(ⅳ)反义：否(ⅵ)最初来源：
  (B)菌株：
  (C)单独分离株：
  (D)发育阶段：
  (F)组织类型：
  (G)细胞类型：
  (H)细胞系：(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:AGG CTC CTG GGT CCC GCC CCC CAA AAG AGG GGA CGG GCC    39

Claims (16)

1．一种载体，具有编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列，所述启动子包含GADD153启动子内转录起始位点起-74至-35位的核苷酸，它操作性地连锁有：
a)复制起始位点；
b)启动子；和
c)编码所述启动子的DNA序列。
2．根据权利要求1所述的载体，其中所述的载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体和质粒。
3．根据权利要求1所述的载体，其中所述的启动子具有SEQ ID NO.9所示序列。
4．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与报告基因连锁。
5．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与编码一个蛋白质的基因连锁，该蛋白质选自：分泌的激素、生长因子、细胞因子和趋化因子。
6．根据权利要求1所述的载体，其中所述的蛋白选自胰岛素、G-CSF和血小板生成素。
7．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与编码转录因子的基因连锁。
8．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与编码黑色素的基因连锁。
9．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与编码细胞表面受体的基因连锁。
10．根据权利要求9所述的载体，其中所述的表面受体是表皮生长因子受体。
11．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与编码胞内受体的基因连锁。
12．根据权利要求11所述的载体，其中所述的胞内受体是甾体类激素受体。
13．根据权利要求1所述的载体，其中所述的编码细胞损伤应答元件启动子的DNA序列与毒素基因连锁。
14．根据权利要求13所述的载体，其中所述的毒素基因选自gelonin、蓖麻毒蛋白和皂角苷。
15．用权利要求1所述载体转染的宿主细胞，所述的载体表达细胞损伤应答元件启动子，所述启动子具有GADD153启动子内转录起始位点起-74至-35位的核苷酸。
16．根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述的细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
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