CN1223376C - 丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗及其制备方法和应用。涉及分子生物学技术，是针对危害严重的HCV病毒，提供一种具有免疫原性的丙型肝炎疫苗。所述的多表位抗原复合体多肽由142个氨基酸组成，分子量为13.8KD，等电位点为8.3。其制备方法包括：基因设计、有效表达、表达产物的分离纯化和多肽免疫原的制备。试验数据表明，本发明具有作为用于人群预防丙型肝炎疫苗和检测诊断用材料的良好前景。
Description
一、技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及利用生物体制备的疫苗。
二、背景技术
病毒性肝炎是危害人类健康的一类重症疾病，其病原体是一类结构各异的嗜肝性病毒，迄今为止，已经发现的肝炎病⑤毒共有7个类型，它们分别是HAV、HBV、HCV、HDV、HEV和可能的TTV及HGV。这些肝炎病毒所引起的肝炎均表现有肝脏实质细胞的坏死，对肝脏的功能产生较严重的病理影响，从而对人体造成较大的危害。由于至今尚未发现有效的抗病毒药物，因此，对各种类型病毒性肝炎的防治着重于疫苗的预防。随着生物技术的进步，甲型肝炎减毒活疫苗及死疫苗和乙型肝炎基因工程疫苗的应用已使甲型肝炎和乙型肝炎在人群中的传播得到了有效的控制，但同时，其它型别的病毒性肝炎，尤其是HCV引起的丙型肝炎亦成为主要的流行类别。因而对它们的防治也成为这个领域中主要的研究内容。
由HCV引起的丙型肝炎，早先曾被称为“输血源性的非甲非乙型肝炎”，但以后的研究证明，丙型肝炎不仅由输血方式传播，而其它方式如消化道、性接触等，均可导致丙型肝炎的传播。因此，在人群中有广泛的传播。据我国近年来的流行病等抽样估算认为，目前我国丙型肝炎感染人数可能在6000万左右。同时丙型肝炎的危害之处更在于其发病后常常导致其慢性化，并有较大的机率转变为肝硬化，因此，对该病的预防具有重要的临床意义。研究已明确，HCV属于黄病毒，为单股RNA病毒。其基因编码一条完整多肽，包括包膜蛋白E、核心蛋白C和非结构蛋白NS等等，经酶切后与基因RNA一道组装成为完整病毒颗粒。目前全世界共发现HCV有6个基因型，若干个血清型。我国的主要流行型分别为I型和II型。
对HCV的病原分子生物学研究表明，至目前为止，人们尚未找到一种有效的可供HCV生长的细胞基质，因此，按传统方法制备减毒或是灭活的HCV疫苗是难以进行的；其次，对HCV的抗原分析研究表明：作为HCV的表面结构蛋白E蛋白(包括E1和E2部分)，以及核的结构蛋白C蛋白，均不能单独作为抗原使用以诱导机体产生有效的抗HCV免疫应答，其原因在于，第一，各个HCV基因型及血清型之间的基因变异较大，尤其表现在E抗原结构蛋白，变异度高达30％，因而一个型别的C或E抗原所诱导的免疫应答难以抵抗其它型别的HCV感染；其次，无论是C或是E抗原，其结构中均有某些特殊的位点，能够拮抗其中的T、B细胞的免疫原性，因此不能够诱导有效的免疫保护性应答。再者，对HCV的其它非结构性蛋白的抗原性分析亦未能寻找到可以诱导有效免疫应答的特定成分。因此，在上述研究中均无法找到研制丙型肝炎疫苗的突破点。(黄健生、任大明.丙型肝炎.北京：人民军医出版社，2000.5)
三、发明内容
(一)本发明所要解决的技术问题
本发明针对研制丙型肝炎疫苗中的技术难题，提供一种丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗。同时，本发明还提供所述疫苗的制备方法和应用。
(二)本发明采用的技术方案：
本发明主要是应用分子生物学技术，利用病原体的抗原多肽，寻找一种病原体的有效抗原表位，并在综合分析的基础上合适地组合这些有关的保守性较强的表位，使之形成一种可以从细胞免疫和体液免疫方面，发挥免疫原性的多表位抗原多肽分子，并将之在原核或真核系统中有效的表达、纯化，制备成丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗。本发明所述的疫苗具有以下特征：
1.组份及含量
每一个可以引起动物产生有效免疫反应的剂量包含下列成分：丙型肝炎多表位抗原复合体多肽(蛋白量)20μg，甲醛≤1mg，Al(OH)3(佐剂)≤0.5mg，0.01M磷酸缓冲盐溶液(PBS)0.5ml。
2.序列特征
丙型肝炎多表位抗原复合体多肽基因的大小为439bp；在此基因中，对所包括的7个HCV抗原表位的氨基酸序列根据结构动力学要求进行了突变修饰；并接入了可以增强T细胞应答的短链系列(IYFY
PSVD)；同时根据大肠杆菌偏好的密码子规律设计了易于在大肠杆菌中表达的特定碱基序列。
3.丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗的基因序列描述
ATGTTAACTT TATGCGGCAT GAGCACCAAC CCGAAACCGC AGCGTAAAAC 50
TACAATTGAA ATACGCCGTA CTCGTGGTTG GGCTTTGGCG TCGCATTTTG
CAAACGCAAC ACCAATCGTC GTCCACAAGA TGGCCCAGGT CCGGGTTTTG 100
GTTTGCGTTG TGGTTAGCAG CAGGTGTTCT ACCGGGTCCA GGCCCAAAAC
CGGATCTGAT GGGTTATATT CCATTAGTTG GCGCCCCATT AGGTCCAGGT 150
GCCTAGACTA CCCAATATAA GGTAATCAAC CGCGGGGTAA TCCAGGTCCA
CCAGTTTATT TACTGCCGCG TTATCCACGT GGTCCGGGTC CGGAACTGAT 200
GGTCAAATAA ATGACGGCGC AATAGGTGCA CCAGGCCCAG GCCTTGACTA
TACGAGATGC TCGAGCGGTC CAGGTCCAAT TTATTTTTAT TTTCCGAGCG 250
ATGCTCTACG AGCTCGCCAG GTCCAGGTTA AATAAAAATA AAAGGCTCGC
TGGATGGCCC GGGTCCGGTG AGCGGTCATC GTATGGCGTG GGATATGATG 300
ACCTACCGGG CCCAGGCCAC TCGCCAGTAG CATACCGCAC CCTATACTAC
ATGAATTGGA GCGGTATGAA TTGGAGCGGT CCGGGTCCGG GCCCGTGCCC 350
TACTTAACCT CGCCATACTT AACCTCGCCA GGCCCAGGCC CGGGCACGGG
GACCGATTGC TTTCGTAAAC ATCCGGAAGC GGGCCCGGGT CCGACCGGCG 400
CTGGCTAACG AAAGCATTTG TAGGCCTTCG CCCGGGCCCA GGCTGGCCGC
ATTTTGATAG CGTGATTGAT TGCAACTAG 450
CAAAACTATC GCACTAACTA ACGTTGATC
4.丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗的蛋白序列描述
MLTLCGMSTN PKPQRKTKRN TNRRPQDGPG PGFADLMGYI PLVGAPLGPG PVYLLPRYPR
GPGPELITRC SSGPGPIYFY FPSVDGPGPV SGHRMAWDMM MNWSGMNWSG PGPGPCPTDC
FRKHPEAGPG PTGDFDSWID GN
本发明提供了丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗的制备方法，该法包括：
1.丙型肝炎多表位抗原复合体多肽的基因设计：根据本发明人对HCV结构及非结构蛋白的分析研究，本发明在现有资料所提供的HCV抗原表位选取了7个抗原表位进行了基因工程技术的改造。这7个抗原表位分别是：
C1-20：MSTNPKPQRKTKRNTWRRPQD
C129-144：GFADLMGYIPLVGAPL
C34-42：VYLLPR
PR
E1315-327：VSGHRMAWDMMMNWSG
P
E2581-592：CPTDCFRKHPEA
NS52781-2788：ELIT
CSS
NS31445-1455：TGDFDSVIDGN
注：
特定的是突变位点。
2.丙型肝炎多表位抗原复合体多肽在技术上的有效表达：使用国内基因工程产品使用的载体pBV220，并根据相应的预实验，确定了抗HCV的复合体多肽基因的接头方式，PLPR启动子与起始密码子ATG距离为4个碱基。同时 也确定了重组表达菌的热诱导表达方案为30℃180转/分振荡培养8小时以活化菌体，然后增温至42℃进行热诱导，继续培养5小时。表达系统的宿主系统为大肠杆菌DH5a株。
3.丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达产物的分离纯化：
①2×YT培养基30℃培养细菌过夜，42℃诱导培养4小时后，将培物4000rpm离心10分钟得到菌体；②PBS缓冲液悬浮后400W超声破碎包涵体，12000rpm离心15分钟去除沉淀得到上清；③将上清SephadexG25脱盐、离子交换和排阻层析，得到初步纯化的产品。
4.多肽疫苗的制备：
将上述纯化的HCV多表位抗原复合体多肽经紫外分光光度计测定其有效蛋白浓度，按实际浓度制备为5μg，10μg，20μg/100μl浓度溶液，加甲醛至1mg/ml，37℃1小时，加Al(OH)3至0.5mg/ml，室温振摇3小时，然后用0.01M磷酸缓冲盐溶液0.5ml稀释，得到试验性疫苗。
(三)本发明的有益效果
1、独立设计了一种丙型肝炎多表位抗原复合体多肽的基因，其包含7个HCV抗原位点，被在特定部位进行了突变修饰和添加修饰。并经基因工程获得这个基因并构建了该基因在大肠杆菌的表达系统；
2、独立设计该丙型肝炎多表位抗原复合体多肽的表达、纯化分离，并以此技术获得了该多表位抗原复合体多肽在原核系统中的表达产物和纯化后的产物；
3.独立证实了该复合体多肽基因工程表达产物具有在动物体内诱导抗HCV抗体产生的能力，并可以使来自多个领域的抗HCV阳性血清所识别；
4.佐剂处理后不同剂量丙型肝炎多表位抗原复合体多肽免疫小鼠3次后血清抗体检测结果表明，在适量剂量时可有效地诱导小鼠的体液免疫反应，产生特异性抗体，具有良好的免疫原性，
5.HCV多表位抗原复合体多肽具有作为用于人群预防丙型肝炎的疫苗候选品良好的药用前景；
6.HCV多表位抗原复合体多肽具有做为用于丙型肝炎抗体检测的诊断用材料良好的药用前景。
四、附图说明
图1为丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达系统构建过程示意图；
图2为丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达产物的纯化流程示意图；
图3为丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达载体pBV-HCB2的基因测序结果；
图4为经热诱导表达的丙型肝炎多表位抗原复合体多肽在SDS-PAGE的凝胶电泳检测结果(A)及表达产物在菌体中的分布(B)；
图5为丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达产物分离纯化流程中的脱盐层析图；
图6为与图5相对应的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；
图7为丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达产物分离纯化流程中的阳离子交换图谱；
图8为与图7相对应的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；
图9为丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达产物分离纯化流程中经排阻层析后得到的纯化蛋白图谱；
图10为与图9相对应的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果；
图11为佐剂处理后不同剂量丙型肝炎多表位抗原复合体多肽免疫小鼠3次后血清抗体检测结果。
五、具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明的内容作进一步说明，但本发明的内容并不局限于此。
制备实施例：
①基因构建：根据如上所述的序列设计，分别合成8条寡核苷酸链，其具体序列如下：
a1：GAGCACCAAC CCGAAACCGC AGCGTAAAAC CAAACGCAAC ACCAATCGTCGTCCACAAGA
a2：AATGGAATAT AACCCATCAG ATCCGCAAAA CCCGGACCTG GGCCATCTTGTGGACGACGA
a3：GGGTTATATT CCATTAGTTG GCGCCCCATT AGGTCCAGGT CCAGTTTATTTACTGCCG
a4：CGAGCATCTC GTAATCAGTT CCGGACCCGG ACCACGTGGA TAACGCGGCAGTAAATAAAC
b1：CCAGGTCCAA TTTATTTTTA TTTTCCGAGC GTGGATGGCC CGGGTCCGGT GAGCGGT
b2：ACCGCTCCAA TTCATACCGC TCCAATTCAT CATCATATCC CACGCCATATGATGACCGCT CACC
b3：ATGAATTGGA GCGGTATGAA TTGGAGCGGT CCGGGTCCGG GCCCGTGCCCGACCGATTGC TTTCGTAAAC ATCCG
b4：ATCAATCACGC TATCAAAATC GCCGGTCGGA CCCGGGCCCG CTTCCGGATGTTTACGAAA
4条扩增系列：
a1-5：AGCGAATTCA TGTTAACTTT ATGCGGCATG AGCACCAACC CG
a4-3：AATTGGACCT GGACCGCTCG AGCATCTCGT AA
b1-5：ATGCTCGAGC GGTCCAGGTC CAATTTA
b4-3：AGCGAATTCT ACTAGTTGCA ATCAATCACG CT
将a1，a2，a3，a4四条序列各2μmol置于一个PCR扩增系统中，包括10×PCR缓冲液5μl，25mMMgcl5μl，dNTP各2.5mM，Taq酶5u，总体积50μl，按下列参数进行PCR：95℃4分钟→(94℃50秒→58℃50秒→72℃50秒)×10个循环→72℃7分钟→4℃。取PCR产物5μl转入含有a1-5和a4-3扩增引物各1μmol的PCR扩增系统中，包括10×PCR缓冲液5μl，25mMMgcl5μl，dNTP各2.5mM，Taq酶5u，总体积50μl，按下列参数进行PCR：94℃3分钟→(94℃50秒→56℃50秒→72℃50秒)×25个循环→72℃7分钟→4℃。经此PCR过程，得到核苷酸片段A。
再利用b1，b2，b3，b4四条序列及b1-5，b4-3两条扩增引物，按上述相同程序，得到核苷酸片段B。
将A片段和B片段经酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，并经XhoI限制性内切酶酶切，再次过柱纯化，乙醇沉淀。将酶切纯化后的A片段和B片段各约0.5μg置于连接系统中，其包含10×连接酶缓冲液1.5μl，ATP1nM，T4DNA连接酶5u，总体积15μl，16℃连接4小时，取连接产物1μl，转入PCR扩增系统，其中包含扩增引物a1-5和b4-3各1μg，10×PCR缓冲液5μl，25nMMgcl5μl，dNTP各2.5mM，Taq酶5u，总体积50μl，按下列参数进行PCR：95℃3分钟→(94℃50秒→56℃50秒→72℃50秒)×30个循环→72℃7分钟→4℃。经2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到427bp的目的基因片段。
②建立表达系统：按上述方法制备目的基因片段约3μg，经EcoRI酶切柱纯化后，与经EcoRI酶切完全，并经碱性磷酸酶处理及纯化的pBV220载体0.1μg共同置于连接系统中，其包含10×连接酶缓冲液1.5μl，ATP1nM，T4DNA连接酶5u，总体积15μl，16℃连接16小时，取连接产物5μl与感受态的DH5α大肠杆菌50μl在冰浴条件下混合，冰浴45分钟，42℃热休克1.5分钟，加LB培养液150μl，37℃1小时，涂布于氨苄青霉素LB平皿上，37℃过夜，得到重组菌落，经酶切测序，最终确定pBV-HBV2
③有效产物的表达：
上述重组菌株活化后，按1∶500比例转入LB培养液中，30℃，180转/分钟振摇过夜，迅速将培养基温度升至42℃，200转/分钟振摇5小时，取样利用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。
④表达产物的纯化：
将上述制备好的表达菌液离心沉淀(5000rpm，30分钟)，弃上清，加入原培养液体积1/25的PBS悬浮，超声(400W，超声时间为10秒，间隔5秒，共30次)破碎菌体，破碎后的菌体经10000rpm，30分钟离心，弃沉淀，上清经过30％饱和硫酸铵沉淀，根据SDS-PAGE分析确定后再次溶于PBS中。过SephadexG25脱盐柱，所得目的蛋白经SDS-PAGE分析，再次通过SP离子交换柱吸附，以0.05～0.5MNacl洗脱，在0.1M洗脱时得到目的蛋白，再经过一次排阻层析得到纯度为95％目的蛋白。
⑤多肽免疫原的制备：
将上述纯化的HCV多表位抗原复合体多肽经紫外分光光度计测定其有效蛋白浓度，按实际浓度制备为5μg，10μg，20μg/100μl浓度溶液，加甲醛至1mg/ml，37℃1小时，加Al(OH)3至0.5mg/ml，室温振摇3小时，即可用于实验动物免疫。
动物实验例
1.HCV多表位抗原复合体多肽的免疫原型及抗原特性。
以HCV多表位抗原复合体多肽免疫小鼠3次后可检测到特异性抗体，实验分析表明，该复合体多肽可以在动物体内诱导HCV抗体的产生，经ELISA检测后抗体滴度见表1。并在此基础上，摸索了多种佐剂、不同剂量的免疫效果，详见表2。
表1、完全福氏佐剂与HCV多表位抗原复合体多肽免疫小鼠3次后血清抗体滴度
| 组别 | n | 抗体滴度 |
| 实验组对照组 | 1010 | 1∶40- |
表2.不同佐剂处理，以及不同剂量的HCV多表位抗原复合体多肽免疫小鼠3次后血清抗体滴度
| 组别 | Al(OH)3+甲醛(μg) | Al(OH)3(μg) | 完全福氏佐剂(μg) | 对照 | |||||||||
| 5 | 10 | 20 | 30 | 5 | 10 | 20 | 30 | 5 | 10 | 20 | 30 | ||
| 1∶30 | 1∶60 | 1∶30 | 1∶30 | 1∶30 | 1∶30 | 1∶30 | 1∶30 | 1∶30 | 1∶60 | 1∶30 | 1∶30 | - | |
从以上结果可以看出，我们合成并表达的HCV多表位抗原复合体多肽在适当剂量时可有效地诱导小鼠的体液免疫反应，产生特异性抗体，具有良好的免疫原性。
2.HCV多表位抗原复合体多肽免疫小鼠后的生化指标检测。
经HCV多表位抗原复合体多肽与甲醛+Al(OH)3佐剂组免疫的小鼠，以常规方法对其血清内谷丙转氨酶水平进行检测，结果见表3，显示与空白对照组没有显著差异，且均在正常值范围内。
表3、HCV多表位抗原复合体多肽与甲醛+Al(OH)3佐剂免疫小鼠后谷丙转氨酶水平
| 组别 | 对照组 | Al(OH)3+甲醛佐剂组 |
| 谷丙转氨酶水平(U/L) | 21 | 19 |
测定结果1
基因构建及表达载体构建结果：
经HCV多表位抗原复合体多肽基因的PCR构建和重组加入pBV220表达载体的构建过程和相应的鉴定。得到了HCV多表位抗原复合体多肽的表达质粒pBV-HVB2，其基因测序结果如图-4，符合本发明的设计序列。
测定结果2 pBV-HCB2的表达及表达产物在菌体中的分布
经热诱导表达的HCV多表位抗原复合体多肽在SDS-PAGE胶电泳结果(见图4(A)证实，该复合体多肽已在大肠杆菌DH5a菌体中得到有效表达；对表达菌经超声破碎后的沉淀及上清的分析表明，该产物主要分布在细菌裂解液的上清之中。
测定结果3 HCV多表位抗原复合体多肽的理化特性分析
该表位抗原复合体多肽由131个氨基酸组成，分子量为13.8KD，等电点(p1)为8.3。在磷酸盐缓冲液中较稳定不易降解。
测定结果4HCV多表位抗原复合体多肽的免疫原型及抗原特性。
免疫学分析实验表明，该复合体多肽可以在动物体内诱导HCV抗体的产生，其抗体滴度见表4。
表4.
| AL(OH)3佐剂组 | 福氏佐剂组 | 无佐剂组 | |
| 抗体滴度 | 1∶40 | 1∶40 | 1∶2 |
Claims (4)
1.一种丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗，其特征在于：
①每一个可以引起动物产生有效免疫反应的剂量包含下列成分：丙型肝炎多表位抗原复合体多肽20μg，甲醛≤1mg，Al(OH)3≤0.5mg，0.01M磷酸缓冲盐溶液0.5ml；其中所述的丙型肝炎多表位抗原复合体多肽由142个氨基酸组成，分子量为13.8KD，等电点为8.3；丙型肝炎多表位抗原复合体多肽基因的大小为439bp；
②基因序列描述为：
ATGTTAACTT TATGCGGCAT GAGCACCAAC CCGAAACCGC AGCGTAAAAC 50
TACAATTGAA ATACGCCGTA CTCGTGGTTG GGCTTTGGCG TCGCATTTTG
CAAACGCAAC ACCAATCGTC GTCCACAAGA TGGCCCAGGT CCGGGTTTTG 100
GTTTGCGTTG TGGTTAGCAG CAGGTGTTCT ACCGGGTCCA GGCCCAAAAC
CGGATCTGAT GGGTTATATT CCATTAGTTG GCGCCCCATT AGGTCCAGGT 150
GCCTAGACTA CCCAATATAA GGTAATCAAC CGCGGGGTAA TCCAGGTCCA
CCAGTTTATT TACTGCCGCG TTATCCACGT GGTCCGGGTC CGGAACTGAT 200
GGTCAAATAA ATGACGGCGC AATAGGTGCA CCAGGCCCAG GCCTTGACTA
TACGAGATGC TCGAGCGGTC CAGGTCCAAT TTATTTTTAT TTTCCGAGCG 250
ATGCTCTACG AGCTCGCCAG GTCCAGGTTA AATAAAAATA AAAGGCTCGC
TGGATGGCCC GGGTCCGGTG AGCGGTCATC GTATGGCGTG GGATATGATG 300
ACCTACCGGG CCCAGGCCAC TCGCCAGTAG CATACCGCAC CCTATACTAC
ATGAATTGGA GCGGTATGAA TTGGAGCGGT CCGGGTCCGG GCCCGTGCCC 350
TACTTAACCT CGCCATACTT AACCTCGCCA GGCCCAGGCC CGGGCACGGG
GACCGATTGC TTTCGTAAAC ATCCGGAAGC GGGCCCGGGT CCGACCGGCG 400
CTGGCTAACG AAAGCATTTG TAGGCCTTCG CCCGGGCCCA GGCTGGCCGC
ATTTTGATAG CGTGATTGAT TGCAACTAG 450
TAAAACTATC GCACTAACTA ACGTTGATC
③蛋白序列描述
MLTLCGMSTN PKPQRKTKRN TNRRPQDGPG PGFADLMGYI PLVGAPLGPG PVYLLPRYPR
GPGPELITRC SSGPGPIYFY FPSVDGPGPV SGHRMAWDMM MNWSGMNWSG PGPGPCPTDC
FRKHPEAGPG PTGDFDSWID GN。
2.一种权利要求1所述的丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗的制备方法，采用以下步骤：
(1)基因设计：选取了7个抗原表位进行了基因工程技术的改造，这7个抗原表位分别是：
C1-20：MSTNPKPQRKTKRNTWRRPQD
C129-144：GFADLMGYIPLVGAPL
C34-42：VYLLPRYPR
E1 315-327：VSGHRMAWDMMMNWSGMNWSGP
E2 581-592：CPTDCFRKHPEA
NS5 2781-2788：ELITRCSS
NS3 1445-1455：TGDFDSVIDGN
(2)丙型肝炎多表位抗原复合体多肽在技术上的有效表达：使用国内基因工程产品使用的载体pBV220，并根据相应的预实验，确定了抗HCV的复合体多肽基因的接头方式，PLPR启动子与起始密码子ATG距离为4个碱基，同时也确定了重组表达菌的热诱导表达方案为30℃180转/分振荡培养8小时以活化菌体，然后增温至42℃进行热诱导，继续培养5小时；表达系统的宿主系统为大肠杆菌DH5a株；
(3)丙型肝炎多表位抗原复合体多肽表达产物的分离纯化：
①2×YT培养基30℃培养细菌过夜，42℃诱导培养4小时后，将培物4000rpm离心10分钟得到菌体；②PBS缓冲液悬浮后400W超声破碎包涵体，12000rpm离心15分钟去除沉淀得到上清；③将上清SephadexG25脱盐、离子交换和排阻层析，得到初步纯化的产品；
(4)多肽疫苗的制备：
将上述纯化的HCV多表位抗原复合体多肽经紫外分光光度计测定其有效蛋白浓度，按实际浓度制备为5μg，10μg，20μg/100μl浓度溶液，加甲醛至1mg/ml，37℃1小时，加Al(OH)3至0.5mg/ml，室温振摇3小时，然后用0.01M磷酸缓冲盐溶液0.5ml稀释，得到试验性疫苗。
3.权利要求1所述的丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗作为制备用于人群预防丙型肝炎药剂的应用。
4.权利要求1所述的丙型肝炎多表位抗原复合体多肽疫苗作为制备用于人群检测丙型肝炎材料的应用。
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