CN121240887A - 通过聚合物囊泡进行靶向递送的方法和组合物 - Google Patents

通过聚合物囊泡进行靶向递送的方法和组合物

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李政欣
翁启惠
范辰佑
王仕文
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Abstract

本公开涉及一种用于将生物分子靶向递送到活生物体的共聚物和聚合物囊泡。示范性共聚物包含引发剂嵌段、增长剂嵌段和连接所述引发剂嵌段和所述增长剂嵌段的键联。所述引发剂嵌段包含被配置用于提供靶向递送的聚糖头，并且所述增长剂嵌段包含被配置用于为所述聚合物囊泡提供所需特性的官能性部分。

Description

通过聚合物囊泡进行靶向递送的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求于2023年4月8日提出的美国临时专利申请第63/458,102号、于2023年10月2日提出的美国临时专利申请第63/587,231号和于2024年4月5日提出的美国临时专利申请第63/575,056号的优先权，前述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开大体上涉及与聚合物纳米载体相关的组合物和方法，特定地说，包含聚合物囊泡的药物制剂，所述聚合物囊泡能够将有效负载选择性/靶向递送到组织中的所需靶区域或递送到细胞。
背景技术
通过纳米技术的递送已经广泛用于科学、工业和临床应用中。它已经成为一种有前景的药物递送方式，提供了包括改进药物分子的溶解度和渗透性的优点。在一最新实例中，考虑到mRNA分子通常不稳定并且需要在低温(例如-70℃)下存储，针对COVID-19病毒研发的mRNA疫苗使用一种特殊的脂质纳米粒子(lipid nanoparticle；LNP)，所述脂质纳米粒子适于包封和稳定mRNA分子。典型的脂质纳米粒子通常由数种类型的脂质构成。那些脂质的比率需要微调，且脂质纳米粒子的制造成本可能较高，并且脂质纳米粒子通常无法选择性地递送mRNA分子。因此，在所述领域中需要具有更简单的构造和选择性递送能力的纳米粒子。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种用于形成聚合物囊泡的共聚物。所述共聚物包含：引发剂嵌段，其包含聚糖头；和增长剂嵌段，其进一步包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；和键联，其共价连接引发剂嵌段和增长剂嵌段，其中键联包含二硫键。
在一个方面，本公开提供了一种聚合物囊泡。所述聚合物囊泡包含界定内部空间的膜，其中膜包含本公开的示范性共聚物。
在一个方面，本公开提供了一种药物制剂，其包含本公开的聚合物囊泡。
在一个方面，本公开提供了一种用于制备聚合物囊泡的试剂盒。所述试剂盒包含第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包含引发剂，其中引发剂包含聚糖头和引发剂连接部分，所述第二试剂包含增长剂，其中增长剂包含官能性部分和增长剂连接部分，其中官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；并且其中引发剂连接部分被配置成经由包含二硫键的键联与增长剂连接部分偶合。
在一个方面，本公开提供了一种用于在个体中靶向递送有效负载的方法。所述方法包含向个体施用有效量的包含聚合物囊泡的药物制剂，其中聚合物囊泡包含包封有效负载的膜，并且其中膜包含本公开的共聚物。
在一个方面，本公开提供了一种预防或治疗个体中的疾病的方法，其包含向个体施用有效量的包含聚合物囊泡的药物制剂，其中聚合物囊泡包含膜，其中膜包含权利要求1至34中任一项的聚合物组分；和包封于膜内的有效负载；并且其中有效负载为治疗剂或衍生治疗剂。
在一个方面，本公开提供了一种增强适应性免疫反应的方法，其包含向个体施用有效量的包含聚合物囊泡的药物制剂，其中聚合物囊泡包含包封有效负载的膜，并且其中膜包含本公开的共聚物，其中有效负载为免疫原性的或衍生免疫原性生物分子。
附图说明
图1A表示说明本公开的示范性共聚物的示范性合成的示意图。X和Y均为整数并且独立地为9至14。
图1B绘示根据本公开的一些实施例的包含共聚物的一些示范性聚合物囊泡的结构。
图2A展示琼脂糖凝胶电泳测定的结果，其展示根据本公开的一些实施例的数种示范性共聚物的包封效率。这一功效验证测定中的有效负载为约920bp的GFP mRNA。具有或不具有GFP mRNA的共聚物的尺寸大于10kDa。
图2B提供展示根据本公开的一些工作实施例用包封GFP-mRNA的聚合物囊泡转染之后HEK293细胞的平均荧光强度的图示。
图3A展示琼脂糖凝胶电泳测定的结果，证明根据本公开的一些工作实施例的数种共聚物的包封效率。这一验证测定中的有效负载为具有约2550bp的尺寸的刺突mRNA。具有或不具有刺突mRNA的示范性共聚物的尺寸大于10kDa。每个实验组的N/P比(带正电的聚合物胺基团(N＝氮)与带负电的核酸磷酸酯(P)基团)由每个泳道处指示的数字展示。这一实验中测试的N/P比为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和20。
图3B提供展示mRNA-PNP(P1/P5)的粒径和ζ(zeta)电位的带有CryoEM图像和插图的图示。
图3C展示证明HEK293T细胞中由刺突mRNA-PNP(I1-P1/P5)介导的刺突蛋白表达的化学发光图像。第一泳道展示来自经刺突mRNA转染的细胞的蛋白质表达，并且第二泳道展示来自经刺突mRNA-PNP(I1-P1/P5)转染的细胞的蛋白质表达。在这一实验中，使用β-肌动蛋白作为基准表达。
图4提供使用共焦荧光成像在四个小时内研究的细胞中溶酶体和mRNA-PNP共定位的图示。分别在1、1.5、2、2.5、3、3.5和4小时收集图像。mRNA-PNP经FITC标记以用于检测。
图5提供展示在一小时后用靶向Siglec-2的刺突mRNA-PNP(I1-P1/P4-FITC/P5)或刺突mRNA-PNP(I2-P1/P4-FITC/P5)处理的BMDC、B细胞和T细胞的细胞摄取荧光信号的图示。使用流式细胞术分析收集数据。
图6提供展示在一小时后用靶向DC-SIGN的刺突mRNA-PNP(I1-P1/P4-FITC/P5)或刺突mRNA-PNP(I5-P1/P4-FITC/P5)处理的BMDC、B细胞和T细胞的细胞摄取荧光信号的图示。使用流式细胞术分析收集数据。
图7提供展示在pH 7.4下DC-SIGN、MMR、MINCLE、凝集素-2(Dectin-2)和兰格素(Langerin)(0.625μg/mL)与根据本公开的一些实施例的聚合物囊泡的结合分析的图示。
图8A展示说明动物免疫接种实验的设计的示意图。
图8B提供展示在免疫接种之后第28天所测量的通过免疫接种I1-P1/P5mRNA-PNP、I9-P1/P5 mRNA-PNP和LNP-mRNA(对照)诱导的血清刺突特异性IgG滴度的图示。
图8C提供展示在免疫接种之后第28天所测量的通过免疫接种I1-P1/P5mRNA-PNP、I9-P1/P5 mRNA-PNP和LNP-mRNA(对照)的中和滴度(ID50)的图示。中和滴度计算为在减去背景RLU之后，与病毒对照孔相比，引起RLU减少50％的血清稀释度的倒数。ID50值用平均值的标准误差标记在图上。
图9为展示本公开的聚合物囊泡(在处理之后0小时和1小时)和不含靶向聚糖的聚合物囊泡(在处理之后1小时)的C2C12肌肉细胞摄取的FACS数据的图示。
具体实施方式
通过纳米粒子的递送已经广泛用于各种应用中。除了可认为是最常见类型的纳米粒子的脂质纳米粒子(LNP)之外，另一类型的纳米粒子聚合物囊泡也在工业和临床应用中获得了愈来愈多的关注。聚合物囊泡(即，基于聚合物的纳米粒子、聚合物小泡或聚合物纳米粒子(polymer nanoparticle，PNP))为由两亲性嵌段共聚物自组装而成的外壳。这些两亲性嵌段共聚物为包含至少一个疏水性聚合物嵌段和至少一个亲水性聚合物嵌段的大分子。当水合时，这些两亲性嵌段共聚物自组装成外壳，使得疏水性嵌段倾向于彼此结合以最小化直接暴露于水并且形成外壳的内表面，且亲水性嵌段面向外，形成外壳的外表面。这些水溶性聚合物囊泡的疏水性核心可提供溶解额外疏水性分子的环境。因此，这些水溶性聚合物囊泡可充当包封于聚合物囊泡内的疏水性分子的载体聚合物。此外，两亲性嵌段聚合物的自组装发生在不存在稳定剂的情况下，否则稳定剂将提供胶体稳定性并防止聚集。
聚合物囊泡提供了许多优点，例如存储稳定性高、制造更容易、方便的表面修饰、生物相容性高和可控的释放机制。然而，工业仍缺乏将药物分子有效递送到生物体的特定区域的聚合物囊泡。这可能是因为常规的聚合物囊泡并不有效地包封有效负载(例如为了达到治疗效果而施用的生物分子)并通常在血清中不稳定。此外，常规的聚合物囊泡也不能够进行选择性递送。
聚合物囊泡
因此，本公开的一个方面提供一种聚合物囊泡。本公开的聚合物囊泡被设计用于提供选择性递送(或靶向递送)和良好包封效率，尤其对于核酸型有效负载。示范性聚合物囊泡包含膜，所述膜界定被配置成包封或携带有效负载的内部空间。本公开的聚合物囊泡的膜包含共聚物，所述共聚物包含引发剂嵌段、增长剂嵌段和键联，其中键联共价连接引发剂嵌段和增长剂嵌段并且键联包含二硫键。引发剂嵌段包含聚糖头，并且增长剂嵌段包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合。
在不希望受理论束缚的情况下，选择键联的二硫键(即，二硫键联)是因为其在细胞内环境中的生物可降解特性和/或硫醇介导的摄取。因此，二硫键可促进本公开的聚合物囊泡的摄取以及其在摄取之后的降解，以经由例如细胞内谷胱甘肽介导的裂解释放所包封的有效负载。
在一些实施例中，共聚物可包含超过一个引发剂嵌段和超过一个增长剂嵌段。举例来说，共聚物可包含一个引发剂嵌段、第一增长剂嵌段和第二增长剂嵌段，其中引发剂嵌段和第一增长剂嵌段以及第一增长剂嵌段和第二增长剂嵌段均经由键联连接。
引发剂嵌段
在某些实施例中，引发剂嵌段包含被配置用于提供选择性递送的聚糖头。为此，聚糖头可能具有作为靶标(例如靶细胞上的受体)配体的靶向部分。在一些实施例中，靶向部分可为聚糖头的末端部分，以获得更佳的机会相互作用并结合靶标。然而，本公开不限于所述配置。在一些实施例中，用于选择性递送的靶细胞为抗原呈递细胞(APC，例如树突细胞)。在一些实施例中，靶细胞可为其它类型的免疫细胞。在又一些其它实施例中，靶标可为设计有效负载与其相互作用的任何生物细胞。
在某些实施例中，引发剂嵌段被配置成在一定程度的亲和力下结合至凝集素受体，例如Siglec-1(唾液酸粘附素)、Siglec-2、Siglec-5/E和DC-SIGN，借此展现出特定类型的APC更佳的摄取。在一些实施例中，引发剂嵌段的聚糖头包含甘露糖苷酶，其可以是被配置成结合树突细胞上的DC-SIGN的末端甘露糖。在一些实施例中，聚糖头包含唾液酸苷(sialoside)。在一些实施例中，为了靶向Siglec-1，聚糖头可包含9-N-(4H-噻吩并[3,2-c]色烯-2-氨甲酰基)-Neu5Ac-α2,3-Gal-GlcNAc。在一些实施例中，为了靶向Siglec-2，聚糖头可包含9-联苯Neu5Ac-α2,6-Gal。在一些实施例中，为了靶向Siglec-5/E，聚糖头可包含Neu5Ac-α2,3-Gal-GlcNAc。
在酸性条件下结合。在一些实施例中，引发剂嵌段与靶标之间的结合是Ca2+相关的，并且钙配位可能在低pH环境下降低，导致较低的结合亲和力。因此，为了在酸性条件下提供更佳的结合亲和力，引发剂嵌段的聚糖头可包含芳基。在不希望受任何理论束缚的情况下，芳基可参与CH-π和疏水性相互作用，从而增强酸性条件下的结合。芳基可为未经取代的苯或经卤化物或烷基卤化物(例如CF3)取代的苯。在一些实施例中，芳基与靶向部分偶合。举例来说，引发剂嵌段的聚糖头可包含O-芳基甘露糖苷。
聚糖头的结构配置。在某些实施例中，聚糖头可为线性结构或分支结构。在一些实施例中，聚糖头可能具有多个靶向部分，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶向部分。多个靶向部分可以线性、分支或星形配置排列。举例来说，引发剂嵌段的聚糖头可包含单甘露糖苷、二甘露糖苷或三甘露糖苷，并且当聚糖头包含三甘露糖苷时，三甘露糖苷可为线性形式或分支结构，例如α-1,3-α-1,6-三甘露糖苷。在某些实施例中，注意到在一些情况下，分支配置(例如三甘露糖苷聚糖头)展示出对其靶受体的优越结合亲和力。
引发剂间隔基。在一些实施例中，引发剂嵌段进一步包含引发剂间隔基。引发剂间隔基被配置用于向聚糖头提供结构柔性和/或向整个共聚物提供疏水性以促进聚合物囊泡的组装。在不希望受理论束缚的情况下，柔性允许聚糖头在引发剂嵌段与靶标之间的相互作用期间移动，借此促进其间的结合。
优选的间隔基是生物相容的。在一些实施例中，引发剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。举例来说，间隔基可为聚乙二醇(PEG)部分，其由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、24、30、36、40、48、50、55、60、65或72个(OCH2CH2)亚基，或由前述端点限定的任何范围，例如2至72、2至60、2至48、2至36、2至24、2至18、2至15、2至10、4至72、4至60、4至48、4至36、4至24、4至18、4至15、4至10、8至72、8至60、8至48、8至36、8至24、8至18、8至15或8至10个(OCH2CH2)亚基形成。在一些实施例中，PEG部分可为线性、分支或星形结构。
在一些实施例中，间隔基为饱和碳部分，其可为连接到聚糖头的脂质尾部。在一些实施例中，饱和碳水化合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳，或由前述端点限定的任何范围的碳，例如2至15、2至12、2至10、2至8、2至6、2至4、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9或6至8个碳。
结合亲和力。在一些实施例中，引发剂嵌段的聚糖头与靶标之间的结合亲和力可由解离常数(KD)定义。在一些实施例中，pH 7.4下的KD可为5、10、15、20、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750、5000、5250、5500、5750、6000、6250、6500、6750、7000、7250、7500、7750或8000nM，或由前述端点限定的任何范围，例如5至8000、5至7000、5至6000、5至5000、5至4000、5至3000、5至2500、5至2000、5至1500、5至1250、5至1000、5至900、5至800、5至700、5至600、5至500、5至400、5至300、5至200、5至150、5至100、5至75、5至50、5至30、5至20、10至8000、10至7000、10至6000、10至5000、10至4000、10至3000、10至2500、10至2000、10至1500、10至1250、10至1000、10至900、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至150、10至100、10至75、10至50、10至30或10至20nM。
在一些其它实施例中，pH 5下的KD可为1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1250、1500、1750或2000nM，或由前述端点限定的任何范围，例如1至2000、1至1500、1至1000、1至900、1至800、1至750、1至700、1至650、1至600、1至550、1至500、1至450、1至400、1至350、1至300、1至250、1至200、1至150、1至100、1至75、1至50、1至40、1至30、1至20、1至10或至5、5至2000、5至1500、5至1000、5至900、5至800、5至750、5至700、5至650、5至600、5至550、5至500、5至450、5至400、5至350、5至300、5至250、5至200、5至150、5至100、5至75、5至50、5至40、5至30、5至20、5至10nM。
实例。在一些实施例中，引发剂嵌段的聚糖头包含9BPCNeu5Ac缀合的N-聚糖头(例如IB2)、Neu5Ac缀合的N-聚糖(例如IB3)、9TCCNeu5Ac缀合的N-聚糖(例如IB4)或其组合。在某些实施例中，聚糖头包含以下结构中的至少一者(请注意，“IB”表示引发剂嵌段，其描述在本公开的共聚物中缀合的引发剂。然而，为了简明描述，“IB”可与表示引发剂的“I”互换使用)：
其中实心圆表示甘露糖苷，空心圆表示半乳糖，实心正方形表示GlcNAc，并且菱形表示Neu5Ac。
增长剂嵌段
在某些实施例中，本公开的示范性聚合物囊泡展现所需特性，例如有效的有效负载包封、减少的血清蛋白吸附、增强的膜融合以及摄取之后有效的有效负载释放。本公开的增长剂嵌段提供至少一种所需特性。为此，本公开的增长剂嵌段包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合。
在一些实施例中，本公开的共聚物包含提供至少一种所需特性的单个增长剂嵌段。在一些实施例中，本公开的共聚物包含各提供至少一种所需特性的多个增长剂嵌段。
有效的有效负载包封。在一些实施例中，本公开的聚合物囊泡被设计用于携带核酸型有效负载，例如mRNA分子或DNA分子。在这类实施例中，聚合物囊泡的共聚物的增长剂嵌段可包含胍基。在一些实施例中，增长剂嵌段包含1、2、3、4、5个或更多个胍基。在不希望受理论束缚的情况下，增长剂嵌段中的多个胍基在共聚物的胍盐基团与核酸分子(例如mRNA)的磷酸酯基团之间提供更强的盐桥。在某些实施例中，增长剂嵌段包含三个胍基。
减少的血清蛋白吸附和增强的膜融合。如上文所提及，聚合物囊泡的常见缺点之一是，由于血清蛋白吸附，所以其在血清中不稳定。为了减少血清蛋白吸附以增强血清稳定性，本公开的共聚物可包含两性离子，它还增强聚合物囊泡的膜与靶细胞的融合。本公开的两性离子可以是通过在pH 4.5至7.5下携带相同数目的带正电和带负电的官能团而具有总体零电荷的分子/部分。在一些实施例中，本公开的两性离子包含pH 4.5与7.5之间的等电点。两性离子可为(但不限于)磷酸胆碱(CP)、磺基噻丁(sulfothetin)、磺酸鏻或裸盖菇素(psilocybin)。在一些实施例中，本公开的两性离子包含烷基磷酸甜菜碱基团，所述烷基磷酸甜菜碱基团包含分别提供负电荷和正电荷的磷酸酯基团和胺基团。
摄取之后有效的有效负载释放。聚合物囊泡的另一所需特性为在摄取之后有效地释放所包覆/包封的有效负载的能力。释放所包覆/包封的有效负载发生在靶细胞的溶酶体中，这是从内体/溶酶体通路中逃逸或聚合物囊泡的降解所导致的。在一些实施例中，增长剂嵌段的两性离子可促进内体逃逸。然而，在一些实施例中，增长剂嵌段可进一步包含烷基链，其也有助于内体逃逸。
另一方面，在一些实施例中，为了促进溶酶体降解，本公开的增长剂嵌段可包含二亚乙基-三胺部分。二亚乙基-三胺部分的末端胺残基还可用于额外的官能化。或者，本公开的增长剂嵌段可包含乙二胺、1-(2-氨基乙基)哌嗪和/或三(2-氨基乙基)胺。
增长剂间隔基。在一些实施例中，本公开的增长剂嵌段包含增长剂间隔基，所述增长剂间隔基主要被配置用于向共聚物提供组装成聚合物囊泡所需的疏水性。在一些实施例中，增长剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
在一些实施例中，间隔基可为聚乙二醇(PEG)部分，其由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、24、30、36、40、48、50、55、60、65或72个(OCH2CH2)亚基，或由前述端点限定的任何范围，例如2至72、2至60、2至48、2至36、2至24、2至18、2至15、2至10、4至72、4至60、4至48、4至36、4至24、4至18、4至15、4至10、8至72、8至60、8至48、8至36、8至24、8至18、8至15或8至10个(OCH2CH2)亚基形成。在一些实施例中，PEG部分可为线性、分支或星形结构。
在一些实施例中，饱和碳部分可为从增长剂嵌段延伸的脂质尾部。在一些实施例中，饱和碳水化合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳，或由前述端点限定的任何范围的碳，例如2至15、2至12、2至10、2至8、2至6、2至4、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9或6至8个碳。在某些实施例中，增长剂间隔基包含单羧酸酰胺部分(例如硫辛酰胺部分)或其它生物相容性结构，其提供饱和碳水化合物和用于缀合的官能团。
实例。在一些实施例中，本公开的增长剂嵌段包含以下结构中的至少一者(请注意，“PB”表示增长剂嵌段，其描述在本公开的共聚物中缀合的增长剂。然而，为了简明描述，“PB”可与表示增长剂的“P”互换使用。)：
共聚物增长剂嵌段。在一些实施例中，共聚物包含多个增长剂嵌段和多个键联，其中多个增长剂嵌段中的每个增长剂嵌段经由多个键联中的一者连接到多个增长剂嵌段中的至少另一个增长剂嵌段或引发剂嵌段。在不希望受理论束缚的情况下，本公开预期在共聚物的结构中具有两种或更多种增长剂是有益的。两种或更多种增长剂中的每一者可提供以下所需特性中的至少一者：有效的有效负载包封、减少的血清蛋白吸附、增强的膜融合以及摄取之后有效的有效负载释放。在一些实施例中，两种或更多种增长剂中的每一者在结构和/或其提供的所需特性方面不同，借此形成呈杂共聚物形式的共聚物。
在一些实施例中，杂共聚物包含任何两个或更多个增长剂嵌段PB1、PB2、PB3、PB4和PB5。在一些实施例中，共聚物包含至少两个增长剂嵌段，所述至少两个增长剂嵌段为(1)PB1和PB5，(2)PB1和PB4，(3)PB2和PB5，(4)PB2和PB5，或(5)PB1、PB4和PB5，其中共聚物中的两种或更多种增长剂可通过用符号“/”分隔的两种或更多种增长剂的式编号来表示。举例来说，共聚物中的两个增长剂嵌段PB1和PB5可表示为PB1/PB5。然而，所提及的共聚物中增长剂嵌段的顺序和量不受其命名方式的限制。在不希望受理论束缚的情况下，本公开发现PB1/PB4、PB2/PB4、PB1/PB5和PB2/PB5的共聚物由于有效的膜融合和有效负载释放而展现优越的细胞内递送。
在某些实施例中，具有两种或更多种不同类型的增长剂嵌段的杂共聚物可与I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9和I10中的任何引发剂进行配置。引发剂和增长剂的缀合可通过用连字符符号“-”分隔的引发剂和增长剂的式编号来表示。举例来说，包含引发剂I5和增长剂P5的共聚物可表示为I5-P5。然而，所提及的共聚物中引发剂嵌段和/或增长剂嵌段的顺序和量不受其命名方式的限制。在一些实施例中，具有与本公开的一种引发剂缀合的两种或更多种不同类型的增长剂的杂共聚物的共聚物可选自由以下组成的群组：I5-P1/P5、I5-P1/P4、I5-P2/P5、I5-P2/P4、I5-P1/P4/P5、I6-P1/P5、I6-P1/P4、I6-P2/P5、I6-P2/P4、I6-P1/P4/P5、I7-P1/P5、I7-P1/P4、I7-P2/P5、I7-P2/P4、I7-P1/P4/P5、I8-P1/P5、I8-P1/P4、I8-P2/P5、I8-P2/P4、I8-P1/P4/P5、I9-P1/P5、I9-P1/P4、I9-P2/P5、I9-P2/P4、I9-P1/P4/P5、I10-P1/P5、I10-P1/P4、I10-P2/P5、I10-P2/P4和I10-P1/P4/P5。
在一些实施例中，杂共聚物包含多个第一增长剂嵌段和多个第二增长剂嵌段。在某些实施例中，第一增长剂嵌段的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多，或由前述端点限定的任何范围，例如1至20、1至18、1至16、1至14、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4、3至20、3至18、3至16、3至14、3至12、3至10、3至8、3至6、3至4、6至20、6至18、6至16、6至14、6至12、6至10、6至8、9至20、9至18、9至16、9至14、9至12、12至20、12至18、12至16。在某些实施例中，第二增长剂嵌段的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多，或由前述端点限定的任何范围，例如1至20、1至18、1至16、1至14、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4、3至20、3至18、3至16、3至14、3至12、3至10、3至8、3至6、3至4、6至20、6至18、6至16、6至14、6至12、6至10、6至8、9至20、9至18、9至16、9至14、9至12、12至20、12至18、12至16。在一些实施例中，可使用质谱分析确定第一增长剂嵌段的数目和/或第二增长剂嵌段的数目，但不限于此。
包含本公开的共聚物的聚合物囊泡
本公开的聚合物囊泡包含膜，所述膜包含本公开的共聚物。在一些实施例中，膜包含复数种本公开的共聚物，其组装成膜，其中增长剂嵌段经由疏水性相互作用彼此偶合。聚合物囊泡的每种共聚物的引发剂嵌段从膜延伸并暴露于周围环境。
在一些实施例中，本公开的共聚物占聚合物囊泡的膜的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或由前述端点限定的任何范围，例如50％至99％、50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、50％至65％、50％至60％、60％至99％、60％至95％、60％至90％、60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、70％至99％、70％至95％、70％至90％、70％至85％、70％至80％、50％至75％、80％至99％、80％至95％、80％至90％、80％至85％、90％至99％或90％至95％。
在一些实施例中，膜包含至少两种不同类型的本公开的共聚物。在某些实施例中，膜包含有包含至少两种不同类型的本公开的增长剂嵌段的共聚物。举例来说，膜包含有包含第一增长剂嵌段和第二增长剂嵌段的共聚物，其中第一增长剂嵌段和第二增长剂嵌段在膜中的分子比为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、15、20或25，或由前述端点限定的任何范围，例如1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2.5、1至2、1至1.5、2至25、2至20、2至15、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、2至3或2至2.5。
在一些实施例中，本公开的聚合物囊泡可为树突细胞靶向疫苗(dendritic celltargeting vaccine；DCTV)，其用于将有效负载特异性靶向递送到树突细胞，借此实现和/或改进疫苗的免疫原性反应。
聚合物囊泡的尺寸。在一些实施例中，本公开的聚合物囊泡的直径为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5微米，或由前述端点限定的任何范围，例如0.001至5、0.001至4、0.001至3、0.001至2、0.001至1、0.001至0.8、0.001至0.6、0.001至0.4、0.001至0.2、0.001至0.1、0.001至0.05、0.001至0.01、0.001至0.005、0.05至5、0.05至4、0.05至3、0.05至2、0.05至1、0.05至0.8、0.05至0.6、0.05至0.4、0.05至0.2、0.05至0.1、0.1至5、0.1至4、0.1至3、0.1至2、0.1至1、0.1至0.8、0.1至0.6、0.1至0.4、0.1至0.2、0.5至5、0.5至4、0.5至3、0.5至2、0.5至1、0.5至0.8、1至5、1至4、1至3或1至2微米。聚合物囊泡的尺寸可通过使用(但不限于)动态光散射(Dynamic Light Scattering；DLS)来测定。在一些实施例中，本公开的聚合物囊泡的多分散指数(polydispersityindex；PDI)为约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1，或由前述端点限定的任何范围，例如0.01至1、0.01至0.9、0.01至0.8、0.01至0.7、0.01至0.6、0.01至0.5、0.01至0.4、0.01至0.3、0.01至0.2、0.01至0.1、0.01至0.05、0.1至1、0.1至0.9、0.1至0.8、0.1至0.7、0.1至0.6、0.1至0.5、0.1至0.4、0.1至0.3或0.1至0.2。
ζ电位和分子量。在不希望受理论束缚的情况下，聚合物囊泡的ζ电位和分子量可能影响聚合物囊泡的细胞摄取。在一些实施例中，本公开的聚合物囊泡包含约-50、-40、-30、-20、-15、-10、-5、0、+5、+10、+15、+20、+30、+40或+50，或由前述端点限定的任何范围，例如-50至+50、-50至+40、-50至+30、-50至+20、-50至+15、-50至+10、-50至+5、-50至-5、-50至-10、-50至-15、-50至-20、-20至+50、-20至+40、-20至+30、-20至+20、-20至+15、-20至+10、-20至+5、-20至-5、-20至-10、-20至-15、-15至+50、-15至+40、-15至+30、-15至+20、-15至+15、-15至+10、-15至+5、-15至-5、-15至-10、+5至+50、+5至+40、+5至+30、+5至+20、+5至+15或+5至+10的ζ电位。在一些实施例中，本公开的聚合物囊泡包含约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50kDa，或由前述端点限定的任何范围，例如1至50kDa、1至40kDa、1至30kDa、1至20kDa、1至15kDa、1至10kDa、1至5kDa、2至50kDa、2至40kDa、2至30kDa、2至20kDa、2至15kDa、2至10kDa、2至5kDa、5至50kDa、5至40kDa、5至30kDa、5至20kDa、5至15kDa、5至10kDa、8至50kDa、8至45kDa、8至40kDa、8至35kDa、8至30kDa、8至25kDa、8至20kDa、8至15kDa、8至10kDa、12至50kDa、12至45kDa、12至35kDa、12至25kDa、12至15kDa、25至50kDa、25至40kDa或25至30kDa的分子量。
有效负载。在一些实施例中，聚合物囊泡的膜界定内部空间，所述内部空间被配置用于包封或携带有效负载。如本文所描述，“包封有效负载”、“包封于内部空间内”或类似描述是指有效负载被聚合物囊泡的膜保持、封闭或包围的情况。有效负载可在内部空间内自由移动或共价或非共价连接到膜。包封可以是实质性的、完整的或部分的，并且不排除部分有效负载可能暴露于聚合物囊泡外部环境的可能性。在部分包封的实施例中，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的有效负载被聚合物囊泡的膜保持、封闭或包围。在一些实施例中，有效负载可为生物分子，例如核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖头或其组合。
在一些实施例中，有效负载为核糖核酸(RNA，例如mRNA)或脱氧核糖核酸(DNA，例如双链DNA或单链DNA)，其在通过使用本公开的聚合物囊泡递送到靶细胞之后可在体内编码多肽或蛋白质。核酸，例如本公开中所用的mRNA分子，可通过体外转录由参考核酸来制备。体外转录可如2014年3月13日提出的PCT专利公开WO2014/152027中所描述进行，所述PCT专利公开以全文引用的方式并入。
在一些实施例中，多肽或蛋白质对于施用聚合物囊泡的生物体具有免疫原性(例如抗原性)。在这类实施例中，本公开的聚合物囊泡用于包封和携带免疫原性蛋白或被配置用于在体内编码免疫原性蛋白的核酸，例如RNA疫苗中的mRNA分子。免疫原性蛋白可为病毒(例如SARS-CoV-2、流行性感冒(流感)、呼吸道合胞病毒(RSV)、EBV、登革热(DENGUE)、VZV、HIV、ZIKA或NIPAH)、细菌或真菌来源的病原体的蛋白。在一些实施例中，免疫原性蛋白可为病毒的刺突蛋白。在某些实施例中，刺突蛋白可以是冠状病毒(CoV)来源(例如SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2)的。在一些实施例中，本文所描述的冠状病毒(CoV)的实例包括(但不限于)α-SARS-CoV2、β-SARS-CoV2、γ-SARS-CoV2、δ-SARS-CoV2、o-SARS-CoV2和其变体。
在一些实施例中，有效负载为核酸，其可为具有被配置用于在体内编码多肽或蛋白质的开放阅读框的多核苷酸。这类多核苷酸可经5'端帽修饰，所述5'端帽是在体外转录反应期间使用以下化学RNA帽类似物生成的：3”-O-Me-m7G(5)ppp(5')G[ARCA帽]、G(5)ppp(5')A、G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')A或m7G(5')ppp(5')G(马萨诸塞州伊普斯威奇的纽英伦生物技术(New England BioLabs,Ipswich,Mass.))。可使用牛痘病毒加帽酶在转录后完成经修饰的多核苷酸的5'-加帽，以生成“Cap 0”结构：m7G(5')ppp(5')G(马萨诸塞州伊普斯威奇的纽英伦生物技术)。可使用牛痘病毒加帽酶和2'-O甲基-转移酶生成Cap 1结构，以生成m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。Cap 2结构可由Cap 1结构生成，随后使用2'-O甲基-转移酶对5'-倒数第三个核苷酸进行2'-O-甲基化。Cap 3结构可由Cap 2结构生成，随后使用2'-O甲基-转移酶对5'-倒数第四个核苷酸进行2'-O-甲基化。酶可衍生自重组来源。在转染到哺乳动物细胞中之后，经修饰的多核苷酸具有12至18小时，或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性。
在一些实施例中，核酸可被修饰。在一些实施例中，核酸可具有数个(超过一个)彼此相同或不同的修饰。在一些实施例中，核酸在特定区域中含有一个、两个或更多个(任选地，不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施例中，相对于未修饰的核酸，经修饰的核酸(例如经修饰的mRNA多核苷酸)在细胞或生物体中展现减少的降解。在一些实施例中，经修饰的核酸可分别在生物体中展现降低的免疫原性(例如降低的先天性反应)。
在一些实施例中，修饰可包含化学修饰。在一些实施例中，修饰可以是天然存在的、非天然存在的或两者。适用于本公开中的一些示范性修饰包括(但不限于)糖、核碱基、核苷间键联(例如连接磷酸酯、磷酸二酯键联或磷酸二酯主链)或其组合的修饰。在一些实施例中，用作本公开的有效负载的核酸(例如RNA)可进行密码子优化。举例来说，核酸可被修饰以增强其G/C含量。核酸的G/C含量可影响其稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的核酸在功能上可能比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的核酸更稳定。举例来说，WO2002/098443公开一种药物组合物，其含有通过翻译区域中的序列修饰而稳定的mRNA。由于遗传密码的简并，修饰通过用促成更高RNA稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子来取代现有密码子起作用。
在一些实施例中，核酸可进一步包含编码信号肽的序列。信号肽可包含三个区域：(1)不同长度的N端区域，其通常包含带正电的氨基酸，(2)疏水性区域，和(3)短的羧基端肽区域。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导到粗糙内质网(ER)膜并启动生长肽链穿过所述膜的运输。信号肽通常不负责成熟蛋白质的最终目的地，但其在本公开中不受限制。信号肽通常通过驻留内质网(ER)的信号肽酶从前体蛋白裂解。其可保持未裂解并且充当膜锚。在一些实施例中，信号肽可被设计成与由有效负载编码的多肽或蛋白质在其C端或N端处融合。
在一些实施例中，有效负载可为用于治疗或预防疾病(例如癌症或感染性疾病)的治疗或预防试剂。举例来说，有效负载可为抗病毒剂，包括(但不限于)利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、硝唑尼特(nitazoxanide)、萘莫司他(nafamostat)、氯喹(chloroquine)、瑞德西韦(remdesivir)(GS-5734)和法匹拉韦(favipiravir)(T-705)、干扰素、阿德福韦(adefovir)、泰诺福韦(tenofovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、溴夫定(brivudin)、西多福韦(cidofovir)、福米韦生(fomivirsen)、膦甲酸(foscarnet)、更昔洛韦(ganciclovir)、金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、扎那米韦(zanamivir)、瑞德西韦(remdesivir)、莫努匹韦(molnupiravir)和奈玛特韦/利托那韦(paxlovid)。在其它实例中，有效负载可为抗癌剂。在某些实施例中，有效负载为被配置用于编码治疗或预防试剂的核酸。
在一些实施例中，包封核酸的聚合物囊泡的N/P比(带正电的胺(N＝氮)基团与带负电的核酸磷酸酯(P)基团)为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50，或由前述端点限定的任何范围(包括或不包括端点)，例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、5至50、5至40、5至30、5至20、5至10、10至50、10至40、10至30、10至20、8至40、8至20、8至12、9至50、9至30或9至15。在另一实施例中，包封mRNA的聚合物囊泡的纳米粒子/mRNA(N/P)比为约10或约20。
在其中聚合物囊泡的有效负载为被配置用于编码靶细胞中的多肽或蛋白质的核酸的一些实施例中，在被靶细胞摄取之后，聚合物囊泡被配置用于在体内编码多肽或蛋白质的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个拷贝，或由前述端点限定的任何范围(包括或不包括端点)，例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、2至50、2至40、2至30、2至20、2至15、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4、5至50、5至40、5至30、5至20、5至15、5至10、5至8、4至50、4至45、4至35、4至25、4至15、4至9、4至6、7至50、7至45、7至35、7至25、7至15或7至9个拷贝。在一些实施例中，在被靶细胞摄取之后，聚合物囊泡被配置成在体内不断且实时地编码多肽或蛋白质，直到核酸(即，有效负载)在体内失活。
组合物/制剂
本公开的一个方面涉及一种组合物(即，制剂)，其包含本公开的聚合物囊泡。组合物的聚合物囊泡可包封有效负载并被配置用于将有效负载递送到生物体的靶区域。有效负载可如本文所描述，包含核酸、化合物、肽、蛋白质、聚糖头或其组合。在一些实施例中，有效负载可为免疫原性蛋白或被配置用于在体内编码免疫原性蛋白的核酸。在一些实施例中，制剂进一步包含药学上可接受的赋形剂、佐剂或其组合。在某些实施例中，组合物为药物组合物或药物制剂。
在一些实施例中，组合物包含0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95％(w/w)的包封或不包封有效负载的本公开的聚合物囊泡，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)0.01％至95％(w/w)、0.01％至90％(w/w)、0.01％至80％(w/w)、0.01％至70％(w/w)、0.01％至60％(w/w)、0.01％至50％(w/w)、0.01％至40％(w/w)、0.01％至30％(w/w)、0.01％至20％(w/w)、0.01％至10％(w/w)、0.01％至5％(w/w)、0.01％至1％(w/w)、0.01％至0.1％(w/w)、0.1％至95％(w/w)、0.1％至90％(w/w)、0.1％至80％(w/w)、0.1％至70％(w/w)、0.1％至60％(w/w)、0.1％至50％(w/w)、0.1％至40％(w/w)、0.1％至30％(w/w)、0.1％至20％(w/w)、0.1％至10％(w/w)、0.1％至5％(w/w)、0.1％至1％(w/w)、1％至95％(w/w)、1％至90％(w/w)、1％至80％(w/w)、1％至70％(w/w)、1％至60％(w/w)、1％至50％(w/w)、1％至40％(w/w)、1％至30％(w/w)、1％至20％(w/w)、1％至10％(w/w)、1％至5％(w/w)、5％至95％(w/w)、5％至90％(w/w)、5％至80％(w/w)、5％至70％(w/w)、5％至60％(w/w)、5％至50％(w/w)、5％至40％(w/w)、5％至30％(w/w)、5％至20％(w/w)或5％至10％(w/w)。组合物的其余百分比可以是如本文所描述的赋形剂。
在一些实施例中，组合物为mRNA疫苗，其中聚合物囊泡包封被配置用于在体内编码免疫原性蛋白的mRNA。免疫原性蛋白可为病毒刺突蛋白或病原体的其它抗原分子。在某些实施例中，本发明的组合物可为COVID-19mRNA疫苗。
如本文所描述的示范性COVID-19mRNA疫苗可基于mRNA技术设计，以去除冠状病毒(例如SARS-CoV-2)刺突蛋白的聚糖屏蔽，从而更佳地暴露刺突蛋白的保守区。与未修饰的mRNA相比，冠状病毒刺突蛋白的mRNA疫苗在受体结合结构域(RBD)或亚基2(S2)结构域中具有糖基化位点的缺失，以暴露高度保守的抗原决定基并引发抗体和CD8 T细胞反应，对α、β、γ、δ、o和各种变体具有更广泛的保护作用。疫苗可为如以全文引用的方式并入本文中的WO2022/221835(其中mRNA包含选自SEQ ID NO 1-52的序列)、WO2022/221837A2(其中mRNA包含选自SEQ ID No 1-21的序列)和US20200046826A1(其中mRNA包含选自SEQ ID No 1-20的序列)中所描述的低糖通用疫苗(Low Sugar Universal Vaccine；LSUV)。
在一些实施例中，本发明的组合物被配置成用于治疗或预防疾病(例如癌症)。在这类实施例中，聚合物囊泡所携带的有效负载可以是治疗试剂、预防试剂或被配置用于在体内编码治疗试剂或预防试剂的核酸。举例来说，组合物可以是个性化癌症疫苗(例如黑色素瘤)、KRAS疫苗(KRAS驱动的)或检查点疫苗(例如PD-1、PDL-1相关的)。
在一些实施例中，本发明的组合物可与另一组合物(例如疫苗或药物)一起施用。另一组合物的实例可为(但不限于)流行性感冒(流感)疫苗、腺病毒疫苗、炭疽疫苗、霍乱疫苗、白喉疫苗、甲型或乙型肝炎疫苗、HPV疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗、天花疫苗、轮状病毒疫苗、结核病疫苗、肺炎球菌疫苗和b型流感嗜血杆菌疫苗。
组合型组合物
在一些实施例中，组合物可为组合型组合物(例如组合型疫苗)，其包含包封第一有效负载的第一聚合物囊泡和包封第二有效负载的第二聚合物囊泡。第一聚合物囊泡和第二聚合物囊泡可呈本文所描述的聚合物囊泡形式，但就其共聚物的结构或特性来说彼此不同。举例来说，其中第一聚合物囊泡和第二聚合物囊泡在尺寸、其形成膜的共聚物、包封于聚合物囊泡内的有效负载或其组合方面不同。
举例来说，第一聚合物囊泡包含被配置用于结合DC-SIGN的聚糖头，而第二聚合物囊泡包含被配置用于结合Siglec-1的聚糖头。在另一实例中，第一聚合物囊泡包含被配置用于靶向抗原呈递细胞的聚糖，而第二聚合物囊泡包含被配置用于靶向癌细胞的聚糖。
在一些实施例中，第一有效负载和第二有效负载彼此不同。举例来说，第一有效负载可为蛋白质或肽，而第二有效负载可为核酸。在某些实施例中，第一有效负载和第二有效负载均可为mRNA分子，但编码不同的蛋白质。举例来说，第一有效负载可为被配置用于编码δ-SARS-CoV2的刺突蛋白的mRNA，而第二有效负载可为被配置用于编码o-SARS-CoV2的刺突蛋白的mRNA。
组合物的额外组分
在一些实施例中，本公开的组合物可进一步包含佐剂和/或非活性物质，例如药学上可接受的赋形剂。在某些实施例中，佐剂可为(但不限于)C34、葡糖-C34、7DW8-5、C17、C23、C30、α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)、铝盐(例如氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸钾铝)、混合铝盐)、角鲨烯、MF59、QS-21、弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)、AS03(GlaxoSmithKline)、MF59(Seqirus)、CpG1018(Dynavax)或其组合。
在某些实施例中，药学上可接受的赋形剂可包含溶剂、分散介质、稀释剂、分散液、悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶或其混合物。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是所属领域中已知的(参见《雷明顿:药学科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》,第22版,由艾伦·劳埃德(Allen,Loyd V.)编辑,药学出版社杂志(Jr,Pharmaceutical Press))。除非任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，例如产生任何不合需要的生物作用或另外以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则常规赋形剂介质的用途可涵盖于本公开的范围内。标准药学上可接受的赋形剂的配制可使用医药技术中的常规方法进行(参见《雷明顿制药科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)》,第19版,《马克出版公司(Mack Publishing Company)》,美国宾州东部大学(Eastern Pennsylvania,USA.))。
在一些实施例中，组合物进一步包含磷酸酯缀合物。在不希望受理论束缚的情况下，磷酸酯缀合物可增加体内循环时间和/或增加本公开的聚合物囊泡的靶向递送。用于供本公开使用的磷酸酯缀合物可使用2012年8月30日提出的PCT公开第WO2013/033438号或2011年6月23日提出的美国公开第US2013/0196948号中所描述的方法制备，所述公开中的每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。作为非限制性实例，磷酸酯缀合物可包括2012年8月30日提出的PCT公开第WO2013/033438号中所描述的任何式的化合物，所述公开以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，组合物进一步包含缀合物以增强本公开的聚合物囊泡的递送。在不希望受理论束缚的情况下，选择使用的缀合物可抑制个体中聚合物囊泡的吞噬细胞清除。在一些实例中，缀合物可为人膜蛋白CD47或从其衍生的“自身”肽(例如罗德里格兹(Rodriguez)等人(《科学(Science)》2013,339,971-975)描述的“自身”粒子，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。
在其中有效负载为免疫原性剂或被配置用于编码免疫原性剂的核酸的一些实施例中，组合物进一步包含免疫刺激剂以增强由免疫原性剂诱导的免疫反应。作为非限制性实例，组合物可包含Th1免疫刺激剂，其可增强免疫系统的基于Th1的反应(参见PCT公开第WO2010/123569号和美国公开第2011/0223201号，每一者以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，组合物不包括病毒组分(例如病毒衣壳、病毒酶或其它病毒蛋白，例如基于病毒的复制所需的那些病毒蛋白)，所述组合物也不封装在病毒或病毒粒子内、包封在病毒或病毒粒子内、与病毒或病毒粒子连接或以其它方式与病毒或病毒粒子结合。
用于制备聚合物囊泡的试剂盒
本公开的一个方面涉及一种制备本公开的聚合物囊泡的试剂盒。所述试剂盒包含第一试剂和第二试剂，其中第一试剂包含引发剂，所述引发剂包含聚糖头和引发剂连接部分，并且第二试剂包含增长剂，所述增长剂包含官能性部分和增长剂连接部分，其中官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；并且其中引发剂连接部分被配置成经由包含二硫键的键联与增长剂连接部分偶合。
在一些实施例中，引发剂连接部分被配置成与增长剂连接部分偶合，借此形成本公开的共聚物的键联。在一些实施例中，引发剂连接部分和增长剂连接部分独立地为硫醇基团或二硫杂环戊烷基团。
在一些实施例中，试剂盒进一步包含试剂，所述试剂包含待被通过使用本公开的试剂盒制备的聚合物囊泡包封的有效负载。在某些实施例中，有效负载可如本文所描述。
引发剂
引发剂包含聚糖头和引发剂连接部分。在一些实施例中，聚糖头如上文在本公开的共聚物的引发剂嵌段中所描述。
在一些实施例中，引发剂分子进一步包含如本文在本公开的共聚物中所描述的引发剂间隔基。在某些实施例中，引发剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
在一些实施例中，引发剂选自由以下组成的群组：
增长剂
增长剂包含官能性部分和增长剂连接部分，其中官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合。在一些实施例中，增长剂分子的官能性部分如上文在本公开的共聚物的增长剂嵌段中所描述。
在一些实施例中，增长剂进一步包含如本文在本公开的共聚物中所描述的增长剂间隔基。在某些实施例中，增长剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
在一些实施例中，第二试剂包含两种类型的增长剂，每种增长剂在结构或其提供的所需特性方面彼此不同。举例来说，第二试剂可包含第一增长剂和第二增长剂，所述增长剂各自独立地包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合。在某些实施例中，第一增长剂包含胍基，并且第二增长剂包含两性离子基团。在其它实施例中，第一增长剂包含胍基，并且第二增长剂包含二亚乙基三胺。
在一些其它实施例中，试剂盒进一步包含第三试剂，所述第三试剂包含在结构或其提供的所需特性方面与第二试剂的增长剂不同的增长剂。举例来说，第二试剂的增长剂为第一增长剂分子，并且第三试剂包含第二增长剂。第一增长剂和第二增长剂可独立地包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合。在某些实施例中，第一增长剂包含胍基，并且第二增长剂包含两性离子基团。在其它实施例中，第一增长剂包含胍基，并且第二增长剂包含二亚乙基三胺。
在一些实施例中，增长剂选自由以下组成的群组：
封装
本公开的试剂盒的所有组分可分别封装于物理容器中。在一些实施例中，第一试剂和第二试剂容纳于同一容器中；换句话说，其处于即用封装中。在一些其它实施例中，第一试剂和第二试剂容纳于单独的容器中，因此用户可决定是否和何时混合第一试剂和第二试剂。
使用方法
本公开的一个方面涉及使用本公开的聚合物囊泡的方法。特定地说，进行所述方法以获得所需作用，例如靶向递送有效负载、预防或治疗疾病或增强个体中的适应性免疫反应。在一些实施例中，个体可以是(但不限于)有效负载被设计用于展现其功效的动物或人、需要治疗或预防疾病的动物或人或需要增强其适应性免疫反应的动物或人。
在个体中靶向递送有效负载的方法
在一些实施例中，提供一种在个体中靶向递送有效负载的方法，其包含向个体施用有效量的本公开的聚合物囊泡。在一些实施例中，提供一种在个体中靶向递送有效负载的方法，其包含向个体施用有效量的本公开的药物制剂。聚合物囊泡和有效负载如本文所描述，并且聚合物囊泡将有效负载包封于由聚合物囊泡的膜界定的内部空间内。
在不希望受任何理论束缚的情况下，靶向递送通过形成聚合物囊泡的共聚物的引发剂嵌段实现。特定地说，引发剂嵌段经由其聚糖头提供靶向个体的所需区域的所需结合亲和力/特异性。
预防或治疗个体中的疾病的方法
在一些实施例中，提供一种预防或治疗个体中的疾病的方法，其包含向个体施用有效量的本公开的聚合物囊泡。这一方法的聚合物囊泡将有效负载包封于由聚合物囊泡的膜界定的内部空间内，并且有效负载为治疗剂或衍生被配置用于预防和/或治疗疾病的治疗剂。
在不希望受任何理论束缚的情况下，本公开的聚合物囊泡经由其共聚物的聚糖头提供靶向递送。因此，通过使用本公开的聚合物囊泡递送有效负载，可更有效地发挥有效负载的功效。举例来说，在聚糖头包含与树突细胞上的DC-SIGN特异性结合的结构的实施例中，抗原性或免疫原性有效负载可有效地递送到树突细胞以引起免疫反应，从而预防所关注的疾病。这一策略有益于递送疫苗的抗原或编码抗原的核酸。一些其它实例包括具有被设计用于靶向癌细胞的聚糖头，使得抗肿瘤试剂可有效地递送到癌症微环境。这一策略可增加抗肿瘤试剂的功效并减少治疗的副作用。
在一些实施例中，疾病的特征在于蛋白质或多肽活性功能失调或异常。举例来说，疾病选自由以下组成的群组：罕见病、感染性疾病、癌症和增殖性疾病、遗传病(例如囊肿纤维化)、自身免疫性疾病、糖尿病、神经退行性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢疾病。
在一些实施例中，疾病可为癌症或感染性疾病。在某些实施例中，疾病可为病毒相关感染，包括(但不限于)人副流行性感冒病毒3、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、人偏肺病毒(hMPV)或SARS-CoV-2(COVID-19)相关感染。
增强适应性免疫反应的方法
在一些实施例中，提供一种增强适应性免疫反应的方法，其包含向个体施用有效量的本公开的聚合物囊泡。这一方法的聚合物囊泡将有效负载包封于由聚合物囊泡的膜界定的内部空间内，并且有效负载为治疗剂或衍生被配置用于在个体中引起适应性免疫反应的治疗剂。
在不希望受任何理论束缚的情况下，本公开的聚合物囊泡经由其共聚物的聚糖头提供靶向递送到免疫细胞。在一些实施例中，聚糖头包含以所需特异性或亲和力与抗原呈递细胞结合的结构。举例来说，聚糖头可能包含与树突细胞上的DC-SIGN特异性结合的结构，使得聚合物囊泡能够将免疫原性有效负载特异性递送到树突细胞以促进适应性免疫反应发生。
在一些实施例中，增强的适应性免疫反应针对疾病，包括(但不限于)癌症或感染性疾病。举例来说，感染性疾病可为病毒相关感染，包括(但不限于)人副流行性感冒病毒3、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、人偏肺病毒(hMPV)或SARS-CoV-2(COVID-19)相关感染。
施用
关于本公开的方法，在一些实施例中，向个体施用单次剂量的本公开的聚合物囊泡或制剂，其包封或不包封有效负载。然而，在一些实施例中，以初始剂量向个体施用聚合物囊泡，随后施用至少一次加强剂量，例如一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次随访剂量，其中每个剂量的间隔为约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周或约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)1至7天、1至5天、1至3天、1至10周、1至8周、1至6周、1至4周、1至2周、1至12个月、1至8个月、1至6个月、1至4个月、1至2个月或6至12个月。在某些实施例中，以相同或不同剂量施用包封有效负载的本公开的聚合物囊泡两次，并且两次施用间隔1天、3天、5天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、1至5天、1至2周、1至3个月、1至6个月、1个月至1年、3个月至1年或6个月至1年。
施用途径。如本文所描述的聚合物囊泡或组合物可通过任何途径施用。适合的途径包括(但不限于)经口、经鼻、经粘膜、粘膜下、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、皮内、经皮和经颊途径。一些实际的局部应用包括(但不限于)将滴剂、喷雾剂、气溶胶、凝胶或软膏施用于眼、鼻、口、肛门或阴道的粘膜上皮。其它可能的施用途径通过呼吸道吸入来施用喷雾剂、气溶胶或散剂。
施用的有效量。本文所描述的有效量是指足以提供所需效果的量。在其中施用本公开的聚合物囊泡的目的是治疗疾病的实施例中，有效量是指治疗有效量，而在其中目的是预防疾病的一些其它实施例中，有效量是指预防有效量。
然而，在其中施用聚合物囊泡与有效负载的目的是增强适应性免疫反应的一些其它实施例中，有效量可确定为足以在施用聚合物囊泡和有效负载的个体中诱导抗原特异性免疫反应的量。抗原特异性免疫反应可通过测量在施用聚合物囊泡和有效负载的个体中所产生的抗抗原性多肽(即，有效负载或有效负载的产物)抗体滴度来表征。在一些实施例中，测量可使用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行。
在一些实施例中，使用抗体滴度评估个体是否患有感染或判定是否需要免疫接种。在一些实施例中，使用抗体滴度测定自身免疫反应的强度、判定是否需要加打免疫接种或是否已加打免疫接种、判定先前疫苗是否有效和/或鉴别任何当前的或先前的感染。
本公开的方法的有效量可基于数个因素确定，包括(但不限于)个体的条件(年龄、性别、物种、体重、健康状况等)、待治疗的疾病的进展、施用途径、施用的剂量和间隔以及有效负载的性质。关于有效负载的性质，举例来说，在其中本公开的聚合物囊泡用于携带如mRNA疫苗中的mRNA的实施例中，有效量可基于个体中引起足够的免疫反应所需的mRNA的有效量来确定。因此，在有效负载为mRNA的一些实施例中，本公开的方法的有效量为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000微克(μg或ug)，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)5微克至1000微克、5微克至900微克、5微克至800微克、5微克至700微克、5微克至600微克、5微克至500微克、5微克至400微克、5微克至300微克、5微克至200微克、5微克至175微克、5微克至150微克、5微克至125微克、5微克至100微克、5微克至90微克、5微克至80微克、5微克至70微克、5微克至60微克、5微克至50微克、5微克至40微克、5微克至30微克、5微克至20微克、5微克至10微克、10微克至1000微克、10微克至900微克、10微克至800微克、10微克至700微克、10微克至600微克、10微克至500微克、10微克至400微克、10微克至300微克、10微克至200微克、10微克至175微克、10微克至150微克、10微克至125微克、10微克至100微克、10微克至90微克、10微克至80微克、10微克至70微克、10微克至60微克、10微克至50微克、10微克至40微克、10微克至30微克、10微克至20微克、50微克至1000微克、50微克至900微克、50微克至800微克、50微克至700微克、50微克至600微克、50微克至500微克、50微克至400微克、50微克至300微克、50微克至200微克、50微克至175微克、50微克至150微克、50微克至125微克、50微克至100微克、50微克至90微克、50微克至80微克、50微克至70微克或50微克至60微克、100微克至1000微克、100微克至900微克、100微克至800微克、100微克至700微克、100微克至600微克、100微克至500微克、100微克至400微克、100微克至300微克、100微克至200微克、100微克至175微克、100微克至150微克、300微克至1000微克、300微克至900微克、300微克至800微克、300微克至700微克、300微克至600微克、300微克至500微克、300微克至400微克、500微克至1000微克、500微克至900微克、500微克至800微克、500微克至700微克、500微克至600微克、600微克至800微克或700微克至900微克。
然而，鉴于本公开的聚合物囊泡提供的靶向递送，我们可预期本公开的方法中所需的有效量可能低于其它非靶向递送方法中所需的有效量。举例来说，本公开的方法中所需的有效量可能比其它非靶向递送方法中所需的有效量低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)1％至99％、1％至95％、1％至90％、1％至80％、1％至70％、1％至60％、1％至50％、1％至40％、1％至30％、1％至20％、1％至10％、1％至5％、5％至99％、5％至95％、5％至90％、5％至80％、5％至70％、5％至60％、5％至50％、5％至40％、5％至30％、5％至20％、5％至10％、10％至90％、10％至80％、10％至70％、10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、30％至99％、30％至95％、30％至90％、30％至80％、30％至70％、30％至60％、30％至50％、30％至40％、50％至99％、50％至95％、50％至90％、50％至80％、50％至70％、50％至60％、70％至99％、70％至95％、70％至90％、70％至80％、80％至99％、80％至95％、80％至90％、90％至99％或95％至99％。
此外，在其中本公开的聚合物囊泡用于递送抗原剂或编码抗原剂的核酸以诱导针对抗原剂的抗体的一些实施例中，与由非靶向递送方法诱导的抗体的滴度相比，由本发明诱导的抗体的滴度增加了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个对数，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)1至10个对数、1至8个对数、1至6个对数、1至4个对数、2至9个对数、2至7个对数、2至5个对数、3至10个对数、3至8个对数、3至5个对数或4至6个对数。
在一些其它实施例中，当本公开的聚合物囊泡用于递送抗原剂或编码抗原剂的核酸以诱导针对抗原剂的免疫反应时，与非靶向递送方法的抗体滴度相比，由本发明诱导的针对抗原剂的抗体滴度高0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)0.1至10、0.1至9、0.1至8、0.1至7、0.1至6、0.1至5、0.1至4、0.1至3、0.1至2、0.1至1、0.1至0.5、0.5至10、0.5至9、0.5至8、0.5至7、0.5至6、0.5至5、0.5至4、0.5至3、0.5至2、0.5至1、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、7至10、7至9、7至8或8至10倍。
然而，在其中本公开的聚合物囊泡用于递送抗原剂或编码抗原剂的核酸以诱导针对抗原剂的免疫反应的一些实施例中，免疫反应比由非靶向递送方法诱导的免疫反应早1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20天诱导，或由前述端点限定的任何范围，例如(包括或不包括端点)早1至20、1至18、1至14、1至10、1至6、2至20、2至18、2至14、2至10、2至6、5至20、5至18、5至14或5至10天。
在一些实施例中，如本文在本公开的方法中所描述的聚合物囊泡以足以递送每天每公斤个体体重约0.0001mg至约100mg、约0.001mg至约0.05mg、约0.005mg至约0.05mg、约0.001mg至约0.005mg、约0.05mg至约0.5mg、约0.01mg至约50mg、约0.1mg至约40mg、约0.5mg至约30mg、约0.01mg至约10mg、约0.1mg至约10mg或约1mg至约25mg的有效负载的剂量水平一天一或多次进行施用，以获得所需体内效果。
定义
除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与所属领域的一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。除非另外提和，否则本文采用或涵盖的技术是所属领域的一般技术人员众所周知的标准方法。除非另有指示，否则本公开的实践将采用微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些在所属领域的技能内。材料、方法和实例仅为说明性的并且非限制性的。以下内容以说明的方式呈现并且并不打算限制本公开的范围。
用于描述和要求本公开的某些实施例的表示成分的量、特性(例如分子量、反应条件和结果等)的数字应理解为在一些情况下由术语“约”修饰。所属领域的技术人员应理解术语“约”在其限定的值的情形下的含义。在本公开的一些实施例中所呈现的数值可含有由它们各自的测试测量中的标准差产生的某些误差。举例来说，如本文所用，术语“约”是指可测量的值，例如量、持续时间等，并且意指涵盖与规定值相差±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，只要这类变化是适当的。
如本文所用，“大体上”意指足以实现预期目的。因此，术语“大体上”允许例如所属领域的一般技术人员预期但不会明显地影响总体性能的绝对或完美状态、尺寸、测量值、结果等的较小、不显著的变化。当用于数值或表示为数值的参数或特性时，“大体上”意指在百分之十内。
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指一种用于获得有益或所需结果，例如临床结果的方法。对于本公开，有益或所需结果可包括抑制或遏制感染或疾病的起始或进展；缓解感染或疾病的症状或减少其发展；或其组合。
如本文所用，“预防(preventing)”和“预防(prevention)”可与“预防(prophylaxis)”互换使用，并且可意指完全预防感染或预防所述感染的症状的发展，延迟疾病或其症状的发作；或降低随后发展的感染或其症状的严重程度。
如本文所用，“聚糖”是指多糖、寡糖或单糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物并且可为线性或分支的。聚糖可包括天然糖残基(例如葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基神经胺糖酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖(arabinose)、核糖、木糖等)和/或经修饰的糖(例如2'-氟核糖、2'-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6'磺酸基N-乙酰基葡糖胺等)。
实例
实例1：示范性聚合物囊泡的合成
化学材料和方法
对于化学合成，除非另外指出，否则所有起始材料和商业上获得的试剂均购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)且按原样使用。所有反应均在氮气气氛下使用无水溶剂在烘干的玻璃器皿中进行。1H和13C NMR光谱在Brucker AV-600光谱仪上记录，并且参考所用溶剂(对于1H和13C，分别为δ7.24和77.23处的CDCl3、δ3.31和49.2处的CD3OD和δ4.80处的D2O以及δ2.5和39.51处的DMSO-d6)。使用以下惯例以ppm为单位报道化学位移(δ)：化学位移、多重性(s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰)、积分和耦合常数(J)，其中J以Hz为单位报道。在ESI-TOF质谱分析条件下记录高分辨率质谱。硅胶(怡默克化工(E,Merck))用于快速色谱法。IMPACTTM系统(内含肽介导的纯化与亲和几丁质结合标签；InteinMediated Purification with Affinity Chitinbinding Tag)购自纽英伦生物技术。His标签纯化树脂购自罗氏(Roche)。HiTrap IMAC柱(5mL)购自通用电气医疗生命科学部(GEHealthcare Life Sciences)。使用配备有与101折射率检测器和Shodex柱相关的Ultimate3000液相色谱法的凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，GPC)在30℃下使用THF作为洗脱剂以1mL min-1流动速率分析聚合物产物。校准基于窄线性聚(苯乙烯)Shodex标准品(SM-105)。使用DIONEX chromeleon软体计算聚合物产物的Mw和分散度。通过FEITecnai G2 F20 S-Twin获得透射电子显微镜(Transmission electron microscopy，TEM)图像。
本文所描述的化学材料和方法适用于本公开中所描述的所有实例。
本公开的示范性增长剂的制备
本文描述五种示范性增长剂，即增长剂P1、P2、P3、P4和P5。增长剂P1(化合物2)、P2(化合物3)和P4(化合物8)的制备方法说明于以下方案1中。根据以下方案2制备增长剂P3(化合物11)。根据以下方案3制备增长剂P5(化合物14)。通过NMR验证方案的每个步骤中所获得的化合物。下文描述额外的细节和数据。
方案1
方案2
方案3
化合物1.
基于公开的程序合成并表征化合物1。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ5.92(br,1H),3.60-3.57(m,1H),3.29(dt,J＝11.2Hz,2H),3.21-3.10(m,2H),2.86-2.79(m,2H),2.55-2.31(m,1H),2.21(t,2H,J＝7.4Hz),1.90-1.85(m,1H),1.77-1.41(m,8H)。根据傅佳奇(Jiaqi Fu)等人,《美国化学会志(Journal of the American Chemical Society)》2015137(37),12153-12160进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物2.
基于公开的程序合成并表征化合物2。1H NMR(600MHz,MeOD):δ3.98(s,1H),3.61-3.39(m,1H),3.30-3.22(m,4H),3.22-2.88(m,2H),2.56-2.30(m,1H),2.21(t,J＝7.4Hz,2H),1.98-1.72(m,1H),1.79-1.30(m,6H)。根据傅佳奇等人,《美国化学会志》2015 137(37),12153-12160进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物3.
基于公开的程序合成并表征化合物3。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ3.61-3.56(m,1H),3.41-3.34(m,1H),3.31-3.16(m,8H),3.14-3.06(m,2H),2.54-2.40(m,1H),2.08(t,J＝7.4Hz,2H),1.95-1.86(m,1H),1.69(s,1H),1.55(m,3H),1.47-1.31(m,2H)。根据郭(Guo,J.)等人,聚(二硫醚)作为递送CRISPR-Cas9机制进行治疗性基因组编辑的通用平台的合理设计(Rational Design of Poly(disulfide)s as a Universal Platform for Deliveryof CRISPR-Cas9 Machineries toward Therapeutic Genome Editing.ACS CentralScience.2021,7,990-1000)进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物4.
根据公开的方案合成并表征化合物4。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ7.44-7.12(m,5H),5.02(s,2H),3.62-3.41(m,4H),3.35(t,1H,J＝7.2Hz),2.98(d,2H,J＝5.9Hz),1.79-1.03(m,6H)。根据傅佳奇等人,《美国化学会志》2015 137(37),12153-12160进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物5.
根据公开的方案合成并表征化合物5。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ11.52(br,1H),8.62(s,1H),3.45(q,J＝4.00Hz,2H),2.86(t,J＝4.00Hz,2H),1.49(s,9H),1.48(s,9H)。根据库普梅纳斯(Kuppusamy,R.)等人,基于联苯骨架的短两亲阳离子抗菌肽模拟物的设计与合成(Design and synthesis of short amphiphilic cationic peptidomimetics basedon biphenyl backbone as antibacterial agents).《欧洲药物化学杂志(Eur.J.Med.Chem.)》2018,143,1702-1722进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物6.
在氮气下用EDC(0.506mmol)、HOBt(0.506mmol)和三甲胺(0.57mmol)预活化4(0.126mmol)于DMF(1mL)中的溶液30分钟。随后将含5(0.506mmol)的DMF(1mL)添加到以上溶液中，并将所得溶液在室温下搅拌12小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，随后用乙酸乙酯稀释。将有机层用H2O洗涤三次并经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM1:20)纯化粗产物，得到6(134mg，74％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ11.45-11.33(m,3H),8.53-8.45(m,3H),8.35(t,J＝4.9Hz,2H),7.33-7.25(m,5H),5.04(s,2H),3.59-3.19(m,16H),3.15-3.12(q,J＝6.0Hz,2H),3.06-3.04(t,J＝6.9Hz,1H),1.77-1.71(m,1H),1.55-1.32(m,59H)。C57H97N14O17[M+H]+m/z的HRMS(ESI)计算值：1249.7156；实验值：1249.7166。
化合物7.
向6(0.12mmol)于MeOH(2mL)中的溶液中添加钯/木炭(Pd/C，10％ Pd含量，13mg)。将混合物在室温下在氢气气氛下搅拌6小时。通过硅藻土垫过滤溶液。将残余物在真空中浓缩至干燥，并将所得残余物溶解于DCM(2mL)中。将硫辛酸(0.152mmol)、EDCI(0.304mmol)、HOBt(0.304mmol)和TEA(0.304mmol)添加到混合物中，随后在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，随后用乙酸乙酯稀释。将有机层用H2O洗涤三次，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM 1:50)纯化粗产物，得到7(94mg，82％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ11.48-11.30(m,3H),8.57-8.46(m,3H),8.40(t,J＝5.2Hz,2H),8.15-8.12(m,1H),6.22-6.18(m,1H),3.60-3.34(m,16H),3.28-3.04(m,7H),2.48-2.38(m,1H),2.17-2.14(t,J＝7.4Hz,2H),1.92-1.71(m,11H),1.71-1.59(m,4H),1.57-1.34(m,64H)。C57H103N14O16S2[M+H]+m/z的HRMS(ESI)计算值：1303.7118；实验值：1303.7129。
化合物8.
将化合物7(0.08mmol)添加到4M HCl(0.5mL)于1,4-二噁烷(0.5mL)中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌12小时。此后，去除溶液并在真空中干燥，得到8(24mg，89％)。1HNMR(600MHz,D2O):δ3.60-3.40(m,3H),3.4-3.16(m,16H),3.02(s,2H),2.76(s,2H),2.20-2.03(m,2H),1.98-1.76(m,2H),1.62-1.16(m,11H)。13C NMR(150MHz,D2O):δ176.61,175.62,173.68,172.92,156.88(x3),66.01,65.73,56.57,55.36,55.24,40.40(x2),40.27,38.69,37.99(x3),37.82,35.44,33.57,28.66,28.18,27.73,24.99,22.71。C27H55N14O4S2[M+H]+m/z的HRMS(ESI)计算值：703.3967；实验值：703.3995。
化合物9.
在氮气下用EDCI(3mmol)、HOBt(3mmol)和三甲胺(3mmol)预活化硫辛酸(2.5mmol)于DMF(3mL)中的溶液30分钟。随后将含赖氨酸(1mmol)的DMF(3mL)添加到以上溶液中，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，随后用乙酸乙酯稀释。将有机层用H2O洗涤三次，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM 1:20)纯化粗产物，得到9(230mg，90％)。1H NMR(600MHz,MeOD):δ4.37-4.32(dd,J＝4.6,9.2Hz,1H),3.63-3.57(qui,J＝6.8Hz,2H),3.22-3.17(m,4H),3.14-3.09(m,2H),2.51-2.45(m,2H),2.29(t,J＝7.0Hz,2H),2.21(t,J＝7.0Hz,2H),1.95-1.86(m,3H),1.79-1.62(m,9H),1.60-1.40(m,8H)。C57H97N14O17[M+H]+m/z的HRMS(ESI)计算值：1249.7156；实验值：1249.7166。
化合物10.
在氮气下用EDC(0.211mmol)、HOBt(0.211mmol)和三甲胺(0.282mmol)预活化9(0.141mmol)于DMF(1mL)中的溶液30分钟。随后将含5(0.183mmol)的DMF(1mL)添加到以上溶液中，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，随后用乙酸乙酯稀释。将有机层用H2O洗涤三次，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM1:20)纯化粗产物，得到10(92mg，84％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ11.39(s,1H),8.58(t,J＝6.0Hz,1H),7.98(t,J＝4.6Hz,1H),6.41(d,J＝7.4Hz,1H),5.79-5.74,(m,1H),4.37(q,J＝7.5Hz,1H),3.57-3.48(m,4H),3.44-3.35(m,2H),3.26-3.12(m,4H),3.11-3.05(m,2H),2.46-2.39(m,2H),2.18(t,J＝7.4Hz,2H),2.13(t,J＝7.4Hz,2H),1.91-1.84(m,2H),1.82-1.75(m,1H),1.71-1.57(m,9H),1.54-1.35(m,20H),1.33-1.25(m,2H)。13C NMR(150MHz,CDCl3):δ172.91,172.55,171.72,162.87,157.42,153.03,83.72,79.97,56.46,56.44,52.78,41.19,40.27,40.26,40.20,38.96,38.48(x2),36.48,36.37,36.30,34.64,34.61,32.60,29.18,28.95,28.88,28.29(x2),28.05(x2),25.46,25.36,25.32,22.29。C35H63N6O7S4[M+H]+m/z的HRMS(ESI)计算值：807.3641；实验值：807.3655。
化合物11.
将化合物10(0.1mmol)添加到4M HCl(0.5mL)于1,4-二噁烷(0.5mL)中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌12小时。此后，去除溶液并在真空中干燥，得到8(59mg，定量)。所述化合物是纯的，无需进一步纯化即可直接使用。
化合物12.
将硫辛酸(3mmol)和CDI(3.9mmol)的溶液溶解于25ml无水DCM中。在0℃下将这一溶液逐滴添加到5ml含有8mmol N-甲基-1,3-丙二胺的无水DCM中。将反应混合物在0℃下搅拌40分钟并在室温下搅拌30分钟，随后将其用H2O洗涤三次并经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到12(589mg，66％)。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ3.57-3.50(m,1H),3.31(q,J＝5.8Hz,2H),3.17-3.12(m,1H),3.11-3.05(m,1H),2.65(t,J＝6.0Hz,2H),2.46-2.40(m,1H),2.39(s,3H),2.15-2.11(m,2H),1.91-1.84(m,1H),1.72-1.54(m,6H),1.49-1.37(m,2H)。C12H26N2OS2[M+H]+m/z的HRMS(ESI)计算值：277.1408；实验值：277.1399。
化合物13.
根据公开的方案合成并表征化合物13。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ4.50-4.38(m,4H),4.19-4.15(m,2H),1.74-1.70(m,2H),1.38-1.20(m,12H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H)。根据刘(Liu,S.)等人,阳离子聚合物的两性离子磷脂化促进系统性mRNA递送至脾脏和淋巴结(Zwitterionic Phospholipidation of Cationic Polymers Facilitates SystemicmRNA Delivery to Spleen and Lymph Nodes).《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》2021,143,21321-21330进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物14.
将12(0.25mmol)于1ml无水DMF中的溶液添加到13(0.25mmol)中，并将反应物在70℃下搅拌24小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，得到14(116mg，90％)。1H NMR(600MHz,MeOD):δ7.90(s,1H),4.14-4.01(m,1H),3.91-3.83(m,1H),3.73-3.67(m,1H),3.62-3.55(m,1H),3.28(t,J＝6.6Hz,2H),3.21-3.15(m,1H),3.13-3.06(m,1H),2.98(t,J＝7.2Hz,2H),2.69(s,3H),2.50-2.41(m,1H),2.24(t,J＝7.2Hz,2H),1.93-1.84(m,1H),1.76-1.59(m,6H),1.51-1.43(m,2H),1.43-1.37(m,1H),1.36-1.25(m,5H),0.92-0.88(m,3H)。13C NMR(150MHz,MeOD):δ177.08,79.68,57.79,48.91,48.77,48.04,41.54,39.55,37.06,36.91,35.91,33.85,33.20,32.09,32.05,30.44,30.12,27.73,27.16,26.81,23.92,14.65。C22H44N2O5PS2[M-H]-m/z的HRMS(ESI)计算值：511.2429；实验值：511.2423。
本公开的示范性引发剂的制备
本文描述九种示范性引发剂，即引发剂I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9和I10。根据方案4、方案5和方案6制备引发剂I2(化合物34)、I3(化合物39)和I4(化合物37)。根据方案7、方案8、方案9和方案10制备引发剂I5(化合物16)、I6(化合物43)、I7(化合物44)、I8(化合物40)、I9(化合物49)和I10(化合物54)。通过NMR验证方案的每个步骤中所获得的化合物。下文描述额外的细节和数据。
另外，在本实例中制备对照引发剂I1。不带有聚糖头的I1是无特定靶向偏好的引发剂，并被制备用于形成本公开的示范性增长剂的共聚物以表征增长剂。引发剂I1具有以下结构：
方案4
方案5
方案5(续)
方案6
方案7
方案8
方案9
方案10
化合物158.
根据公开的方案合成并表征化合物15。1H NMR(600MHz,MeOD):δ6.93(d,J＝8.6Hz,2H),6.71(d,J＝8.6Hz,2H),5.3(s,1H),4.00-3.99(m,1H),3.89-3.88(m,1H),3.81-3.79(m,1H),3.79-3.70(m,2H),3.69-3.67(m,1H)。
化合物16.
向15(0.24mmol)于DMF(2mL)中的溶液中添加EDC(0.24mmol)、HOBt(0.24mmol)、三甲胺(0.4mmol)和3-巯基丙酸(0.2mmol)，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM 1:2)纯化粗产物，得到16(72％)。1H NMR(600MHz,MeOD)δ6.94(d,J＝8.6Hz,2H),6.72(d,J＝8.6Hz,2H),5.30(s,1H),4.00(dd,J＝3.4,1.8Hz,1H),3.89(dd,J＝9.7,3.4Hz,1H),3.81-3.67(m,4H),2.72(t,J＝6.8Hz,2H),2.60(t,J＝6.8Hz,2H)。13C NMR(150MHz,MeOD)δ176.55,151.13,143.23,119.25(x2),117.93(x2),101.49,101.32,75.10,72.43,72.18,68.42,62.66,40.34,20.70。C15H22NO7S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：360.1117，实验值360.1101。
化合物17至20.根据彭(Peng,W.)；保尔森(Paulson,J.C.),天然N-聚糖支架上的CD22配体可有效地将毒素递送到B淋巴瘤细胞(CD22 Ligands on a Natural N-GlycanScaffold Efficiently Deliver Toxins to B-Lymphoma Cells).《美国化学会志》2017,139,12450-12458合成化合物17至20，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物21至25.根据陈(Chien,W.-T.)等人,寡-N-乙酰乳糖胺和其多唾液酸化延伸物的连续一锅酶合成(Sequential one-pot enzymatic synthesis of oligo-N-acetyllactosamine and its multi-sialylated extensions).《化学通讯(Chem.Commun.)》2014,50,5786-5789合成化合物21至25。
化合物26.向含化合物25(0.43mmol)的DCM(5mL)中添加EDC(0.52mmol)、HOBt(0.52mmol)、三甲胺(0.86mmol)和3-巯基丙酸(0.47mmol)，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM 1:10)纯化粗产物，得到26(184mg，80％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ5.96(d,J＝8.6Hz,1H),5.28(t,J＝9.6Hz,1H),5.05(t,J＝9.4Hz,1H),4.64(d,J＝8.4Hz,1H),4.24(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),4.11(dd,J＝12.3,2.5Hz,1H),3.86-3.80(m,2H),3.68-3.66(m,1H),3.47-3.43(m,1H),3.34-3.29(m,1H),3.22-3.16(m,1H),2.81(t,J＝8.2Hz,2H),2.51-2.45(m,2H),2.06(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.93(s,3H),1.57-1.51(m,4H),1.48(t,J＝7.0Hz,2H)1.37-1.29(m,4H)。C23H38N2O10S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：535.2325，实验值535.2314。根据马克拉科娃(Maklakova,S.Y.)等人,通过肝脏活体显微镜研究细胞对含N-乙酰基-d-半乳糖胺、N-乙酰基-d-葡萄糖胺和d-甘露糖的荧光糖缀合物的摄取(Cellular uptake of N-acetyl-d-galactosamine-,N-acetyl-d-glucosamine-and d-mannose-containingfluorescent glycoconjugates investigated by liver intravital microscopy).《碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)》2020,489,107928进行合成，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物27.向含化合物26的MeOH中添加NaOMe，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌2小时。将混合物通过IR-120中和，随后过滤，在真空中浓缩至干燥，得到27(92mg，定量)。1HNMR(600MHz,MeOD)δ4.38(d,J＝9.2Hz,1H),3.90-3.86(m,2H),3.68(dd,J＝12.9,5.9Hz,1H),3.65-3.62(m,1H),3.48-3.43(m,2H),3.28-3.24(m,1H),3.20-3.14(m,2H),2.94(t,J＝7.3Hz,1H),2.73(t,J＝7.3Hz,1H),2.59(t,J＝7.3Hz,1H),2.47(t,J＝7.3Hz,1H),1.97(s,3H),1.56-1.48(m,4H),1.39-1.35(m,4H)。13C NMR(150MHz,MeOD):δ173.70,169.75,102.74,77.92,76.07,70.50,62.76,57.35,41.02,40.32,36.45,35.19,30.49,27.66,26.73,23.03。C17H32N2O17S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：409.2008，实验值409.2017。
9AmNeu5Ac-α2,3-SCT 30、9AmNeu5Ac-α2,6-SCT 31和Neu5Ac-α2,3-SCT 38的制备.根据林(Lin,C.-W.)等人,靶向胰腺癌上SSEA-4聚糖的具有改进的效应功能的同质抗体和CAR-T细胞(Homogeneous antibody and CAR-T cells with improved effectorfunctions targeting SSEA-4glycan on pancreatic cancer).《美国科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences)》2021,118,e2114774118(其以全文引用的方式并入本文中)，将30mg唾液酸基糖肽(SGP)在Tris-HCl缓冲液中在37℃下用Endo-S WT(300μg)消化48小时，并通过葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)凝胶过滤色谱法纯化，并通过ESI-MS分析产物，得到SCT化合物28。在37℃下将含神经氨糖酸苷酶(5U/ml，12μL)的Tris-HCl缓冲液添加到混合物中持续12小时，并通过葡聚糖凝胶G-25凝胶过滤色谱法纯化，得到脱唾液酸化的N-聚糖29。此后，在0.5mL含有100mM 9AmNeu5Ac(14.5mg，47μmol)、110mM CTP(27.2mg，52μmol)和20mM MgCl2的HEPES缓冲液(50mM，pH 8.5)中进行反应。通过添加2N NaOH将反应混合物的pH调节到8.5。随后，将0.5mg/mL NmCSS添加到以上溶液中。将所得混合物在37℃下孵育8小时，并通过TLC分析监测CMP-9AmNeu5Ac的形成。
对于9AmNeu5Ac-α2,6-SCT，根据彭(Peng,W.)等人,最近的H3N2病毒已经进化出针对扩展的、分支的人类型受体的特异性，从而具有增加亲和力的潜力(Recent H3N2VirusesHave Evolved Specificity for Extended,Branched Human-type Receptors,Conferring Potential for Increased Avidity).《细胞宿主与微生物(Cell HostMicrobe)》2017,21,23-34(其以全文引用的方式并入本文中)，将hST6Gal-I(0.5mg/mL)添加到具有N-聚糖的9AmNeu5Ac反应混合物中并在37℃下孵育。对于9AmNeu5Ac-α2,3-SCT，将PmST3(0.3mg/mL)添加到具有N-聚糖的9AmNeu5Ac反应混合物中并在37℃下孵育。对于Neu5Ac-α2,3-SCT，将PmST3(0.3mg/mL)添加到具有N-聚糖的Neu5Ac反应混合物中并在37℃下孵育。通过质谱分析和TLC监测上述反应。在受体耗尽之后，将反应物离心，并将上清液通过截留分子量为10kDa的离心过滤器(Amicon Ultra，密理博(Millipore))去除蛋白质。用P-2凝胶过滤色谱法纯化滤液，得到9AmNeu5Ac-α2,3-SCT 30、9AmNeu5Ac-α2,6-SCT 31和Neu5Ac-α2,3-SCT 38。
9BPCNeu5Ac-α2,6-SCT-SH 34、9TCCNeu5Ac-α2,3-SCT-SH 37和Neu5Ac-α2,3-SCT-SH39的制备.将9AmNeu5Ac-α2,6-SCT和DIEA(5.0当量)溶解于H2O中，随后添加含联苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BPC-NHS)(3当量)的THF。将反应物在0℃下搅拌直到起始材料耗尽为止。随后，将反应物通过Sep-Pak C18柱(2g，沃特世公司(Waters Corp.))纯化并用H2O-MeOH洗脱，得到产率91％的化合物32。与上文所描述类似地，通过与4H-噻吩并[3,2-c]色烯-2-氨甲酰基-NHS(TCC-NHS)在THF和H2O中搅拌来制备9AmNeu5Ac-α2,3-SCT，得到化合物35。在纯化之后，得到91％产率的产物。
向9BPCNeu5Ac-α2,6-SCT 32或9TCCNeu5Ac-α2,3-SCT 35于水中的混合物中添加CDMBI和TEA，并在4℃下孵育1小时以分别产生相应的噁唑啉N-聚糖33和36。此后，将其通过葡聚糖凝胶G-25凝胶过滤色谱法纯化并通过ESI-MS表征。将GlcNAc-SH 27(0.25mg)和Endo-M(N175Q)(1.6U/mL)添加到具有9BPCNeu5Ac-α2,6-SCT-噁唑啉的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)的溶液中，并在30℃下孵育30分钟。将转糖化产物通过P-2凝胶过滤色谱法分离，得到化合物34并通过ESI-MS表征。9TCCNeu5Ac-α2,3-SCT-SH 37和Neu5Ac-α2,3-SCT-SH 39的制备与上文所描述相同。
化合物34.9BPCNeu5Ac-α2,6-SCT-SH。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝8.33(s,3H,NH),8.00(d,J＝8.6Hz,4H),7.72(dd,J＝8.0,14.2Hz,9H),7.49(t,J＝8.3Hz,4H),7.40(t,J＝8.3Hz,2H),4.98-4.95(m,2H),4.76(s,1H),4.54(s,1H),4.44-4.39(m,2H),4.25-4.22(m,3H),3.99(s,1H),3.87(s,1H),3.83-3.73(m,5H),3.41-3.25(m,58H),3.21-3.16(m,3H),3.11-2.99(m,4H),2.87(t,J＝6.9Hz,2H),2.61(d,J＝8.4Hz,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),1.91-1.77(m,18H),1.44(t,J＝6.9Hz,2H),1.39-1.28(m,4H),1.28-1.19(m,4H),1.12(t,J＝6.9Hz,1H)。C119H171N9O63S2-[M-2H]2-的HRMS(ESI)计算值：1383.0093，实验值1383.0077。
化合物37.9TCCNeu5Ac-α2,3-SCT-SH。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝8.22(s,3H,NH),8.10-8.09(m,1H,NH),7.96-7.93(m,1H,NH),7.81-7.79(m,1H,NH),7.74-7.72(m,1H,NH),7.35(d,J＝7.8Hz,2H),7.29(s,2H),7.20(t,J＝7.8Hz,2H),6.97(t,J＝7.8Hz,2H),6.92(d,J＝7.9Hz,2H),5.29(s,4H),5.01-4.95(m,2H),4.77(s,1H),4.54(s,1H),4.44-4.36(m,2H),4.27-4.19(m,3H),3.99(s,1H),3.88(s,1H),3.85-3.71(m,3H),3.50-3.22(m,52H),3.19(d,J＝9.5Hz,2H),3.10-3.00(m,4H),2.87(t,J＝6.9Hz,2H),2.64-2.58(m,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),1.93-1.78(m,18H),1.45-1.39(m,2H),1.39-1.29(m,4H),1.28-1.20(m,4H),1.16(t,J＝6.9Hz,1H)。C117H169N9O65S3 2-[M-2H]2-的HRMS(ESI)计算值：1416.9606，实验值1416.9623。
化合物39.Neu5Ac-α2,3-SCT-SH 1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ＝8.33(s,3H,NH),8.10(s,1H,NH),7.96-7.94(m,1H,NH),7.81-7.80(m,1H,NH),7.74-7.73(m,1H,NH),4.98-4.95(m,2H),4.76-4.75(m,1H),4.54(s,1H),4.46-4.38(m,2H),4.25-4.22(m,3H),3.99(s,1H),3.87(s,1H),3.80-3.71(m,4H),3.41-3.25(m,59H),3.23-3.18(m,3H),3.08-3.01(m,3H),2.87(t,J＝6.9Hz,2H),2.63-2.60(m,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),1.87-1.79(m,18H),1.44(t,J＝6.9Hz,2H),1.39-1.28(m,4H),1.28-1.19(m,4H),1.07(t,J＝6.9Hz,1H)。C93H153N7O63S2-[M-2H]2-的HRMS(ESI)计算值：1203.9357，实验值1203.9377。
化合物40.
向含化合物15(0.12mmol)的DMF(1mL)中添加EDC(0.12mmol)、HOBt(0.12mmol)、DMAP(0.12mmol)、三甲胺(0.2mmol)和CT(PEG)12(0.1mmol)，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌12小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到40(59％)。1H NMR(600MHz,MeOD):δ6.93(d,J＝8.6Hz,2H),6.71(d,J＝8.6Hz,2H),5.3(s,1H),4.00-3.99(m,1H),3.89-3.88(m,1H),3.81-3.70(m,5H),3.70-3.59(m,48H),2.68(t,J＝6.8Hz,2H),2.50-2.47(m,2H)。13C NMR(150MHz,MeOD):δ170.17,151.03,143.50,119.26(x2),117.82(x2),101.36,75.10,74.08,72.45,72.19,71.45,71.41,71.37,71.30,71.24,71.11,70.93(x18),68.43,62.68,24.67。C39H70NO19S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：888.4263，实验值888.4241。
化合物41至42.根据李(Lee,H.-K.)等人,基于反应性的寡甘露糖一锅合成：定义广谱中和抗HIV-1抗体2G12识别的抗原(Reactivity-Based One-Pot Synthesis ofOligomannoses:Defining Antigens Recognized by 2G12,a Broadly NeutralizingAnti-HIV-1Antibody).《德国应用化学(Angew.Chem.Int.Ed.)》2004,43,1000-1003合成化合物41和42，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
化合物43.
向42(0.24mmol)于DMF(2mL)中的溶液中添加EDC(0.24mmol)、HOBt(0.24mmol)、三甲胺(0.4mmol)和3-巯基丙酸(0.2mmol)，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌2小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过硅胶柱色谱法(MeOH/DCM 1:3)纯化粗产物，得到16(81％)。1H NMR(600MHz,MeOD)δ4.91(s,1H),3.84(dd,J＝3.4,1.8Hz,1H),3.82-3.76(m,2H),3.75-3.67(m,2H),3.62(m,1H),3.56-3.41(m,2H),2.94(t,J＝7.0Hz,2H),2.70(t,J＝7.2Hz,2H),2.48(t,J＝7.2Hz,2H)。C14H28NO7S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：354.1586，实验值354.1602。
化合物44.
向含化合物42(0.12mmol)的DMF(1mL)中添加EDC(0.12mmol)、HOBt(0.12mmol)、三甲胺(0.2mmol)和CT(PEG)12(0.1mmol)，并将所得溶液在氮气和室温下搅拌12小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到44(62％)。1H NMR(600MHz,D2O):δ4.77(d,J＝8.6Hz,2H),3.85-3.82(m,1H),3.81-3.77(m,1H),3.69-3.67(m,1H),3.66-3.64(m,2H),3.63-3.57(m,41H),3.55-3.45(m,4H),2.88(t,J＝6.8Hz,2H),2.57(t,J＝7.2Hz,2H),2.37(t,J＝7.2Hz,2H),1.66-1.51(m,4H),1.40-1.31(m,2H)。13C NMR(150MHz,D2O):δ171.01,99.62,72.72,70.57,69.99,69.24(x22),69.04,67.90,67.39,66.73,60.92,39.36,37.57,27.96,26.70,22.91,22.43。C38H76NO19S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：882.4732，实验值882.4750。
化合物45.
将含化合物15b(5mmol)的MeOH添加到NaOMe(0.2当量)中，并将所得溶液在氮气和室温下搅拌2小时。将混合物通过IR-120中和，过滤并在真空中浓缩至干燥。随后将其溶解于无水DCM(40mL)中并在0℃下用咪唑(7.5mmol)处理，随后添加TBDPSCl(5.5mmol)。将混合物在室温和氮气气氛下搅拌2.5小时。通过添加MeOH来淬灭反应。在室温下搅拌10分钟之后，在减压下去除溶剂，得到干燥残余物，将其通过柱色谱法用MeOH/DCM(1/10)纯化，得到化合物45(75％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.61(m,4H),7.41-7.29(m,11H),7.23-7.18(m,2H),6.92(d,J＝9.3Hz,2H),5.41(s,1H),5.16(s,2H),4.09(s,1H),4.02-4.00(dd,J＝9.3,3.4Hz,1H),3.91(t,J＝9.3Hz,1H),3.85(d,J＝5.1Hz,2H),3.72-3.69(m,1H),1.01,(s,9H)。13C NMR(150MHz,CDCl3):162.61,135.64(x4),135.54(x4),132.73,129.95(x4),128.64(x4),128.38,128.33,127.84(x2),127.81(x2),98.09,71.41,71.22,70.22,70.13,64.89,36.53,31.48,26.83(x3),19.19。C36H42NO8Si[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：644.2680，实验值644.2699。
化合物46.
在室温和氮气大气压下，向化合物45(3mmol)和催化量的CSA(0.3mmol)于CH3CN(60mL)中的溶液中添加原苯甲酸三甲酯(9mmol)。在搅拌30分钟之后，添加Et3N以淬灭反应，并将所得混合物在减压下干燥。通过柱色谱法用EA/己烷(1/2)纯化残余物，得到化合物46(81％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.65-7.59(m,2H),7.57-7.52(m,4H),7.41-7.27(m,14H),7.26-7.20(m,2H),6.93(d,J＝9.2Hz,2H),5.77(s,1H),5.17(s,2H),4.70(d,J＝6.1Hz,1H),4.58(dd,J＝9.3,3.4Hz,1H),3.79-3.76(m,2H),3.74-3.70(m,1H),3.69-3.66(m,1H),3.22(s,3H),2.53(d,J＝3.9Hz,1H),0.93,(s,9H)。13C NMR(150MHz,CDCl3):171.23,153.49,152.24,137.09,136.09,135.68(x4),135.48(x4),132.98,132.72,129.86,129.84(x2),129.18,128.65(x2),128.39,128.37,128.34,127.78(x2),127.71(x2),126.23,121.11,117.18,95.69,79.52,69.57,69.45,67.03,63.75,60.44,51.16,26.76(x3),19.15,14.22。C44H48NO9Si[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：762.3098，实验值762.3072。
化合物47.
将化合物46(2mmol)溶解于DCM(20mL)中并依序与DIPEA(6mmol)、苯甲酸酐(4mmol)和DMAP(0.2mmol)混合。在搅拌30分钟之后，在减压下蒸发溶剂，得到干燥残余物，随后倒入EA(20mL)和2N HCl(20mL)中，剧烈搅拌30分钟。通过蒸发去除溶剂，接着用EA萃取。将所收集的有机层用冰冷饱和NaHCO3(水溶液)、水和盐水洗涤，并经MgSO4干燥。将滤液在减压下蒸发并再溶解于THF(20mL)中。在0℃下添加AcOH(4mmol)和1M TBAF(2.4mmol于THF中)。将所得混合物逐渐升温至室温，再搅拌2小时，随后用EA稀释。将有机层用饱和NaHCO3(水溶液)、水和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法用EA/己烷(1/2)纯化干燥残余物，得到化合物47(65％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.10-8.05(m,4H),7.61-7.56(m,2H),7.48-7.41(m,4H),7.39-7.27(m,7H),7.03(d,J＝9.2Hz,2H),5.69(s,1H),5.62-5.55(m,2H),5.16,(s,2H),4.62(dd,J＝9.3,3.4Hz,1H),4.06-4.01(m,1H),3.76-3.67(m,2H)。13C NMR(150MHz,CDCl3):167.42,166.05,153.55,152.01,136.03,133.84,133.76,130.00(x4),129.09,128.96,128.69(x4),128.65(x4),128.62(x4),128.34,117.11(x2),96.18,72.61,71.30,70.01,68.53,61.16。C34H32NO10[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：614.2026，实验值614.2038。
化合物48.
将47(0.2mmol)和4A分子筛(0.2g)于无水DCM(2mL)中的搅拌溶液冷却至-40℃，随后将BF3(OEt)2(0.02mmol)逐滴添加到溶液中。将15a于无水DCM中的溶液逐滴添加到以上混合物中并在-40℃下搅拌1小时。此后，将反应物逐渐升温至室温并再搅拌1小时。将溶液通过添加三乙胺淬灭，随后过滤并添加饱和NaHCO3水溶液且用DCM萃取。将有机层经MgSO4干燥并蒸发至干燥。通过硅胶快速柱色谱法纯化残余物，得到三糖产物。随后将产物溶解于MeOH中，添加NaOMe(0.2当量)，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。将混合物通过IR-120中和，过滤并在真空中浓缩至干燥。通过Bio-Gel P-2凝胶(Biorad)用H2O作为洗脱剂纯化脱乙酰化混合物，得到纯三糖。将化合物冻干，随后溶解于MeOH(2mL)中，并添加10％ Pd-C(30mg)且在H2气氛下剧烈搅拌过夜。将溶液通过硅藻土过滤并浓缩至干燥，得到化合物48(42％)。1HNMR(600MHz,D2O)δ7.03(d,J＝9.2Hz,2H),6.88(d,J＝9.2Hz,2H),5.48(s,1H),5.19(s,1H),4.76(s,1H),4.32(s,1H),4.14(dd,J＝9.3,3.0Hz,1H),4.11(s,1H),3.95-3.63(m,15H)。13C NMR(150MHz,D2O):151.38,143.39,121.23,120.70,105.19,101.60,101.39,80.93,76.13,75.38,74.04,73.27,73.12,72.79,72.66,72.22,69.50,69.41,68.70,67.90,63.71,63.65。C24H37NO16Na[M+Na]+的HRMS(ESI)计算值：618.2010，实验值618.2029。
化合物49.
向含化合物48(0.12mmol)的DMF(1mL)中添加EDC(0.12mmol)、HOBt(0.12mmol)、DMAP(0.12mmol)、三甲胺(0.2mmol)和CT(PEG)12(0.1mmol)，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌12小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过Bio-Gel P-2凝胶用H2O作为洗脱剂纯化粗产物，得到49(54％)。1H NMR(600MHz,D2O):7.20(d,J＝9.2Hz,2H),7.13(d,J＝9.2Hz,2H),5.53(s,1H),5.09(s,1H),4.65(s,1H),4.25(s,1H),4.06(dd,J＝9.3,3.0Hz,1H),4.01(m,1H),3.83-3.67(m,11H),3.61-3.56(m,52H),2.64(t,J＝6.4Hz,2H),2.48(t,J＝6.4Hz,2H)。13C NMR(150MHz,D2O):178.06,153.84,149.84,123.02,118.11,120.42,98.8,97.78,78.05,73.39,72.61,72.17,71.47,70.52,70.35,70.01,69.85,69.55,69.38,69.31,69.17,66.97,66.74,66.60,65.82,65.10,60.96,60.86,35.82,23.03。C51H89NO29SNa[M+Na]+的HRMS(ESI)计算值：1234.5139，实验值1234.5114。
化合物51.
向50(1mmol)于无水DCM(10mL)中的搅拌溶液中，添加三氯乙腈和DBU，并将溶液在室温下搅拌2小时。去除溶剂，并通过硅胶快速柱色谱法纯化残余物，得到亚氨酸酯产物。将(4-羟苯基)氨基甲酸苯甲酯(1.2mmol)和4A分子筛(1g)于无水DCM(10mL)中的搅拌溶液冷却至-40℃，随后将BF3(OEt)2(0.1mmol)逐滴添加到溶液中。将亚氨酸酯供体(1mmol)于无水DCM中的溶液逐滴添加到以上混合物中并在-40℃下搅拌1小时。此后，将反应物逐渐升温至室温并再搅拌1小时。将溶液通过添加三乙胺淬灭，随后过滤并添加饱和NaHCO3水溶液且用DCM萃取。将有机层经MgSO4干燥并蒸发至干燥。通过硅胶快速柱色谱法纯化残余物，得到化合物51(72％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.40-7.28(m,18H),7.19(d,J＝7.9Hz,2H),7.10(d,J＝8.1Hz,2H),7.00(d,J＝8.1Hz,2H),5.57-5.55(m,2H),5.12(s,2H),4.91(d,J＝10.5Hz,1H),4.80(d,J＝10.5Hz,1H),4.69(d,J＝10.5Hz,1H),4.65(d,J＝10.5Hz,1H),4.53(d,J＝10.5Hz,1H),4.46(d,J＝10.5Hz,1H),4.22(dd,J＝9.4,3.6Hz,1H),4.07-4.04(t,J＝9.7Hz,1H),3.93(d,J＝9.5Hz,1H),3.83(dd,J＝10.9,3.9Hz,1H),3.68(d,J＝10.8Hz,1H),2.21(s,3H)。13C NMR(150MHz,CDCl3):170.44,156.25,154.62,138.27,138.04,137.82,136.51,132.71,129.79,128.50,128.43,128.31,128.27,128.10,128.08,127.83,127.80,127.64,127.60,116.63,96.13,77.95,76.66,75.22,74.00,73.34,71.99,71.92,68.55,68.5,66.63,21.09。C43H43NO10[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：718.3016，实验值718.3041。
化合物52.
向51(0.6mmol)于MeOH中的搅拌溶液中添加NaOMe(0.1当量)，并将所得溶液在室温下搅拌1小时。将混合物通过IR-120中和，过滤并在真空中浓缩至干燥。随后将脱乙酰化产物溶解于无水DCM(5mL)中并添加4A分子筛(0.5g)。将溶液冷却至-40℃，随后将BF3(OEt)2(0.05mmol)逐滴添加到其中。将亚氨酸酯供体(0.5mmol)于无水DCM中的溶液逐滴添加到以上混合物中并在-40℃下搅拌1小时。此后，将反应物逐渐升温至室温并再搅拌1小时。将溶液通过添加三乙胺淬灭，随后过滤并添加饱和NaHCO3水溶液且用DCM萃取。将有机层经MgSO4干燥并蒸发至干燥。随后将产物溶解于MeOH中，添加NaOMe(0.1当量)，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。将混合物通过IR-120中和，过滤并在真空中浓缩至干燥。通过硅胶快速柱色谱法纯化残余物，得到化合物52(69％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.36-7.25(m,25H),7.22-7.13(m,10H),6.99-6.93(m,4H),5.66(s,1H),5.17(s,1H),5.06(s,2H),4.86(d,J＝10.5Hz,1H),4.79(d,J＝10.5Hz,1H),4.73,(s,2H),4.65(d,J＝10.5Hz,1H),4.58-4.57(m,2H),4.55-4.52(m,2H),4.47-4.43(m,3H),4.19-4.14(m,2H),3.99-3.96(m,2H),3.88(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),3.84-3.76(m,3H),3.67-3.63(m,3H)。13C NMR(150MHz,CDCl3):156.22,154.70,138.47,138.35,138.18,138.14,138.05,137.90,136.51,132.30,129.74,129.63,128.46,128.44,128.31,128.28,128.26,128.19,128.06,127.93,127.85,127.83,127.74,127.68,127.60,127.54,127.46,127.38,127.32,116.63,101.12,96.95,79.97,79.42,77.21,77.00,76.78,75.12,75.02,74.66,74.45,74.33,73.23,73.16,72.44,72.41,72.16,71.69,68.99,68.45,66.57。C68H70NO13[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：1108.4847，实验值1108.4819。
化合物53.
添加52(0.3mmol)于具有4A分子筛(0.25g)的无水DCM(2.5mL)中的搅拌溶液。将溶液冷却至-40℃，随后将BF3(OEt)2(0.03mmol)逐滴添加到其中。将亚氨酸酯供体(0.3mmol)于无水DCM中的溶液逐滴添加到以上混合物中并在-40℃下搅拌1小时。此后，将反应物逐渐升温至室温并再搅拌1小时。将溶液通过添加三乙胺淬灭，随后过滤并添加饱和NaHCO3水溶液且用DCM萃取。将有机层经MgSO4干燥并蒸发至干燥。通过硅胶快速柱色谱法纯化残余物，得到三糖产物。随后将产物溶解于MeOH中，添加NaOMe(0.1当量)，并将所得溶液在室温下搅拌2小时。将混合物通过IR-120中和，过滤并在真空中浓缩至干燥。随后将化合物溶解于MeOH(2mL)中，并添加10％ Pd-C(30mg)且在H2气氛下剧烈搅拌过夜。将溶液通过硅藻土过滤并浓缩至干燥，得到化合物53(60％)。1H NMR(600MHz,D2O)δ7.03(d,J＝9.0Hz,2H),6.83(d,J＝9.0Hz,2H),5.09(s,1H),4.81(s,1H),3.94-3.55(m,16H),3.48(t,J＝9.6Hz,1H),3.29-3.27(m,1H)。13C NMR(150MHz,D2O):151.36,143.37,121.20,120.67,101.59,101.23,96.33,78.46,75.34,74.69,73.51,73.11,72.97,72.52,71.53,69.28,69.14,68.90,65.51,63.26,62.91。C24H38NO16[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：596.2191，实验值596.2044。
化合物54.
向含化合物53(0.02mmol)的DMF(0.2mL)中添加EDC(0.02mmol)、HOBt(0.02mmol)、DMAP(0.02mmol)、三甲胺(0.04mmol)和CT(PEG)12(0.02mmol)，并将所得溶液在氮气下在室温下搅拌12小时。将混合物在真空中浓缩至干燥，并通过Bio-Gel P-2凝胶用H2O作为洗脱剂纯化粗产物，得到54(58％)。1H NMR(600MHz,D2O):7.03(d,J＝9.2Hz,2H),6.82(d,J＝9.2Hz,2H),5.09(s,1H),4.81(s,1H),3.84-3.46(m,65H),3.30-3.26(m,1H),2.65(t,J＝6.5Hz,2H),2.52(s,2H)。13C NMR(150MHz,D2O):173.22,151.36,143.37,121.37,120.59,101.20,101.67,97.04,79.17,76.06,75.40,75.22,74.23,73.69,73.23,72.60,72.45,72.22,71.68,71.21,69.85,69.61,63.97,38.52,26.08。C51H90NO29S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值：1212.5319，实验值1212.5146。
聚合物囊泡的制备.
在本实例中，制备包封mRNA以形成用于递送的mRNA-聚合物纳米粒子(PNP)的本公开的聚合物囊泡。术语“PNP”与“聚合物囊泡”可互换使用以描述本公开的聚合物囊泡。示范性PNP包括I2-P1/P5 mRNA-PNP、I3-P1/P5 mRNA-PNP、I4-P1/P5 mRNA-PNP、I5-P1/P5 mRNA-PNP、I6-P1/P5 mRNA-PNP、I7-P1/P5 mRNA-PNP、I8-P1/P5 mRNA-PNP、I9-P1/P5 mRNA PNP和I10-P1/P5 mRNA PNP，其绘示于图1B中。
WT刺突DNA构建.pMRNAXP mRNA合成载体获自系统生物科学(SystemBiosciences)。将具有K986P和K987P突变(2P)的WT(武汉/WH01/2019病毒株)刺突DNA序列针对智人进行密码子优化。1将pMRNAXP载体在37℃下用EcoRI和BamHI消化1小时。通过KODOneTM PCR主混合物(东洋纺生物科技(TOYOBO Bio-Technology))扩增刺突蛋白的DNA序列。通过Wizard SV凝胶和PCR清除系统(普洛麦格(Promega))清除线性化pMRNAXP载体和刺突蛋白DNA的PCR片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(克隆科技公司(ClontechLaboratories,Inc.))将刺突蛋白DNA的PCR片段克隆到线性化pMRNAXP载体中。将克隆混合物转换到One ShotTMTOP10化学态大肠杆菌(E.coli)(InvitrogenTM)并在37℃下孵育过夜。使用Quick Taq HSDyeMix(东洋纺生物科技)针对成功构建进行筛选。针对菌落PCR设计插入特异性引物和主链特异性引物。通过移液管尖端选择单个克隆进行PCR。使用琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物。选择可能的候选物并通过DNA测序进行分析。
聚合物的合成.根据公开的程序进行聚合过程，如傅佳奇等人,《美国化学会志》2015137(37),12153-12160中所描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在适用情况下作出修改。简单地说，制备单体(即，增长剂，2M于DMF中)、引发剂(50mM于DMF中，新鲜制备)、终止剂(碘乙酰胺，0.5M于H2O中，新鲜制备)和三乙醇胺(TEOA)缓冲液(1M，pH＝7.0)的储备溶液。将引发剂添加到80μL混合缓冲液(DMF/TEOA＝1/1)和10μL单体储备溶液中(对于杂聚物P1/P3、P2/P3、P1/P4、P2/P4、P1/P5和P2/P5，使用1:1的v/v比)。参见图1A。在室温下搅拌30分钟之后，通过添加1.9mL终止剂储备溶液淬灭聚合反应。在同一天将所得聚合物针对H2O进行透析。将溶液冻干并将聚合物保持在-20℃下。对于体外和体内实验，将引发剂与5％ IP混合，随后进行上文所提及的相同方案。
对于mRNA-PNP的配制，使用自组装过程将mRNA包封于相应的聚合物中；即，将乙醇相中的聚合物(10mg/mL)与pH 4.0的mRNA水溶液(1mg/mL)以3:1的N/P比混合。参见图1B。使用Micro Float-A-Lyzer(10kDa MWCO，斯百全(spectrum lab))在4℃下针对PBS缓冲液(pH7.4)透析mRNA-PNP过夜，并存储于-40℃下直到进一步使用。
聚合物囊泡的表征.为了检查mRNA-聚合物复合物的形态，我们首先将P1聚合物与mRNA混合，并且发现其形成接近球形的纳米粒子。P1/P5共聚物与mRNA的复合物呈脂质体样。聚合物可能形成具有正电荷的层，所述层可包封mRNA并通过两性离子的接合促进随后的细胞摄取。
通过凝胶渗透色谱法(GPC)表征分子量和聚合指数。聚合物在GPC色谱图中显示单峰但相当宽的分子量分布，并在相对较短的洗脱时间下洗脱，指示其聚合状态。mRNA-PNP(P1/P5)的峰值分子量为10.2kDa(PDI＝1.33)。
实例2：聚合物囊泡的包封和转染效率
为了鉴别用于有效细胞内递送GFP-mRNA的最佳聚合物作为模型，通过不同增长剂的共聚合来合成均聚物和杂聚物，并评估其在HEK293T细胞中的包封能力和转染效率。
经包封的mRNA的定量.
通过Quant-iTTM RiboGreenTM RNA试剂和试剂盒(Thermo ScientificTM)来测定包封效率。将制备的mRNA聚合物囊泡(mRNA-PNP)用10mM GSH处理过夜。随后，将溶液用1×TE缓冲液稀释250倍，并用TE缓冲液或含有2％ Triton X-100的TE缓冲液再稀释2倍。在含有1％ Triton X-100的TE或TE缓冲液中将mRNA制备为100、50、25、12.5和0ng/ml，以建立标准曲线。在37℃下孵育10分钟之后，将Quant-iTTM RiboGreenTM RNA试剂添加到孔中。通过Plus(BMG Labtech)测量荧光强度。
结果.所有含有胍基的共聚物均能够包封GFP-mRNA。特定地说，具有三价胍部分的I1-P2/P3、I1-P2/P4和I1-P2/P5共聚物展现更高的包封mRNA的能力并且与传统转染剂聚乙烯亚胺(polyethyleneimine；PEI)的结果相当。参见图2A。
配制WT刺突mRNA以形成mRNA-PNP.为了获得WT刺突mRNA，根据制造商的方案，在37℃下通过使用具有1μL DNA模板的TOOLS Ultra高保真DNA聚合酶(百拓有限公司(BIOTOOLSCo.,Ltd.))在mMESSAGE mMACHINETM试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific))中扩增含有T7启动子、50个非翻译区、30个非翻译区、S-2P和poly(A)尾信号序列的线性DNA，持续1小时。根据制造商的方案通过RNA清除试剂盒(拜力(BioLabs))纯化mRNA并存储于-80℃下直到进一步使用。对于mRNA-PNP的配制，使用自组装过程将mRNA包封于相应的聚合物中；即，将乙醇相中的聚合物(10mg/mL)与pH 4.0的mRNA水溶液(1mg/mL)以不同的N/P比混合。使用Micro Float-A-Lyzer(10kDa MWCO，斯百全)在4℃下针对PBS缓冲液(pH 7.4)透析mRNA-PNP过夜，并存储于-40℃下直到进一步使用。
结果.结果显示，P1/P5共聚物在1、5、10或20的N/P比下展现极佳的捕捉刺突mRNA的能力(图3A)，并且所得mRNA-P1/P5共聚物复合物的平均粒径为约127nm，这是由CryoEM、TEM和动态光散射(DLS)分析揭露的(图3B)。所测量的ζ电位为约-4.2mV。针对以下实验选择N/P比为3以确保完全包封。mRNA的释放和翻译可归因于GSH介导的聚合物降解，因为其以时间依赖性方式在10mM GSH存在下发生(数据未展示)。
HEK293T细胞转染.
包封GFP-mRNA的聚合物囊泡的转染.接下来，我们通过使用不同的共聚物评估GFP-mRNA在HEK293T细胞中的转染效率。将HEK293T细胞于2.5mL DMEM培养基中以5×105个细胞/孔接种到6孔板中。通过上述程序将1μg GFP mRNA或3μg WT刺突mRNA与相应的聚合物一起配制，随后添加到细胞中。转染后18小时，分别通过荧光显微法和蛋白质印记法(western blotting)监测GFP和刺突表达。对于WB，用200μLRIPA溶解缓冲液(包括蛋白酶抑制剂)溶解含有刺突蛋白的细胞，并孵育10分钟。随后将细胞涡旋，离心，并用多克隆抗SARS-CoV-2S蛋白抗体(1:5000，1％ BSA)和HRP结合的抗兔抗体(1:10000)通过蛋白质印记法来分析。通过化学发光HRP底物来检测刺突蛋白，并通过反式照明器(FUJIFILM LAS3000)进行可视化。
结果.结果表明共聚物P1展现与传统转染剂聚乙烯亚胺(PEI)相当的转染HEK293T细胞的能力，而杂聚物P1/P4、P2/P4、P1/P5和P2/P5展示优越的转染效率并且能够释放mRNA以翻译为GFP。特定地说，含有两性离子基团的聚合物P1/P5和P2/P5(图2B)是高效的，这可能是由于如上文所描述的膜融合。与传统转染剂PEI相比，所有测试的聚合物囊泡展现对细胞存活率的影响更小，并且没有一者展现明显的细胞毒性(数据未展示)。
包封WT刺突mRNA的聚合物囊泡的转染.随后，我们在HEK293T细胞中转染刺突mRNA-P1/P5复合物(3μg)并进行蛋白质印记法。在转染后48小时之后，用刺突特异性抗体通过蛋白质印记法分析细胞的刺突蛋白翻译。与作为阴性对照的刺突mRNA(第一泳道)相比，观察到对应于SARS-CoV-2刺突蛋白的约250kDa处的显著条带(第二泳道)(图3C)。这一研究证实P1/P5共聚物是用于体外mRNA转染的有效纳米载体。
mRNA-PNP在细胞中的位置.
为了观察mRNA-PNP在细胞中的位置，由P1/P4/P5合成经FITC标记的聚合物，其中FITC通过P4上的胺基团与聚合物缀合。如图4中所展示，溶酶体与mRNA-PNP(I1-P1/P4/P5)的共定位低于mRNA-PNP(I1-P1/P4)的共定位，指示烷基化两性离子残基可显著改进膜融合和溶酶体逃逸。
实例3：靶向(选择性)递送
为了将mRNA疫苗选择性递送到抗原呈递细胞(APC)，尤其树突细胞，我们设计了具有被凝集素受体(例如Siglec-1、Siglec-2、Siglec-5/E和DC-SIGN)识别的不同聚糖头的引发剂，所述凝集素受体主要在DC和巨噬细胞上表达。为了评估经由Siglecs的mRNA-PNP摄取，我们比较了mRNA-PNP至T细胞、B细胞和骨髓来源的树突细胞(bone marrow-deriveddendritic cell；BMDC)的结合和内化。
方法
脾细胞制备和BMDC培养.为了制备脾细胞，将小鼠脾脏用玻璃载片的磨砂端均质化并用RBC溶解缓冲液(西格玛(Sigma))处理以消耗红细胞(red blood cell；RBC)，随后通过细胞过滤器(碧迪生物科学(BD Biosciences))。如所描述制备骨髓来源的树突细胞(BMDC)。3简单地说，从小鼠股骨和胫骨分离骨髓并用RBC溶解缓冲液(西格玛奥德里奇)处理以消耗RBC。随后将细胞以2×105个细胞/毫升的密度在RPMI-1640中培养，所述RPMI-1640含有10％热灭活FBS(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、1％青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycin)(赛默飞世尔科技)、50μM 2-巯基乙醇(赛默飞世尔科技)和20ng/ml重组小鼠GM-CSF(伊碧生物科学(eBioscience))。在第3天向细胞补充等体积的上文所描述的完全培养基，并在第6天用一半体积的培养基更新。在第8天，收集悬浮细胞。
PNP对脾细胞和BMDC的处理.将脾细胞或BMDC与1:2000mRNA-PNP(稀释10mg/mL)在RPMI-1640中在37℃下一起孵育24小时。用Fc受体结合抑制剂(克隆：93，伊碧生物科学)阻断细胞20分钟。将脾细胞用针对CD3的抗体(克隆：17A2，BV421缀合的，百进(Biolegend))、针对CD19的抗体(克隆：1D3，PECy7缀合的，碧迪生物科学)染色。将BMDC用针对CD11c的抗体(克隆N418 APC缀合的，百进)染色。使用FACSC和流式细胞仪(碧迪生物科学)分析标记的细胞。
C2C12细胞培养.小鼠肌肉成肌细胞细胞系C2C12购自中国台湾地区生物资源保存和研究中心(Taiwan's Bioresource Collection and Research Center,China)。将C2C12细胞在补充有10％ FBS和1×抗生素-抗真菌剂的高葡萄糖DMEM(ATCC)中培养。将细胞在37℃下在5％ CO2和潮湿气氛控制下孵育。每2至3天更换培养基。
聚合物囊泡对C2C12的处理.使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(基伯克(Gibco))将培养的C2C12成肌细胞从培养皿中分离，并用含有10％ FBS的生长培养基中和。将mRNA-PNP(I1-P1/P4-FITC-P5)或mRNA-PNP(I9-P1/P4-FITC/P5)添加到生长培养基中的200μLC2C12细胞(2×105个细胞)中，以达到原始储备液(10mg/mL)的1:1000、1:2000、1:4000或1:8000倍的最终稀释度。测量三个时间点：5分钟、1小时和24小时。
流式细胞术.在与mRNA-PNP一起孵育之后，用冰冷的FACS缓冲液(具有0.1％叠氮化钠的含1％ FBS的1×DPBS)洗涤BMDC细胞，并与纯化的抗小鼠CD16/32抗体(百进)一起在FACS缓冲液中在冰上孵育20分钟，随后用FACS缓冲液洗涤。将BMDC在4℃下用APC抗小鼠CD11c抗体(BioLengend)染色30分钟，且用FACS缓冲液洗涤。最后，将BMDC用碘化丙啶(西格玛奥德里奇)染色。将C2C12细胞离心并用FACS缓冲液洗涤。将细胞用碘化丙啶染色。流式细胞术在FACSCanto流式细胞仪(碧迪生物科学)上进行。
经由ELISA进行聚糖-PNP和DC-SIGN结合测定.为了评估DC-SIGN与经甘露糖苷修饰的PNP的结合，将ELISA板在PBS中在4℃下分别用mRNA-PNP(I5-P1/P5)、mRNA-PNP(I6-P1/P5)、mRNA-PNP(I7-P1/P5)、mRNA-PNP(I8-P1/P5)、mRNA-PNP(I9-P1/P5)或mRNA-PNP(I10-P1/P5)(10mg/mL)涂布过夜。将板与经过稀释的DC-SIGN ECD(HEPES缓冲液中15至0.075nM，所述HEPES缓冲液含有20mM HEPES、150mM NaCl、10mM CaCl2、0.1％ BSA)在pH 7.4、6.0和5.0下在室温下一起孵育1小时。使用HRP缀合的抗DC-SIGN(B2)IgG抗体(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology))检测到结合的DC-SIGN ECD。在室温下孵育1小时之后，将板用四甲基联苯胺(tetramethlybenzidine，TMB)处理10分钟。在使用酶标仪向板中添加0.5M硫酸之后，在450nm处测量光学密度。使用GraphPad Prism使用非线性回归曲线拟合总结合来计算表观Kd。
经由ELISA对DC-SIGN-Fc、MMR-Fc、MINCLE-Fc、凝集素-2-Fc和兰格素-Fc的聚糖-PNP结合测定.为了评估受体蛋白与经甘露糖苷修饰的PNP的结合，将ELISA板在PBS中在4℃下分别用mRNA-PNP(I1-P1/P5)、mRNA-PNP(I8-P1/P5)、mRNA-PNP(I9-P1/P5)或mRNA-PNP(I10-P1/P5)(10mg/mL)涂布过夜。将板与经过稀释的DC-SIGN-Fc、MMR-Fc、MINCLE-Fc、凝集素-2-Fc和兰格素-Fc(0.625μg/mL，于缓冲液中)在pH 7.4下在室温下一起孵育1小时。使用HRP缀合的抗Fc IgG抗体检测到结合的蛋白质。在室温下孵育1小时之后，将板用四甲基联苯胺(TMB)处理10分钟。在使用酶标仪向板中添加0.5M硫酸之后，在450nm处测量平均光学密度。
结果
通过流式细胞术评估，将FITC缀合的mRNA-PNP与每个细胞系一起孵育1小时。与不具有聚糖修饰的I1 mRNA-PNP相比，意图靶向Siglec-2的具有9BPCNeu5Ac缀合的N-聚糖的I2 mRNA-PNP展示出更高的所有APC的细胞摄取(图5)。特定地说，在这一实验中，与I1聚合物囊泡相比，I2聚合物囊泡展示BMDC、B细胞和T细胞摄取分别增加33.1％、32.6％和27.8％。通过使用I3和I4 mRNA-PNP分别靶向Siglec-5/E和Siglec-1获得了类似的结果，其中所有聚糖装饰的聚合物囊泡均展现出比无聚糖的mRNA-PNP更佳的所有APC的摄取。类似地，与I1-P1/P4-FITC-P5 mRNA-PNP相比，I9-P1/P4-FITC/P5 mRNA-PNP展现更高(约高1倍，图9)的C2C12肌肉细胞摄取。
如图6中所展示，与不具有聚糖头的I1聚合物囊泡(I1-P1/P4-FITC/P5)相比，具有芳基甘露糖头的I5聚合物囊泡(I5-P1/P4-FITC/P5)展现BMDC的细胞摄取高约34％(增加33.8％)。另一方面，当用聚合物囊泡处理时，具有不显著DC-SIGN表达的B细胞和T细胞仅展示荧光信号的轻微增加(分别增加16.2％和12.8％)。这一数据证明，树突细胞对mRNA-PNP(I5-P1/P4-FITC/P5)的有效内化和选择性摄取可通过DC-SIGN受体靶向实现。
在不同pH值下DC-SIGN与由I5-P1/P5、I6-P1/P5、I7-P1/P5、I8-P1/P5、I9-P1/P5和I10-P1/P5产生的mRNA-聚合物囊泡结合的评估显示，那些聚合物囊泡能够以低KD与DC-SIGN结合(表1)。来自I5-P1/P5、I8-P1/P5、I9-P1/P5和I10-P1/P5的mRNA-聚合物囊泡在pH7.4和5.0下以几乎相同的亲和力与DC-SIGN细胞外结构域(ECD)结合。相比之下，在较低pH下未检测到来自I6-P1/P5和I7-P1/P5的mRNA-聚合物囊泡的结合，这意味着在低pH值下与钙离子的配位降低。
表1
在不希望受理论束缚的情况下，这些结合结果表明芳基三甘露糖苷与酸性内体区室中的DC-SIGN相互作用。这类结合稳定性将增强DC-SIGN介导的信号传导和其与驻留在内体的铎样受体(例如TLR7)的信号传导的协同作用。具有芳基-甘露糖苷的PNP与DC-SIGN的强结合可归因于配体的密集显示，并且芳基可参与CH-π和疏水性相互作用。另外，对于受体靶向递送，配体通常与载体连接，并且载体与配体之间的距离通过间隔基的存在来调节。携带较长长度配体的mRNA-PNP(具有Man-Ar-PEG12的I8-P1/P5和具有Man-PEG12的I7-P1/P5)对DC-SIGN展示略高的亲和力。总体来说，具有芳基-三甘露糖苷的mRNA-PNP(I9-P1/P5)对DC-SIGN展现最高的亲和力和最低的KD。增加的亲和力可归因于聚合物中配体的群集效应和空间排列，并且芳基部分可促进其疏水性相互作用。
对DC-SIGN、巨噬细胞甘露糖受体(MMR)、MINCLE、凝集素-2和兰格素进行进一步的结合亲和力，以研究甘露糖基化mRNA-PNP的摄取是否取决于DC-SIGN。如图7中所展示，与I1相比，I8、I9和I10聚合物囊泡全部展示选择性结合。其中，与线性型芳基-三甘露糖苷I10相比，分支型芳基-三甘露糖苷I9对DC-SIGN展示更佳的偏好。I9对DC-SIGN呈现更具选择性结合的事实支持以下事实：DC对mRNA-I9-P1/P5的有效摄取更可能由DC-SIGN介导。
实例4：使用本公开的聚合物囊泡进行免疫接种
随后，我们评估具有或不具有芳基甘露糖苷头的WT刺突mRNA-PNP对疫苗接种和免疫反应的影响。
方法和免疫接种设计.
动物.Balb/c小鼠(8周)购自中国台湾地区实验动物中心(Laboratory AnimalCenter,Taiwan,China)。将所有小鼠维持在特定的无病原体环境中。对八周龄的Balb/c小鼠进行两次i.m.免疫接种，间隔2周。每次疫苗接种含有PBS(100μl)。在最后一次免疫接种后10天，对从免疫接种小鼠收集的血清进行ELISA分析。实验方案经中国台湾地区动物护理与使用委员会(Animal Care and Utilization Committee,Taiwan,China)批准(批准号22-08-1901)。
动物免疫接种.用含15μg mRNA-PNP的磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-bufferedsaline，PBS)对6至8周龄的BALB/c小鼠(n＝5)进行肌肉内免疫接种。在第0周对动物进行免疫接种并在第2周进行第二次疫苗接种加强免疫(图8A)，并且在第二次免疫接种后1周从每只小鼠收集血清样品。作为阳性对照，包括用刺突mRNA-LNP(包括当前mRNA疫苗制剂中常用的ALC-0315、DSPC、ALC-0159和胆固醇)处理的组。
血清IgG滴度的测量.使用ELISA测定小鼠血清的IgG滴度。将96孔ELISA板(葛莱娜第一生化(Greiner Bio-One))的每个孔在4℃下用pH 8.8下的100mM碳酸氢钠中的100ngSARS-CoV-2刺突蛋白(百普赛斯(ACROBiosystems))涂布过夜。将各孔在37℃下用200μl含5％脱脂牛奶的1×PBS阻断1小时并用200μl PBST(1×PBS，0.05％吐温20 (Tween 20)，pH7.4)洗涤三次。将2倍连续稀释的小鼠血清样品添加到各孔中，以在37℃下孵育2小时并用200μl PBST洗涤六次。在37℃下，将各孔与100μl HRP缀合的抗小鼠二级抗体(1:10000，于PBS中)一起孵育1小时并用200μl PBST洗涤六次。将100μl辣根过氧化酶底物(1-StepTMUltra TMB-ELISA底物溶液)(Thermo ScientificTM)添加到各孔中，随后添加100μl1M H2SO4。在孵育30分钟之后，使用SpectraMax M5测量吸光度(OD 450nm)。
假病毒中和测定.假病毒由中国台湾地区的RNAi核心设施使用与先前所描述的程序类似的程序构建。简单地说，携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假型慢病毒是通过用pCMV-ΔR8.91、pLAS2w.Fluc.Ppuro短暂转染HEK-293T细胞产生的。在转染前一天接种HEK-293T细胞，并且指定质粒使用TransITR-LT1转染试剂(维百奥(Mirus))递送到细胞中。在转染后16小时更新培养基并在48小时和72小时收集。通过以4,000×g离心10分钟去除细胞碎片，并使上清液通过0.45μm针筒过滤器(颇尔公司(Pall Corporation))。将假型慢病毒等分，随后存储在-80℃下。为通过AlarmaBlue测定(赛默飞世尔科技)估计慢病毒滴度，通过使用细胞存活率测定对有限稀释的慢病毒进行反应来估计SARS-CoV-2假型慢病毒的转导单位(TU)。简单地说，在慢病毒转导前一天将稳定地表达人ACE2基因的HEK-293T细胞接种于96孔板上。为了滴定假型慢病毒，将不同量的慢病毒添加到含有聚凝胺(最终浓度为8μg/ml)的培养基中。在37℃下在96孔板中以1,100×g进行自旋感染30分钟。在37℃下孵育细胞16小时之后，去除含有病毒和聚凝胺的培养基并用含有2.5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的新鲜完全DMEM替换。在嘌呤霉素处理48小时之后，去除培养基，并根据制造商说明书使用10％AlamarBlue试剂检测细胞存活率。未感染的细胞(无嘌呤霉素处理)的存活率设定为100％。通过绘制存活细胞与经过稀释的病毒剂量之间的关系来测定病毒滴度(转导单位)。对于中和测定，将热灭活血清或抗体进行连续稀释，并在DMEM中在37℃下与1,000TU的SARS-CoV-2假型慢病毒一起孵育1小时。随后在96孔板中用10,000个稳定地表达人ACE2基因的HEK-293T细胞接种混合物。在感染后16小时用新鲜的完全DMEM(补充有10％ FBS和100U/mL青霉素/链霉素)替换培养基并再连续培养48小时。通过使用Bright-Glo荧光素酶测定系统(普洛麦格)测定荧光素酶基因的表达水平。通过Tecan i-control(Infinite500)检测相对光单位(RLU)。使用公式(RLU对照-RLU血清)/RLU对照，将抑制百分比计算为经过稀释的血清的存在下的RLU减少与无血清对照的RLU值的比率。
结果
结果显示，I1-P1/P5聚合物囊泡处理和mRNA-LNP处理均可在第28天在血清中产生一万含量的抗刺突抗体。相比之下，I9-P1/P5聚合物囊泡处理能够产生约三万含量的抗刺突抗体，其至少高3倍(图8B)。随后测试血清中和假病毒介导的进入表达ACE2的细胞的能力。来自I1-P1/P5聚合物囊泡的抗血清水平与mRNA-LNP组类似；两者均低于2000。相比之下，I9-P1/P5聚合物囊泡组中观察到显著更高水平(超过6000)的中和抗体(图8C)，并且刺突特异性抗体滴度和假病毒中和活性良好相关。
示范性实施例
实施例1.一种用于形成聚合物囊泡的共聚物，其中所述共聚物包含：引发剂嵌段，其包含聚糖头；增长剂嵌段，其包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；和键联，其共价连接所述引发剂嵌段和所述增长剂嵌段，其中所述键联包含二硫键。
实施例2.如实施例1的共聚物，其中所述聚糖头包含末端甘露糖苷。
实施例3.如实施例1或实施例2的共聚物，其中所述聚糖头包含O-芳基甘露糖苷，所述O-芳基甘露糖苷包含任选取代的苯环。
实施例4.如实施例1至3中任一项的共聚物，其中所述聚糖头包含单甘露糖苷、二甘露糖苷或三甘露糖苷。
实施例5.如实施例4的共聚物，其中所述三甘露糖苷为线性或分支三甘露糖苷。
实施例6.如实施例5的共聚物，其中所述分支三甘露糖苷为α-1,3-α-1,6-三甘露糖苷。
实施例7.如实施例1至6中任一项的共聚物，其中所述引发剂嵌段进一步包含引发剂间隔基。
实施例8.如实施例7的共聚物，其中所述引发剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
实施例9.如实施例8的共聚物，其中所述饱和碳部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳(任选地，2至6个碳)。
实施例10.如实施例8或实施例9的共聚物，其中所述PEG部分包含2至72个(OCH2CH2)亚基。
实施例11.如实施例10的共聚物，其中所述PEG部分具有线性、分支或星形配置。
实施例12.如实施例1至11中任一项的共聚物，其中所述聚糖头被配置成结合树突细胞。
实施例13.如实施例12的共聚物，其中所述聚糖头被配置成选择性地结合DC-SIGN。
实施例14.如实施例13的共聚物，其中所述聚糖头被配置成在pH 7.4下以5至8000nM的范围内的KD结合DC-SIGN。
实施例15.如实施例14的共聚物，其中在pH 7.4下所述KD在5至500nM的范围内。
实施例16.如实施例13至15中任一项的共聚物，其中所述聚糖头被配置成在pH 5下以1至2000nM的范围内的KD结合DC-SIGN。
实施例17.如实施例16的共聚物，其中在pH 5下所述KD在1至600nM的范围内。
实施例18.如实施例1的共聚物，其中所述聚糖头包含9BPCNeu5Ac缀合的N-聚糖、Neu5Ac缀合的N-聚糖、9TCCNeu5Ac缀合的N-聚糖或其组合。
实施例19.如实施例18的共聚物，其中所述引发剂嵌段被配置成结合Siglec-2、Siglec-5/E、Siglec-1或其组合。
实施例20.如实施例1至19中任一项的共聚物，其中所述引发剂嵌段选自由以下组成的群组：
其中实心圆表示甘露糖苷，空心圆表示半乳糖，实心正方形表示GlcNAc，并且菱形表示Neu5Ac。
实施例21.如实施例1至20中任一项的共聚物，其中所述增长剂嵌段包含超过一个胍基。
实施例22.如实施例21的共聚物，其中所述增长剂嵌段包含三个胍基。
实施例23.如实施例1至22中任一项的共聚物，其中所述增长剂嵌段包含增长剂间隔基，所述增长剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
实施例24.如实施例23的共聚物，其中所述饱和碳部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳(任选地，2至6个碳)。
实施例25.如实施例23或实施例24的共聚物，其中所述PEG部分包含2至72个(OCH2CH2)亚基。
实施例26.如实施例25的共聚物，其中所述PEG部分具有线性、分支或星形配置。
实施例27.如实施例1至26中任一项的共聚物，其包含多个增长剂嵌段和多个键联，并且所述多个增长剂嵌段中的每个增长剂嵌段经由所述多个键联中的一者连接到所述增长剂嵌段中的至少另一个增长剂嵌段或所述引发剂嵌段。
实施例28.如实施例1至27中任一项的共聚物，其中所述增长剂嵌段为第一增长剂嵌段，所述键联为第一键联，并且所述共聚物进一步包含第二增长剂嵌段，所述第二增长剂嵌段经由第二键联连接到所述第一增长剂嵌段；其中所述第一增长剂嵌段和所述第二增长剂嵌段独立地包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；并且其中所述第二键联包含二硫键。
实施例29.如实施例28的共聚物，其中所述第一增长剂嵌段包含所述胍基，并且所述第二增长剂嵌段包含所述两性离子基团。
实施例30.如实施例28的共聚物，其中所述第一增长剂嵌段包含所述胍基，并且所述第二增长剂嵌段包含所述二亚乙基三胺。
实施例31.如实施例28至30中任一项的共聚物，其中所述共聚物进一步包含第三增长剂嵌段，其中所述第三增长剂嵌段经由包含二硫键的第三键联连接到所述第一增长剂嵌段或所述第二增长剂嵌段。
实施例32.如实施例1至31中任一项的共聚物，其中所述增长剂嵌段选自由以下组成的群组：
实施例33.如实施例32的共聚物，其包含至少两个增长剂嵌段，其中所述至少两个增长剂嵌段为(1)PB1和PB5，(2)PB1和PB4，(3)PB2和PB5，(4)PB2和PB5，或(5)P1、P4和P5。
实施例34.如实施例33的共聚物，其中所述引发剂嵌段和所述至少两个增长剂嵌段选自由以下组成的群组：IB5-PB1/PB5、IB5-PB1/PB4、IB5-PB2/PB5、IB5-PB2/PB4、IB5-PB1/PB4/PB5、IB6-PB1/PB5、IB6-PB1/PB4、IB6-PB2/PB5、IB6-PB2/PB4、IB6-PB1/PB4/PB5、IB7-PB1/PB5、IB7-PB1/PB4、IB7-PB2/PB5、IB7-PB2/PB4、IB7-PB1/PB4/PB5、IB8-PB1/PB5、IB8-PB1/PB4、IB8-PB2/PB5、IB8-PB2/PB4、IB8-PB1/PB4/PB5、IB9-PB1/PB5、IB9-PB1/PB4、IB9-PB2/PB5、IB9-PB2/PB4、IB9-PB1/PB4/PB5、IB10-PB1/PB5、IB10-PB1/PB4、IB10-PB2/PB5、IB10-PB2/PB4和IB10-PB1/PB4/PB5。
实施例35.一种聚合物囊泡，其包含界定内部空间的膜，其中所述膜包含如实施例1至34中任一项的共聚物。
实施例36.如实施例35的聚合物囊泡，其中所述共聚物占所述膜的至少50％、70％、80％、90％、95％或99％。
实施例37.如实施例35或实施例36的聚合物囊泡，其中所述膜将有效负载包封于其内。
实施例38如实施例37的聚合物囊泡，其中所述有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例39.如实施例38的聚合物囊泡，其中所述核酸为RNA或DNA。
实施例40.如实施例39的聚合物囊泡，其中所述有效负载编码多肽。
实施例41.如实施例37至40中任一项的聚合物囊泡，其中所述有效负载为免疫原性的，或所述有效负载为被配置用于编码免疫原性多肽或蛋白质的核酸。
实施例42.如实施例35至41中任一项的聚合物囊泡，其中所述共聚物为第一共聚物，并且所述膜进一步包含第二共聚物，其中所述第一共聚物和所述第二共聚物独立于实施例1至34中任一项。
实施例43.如实施例35至42中任一项的聚合物囊泡，其直径为0.001至5微米或0.01至5微米。
实施例44.如实施例35至43中任一项的聚合物囊泡，其中所述有效负载为第一有效负载，并且所述膜进一步包封第二有效负载。
实施例45.如实施例44的聚合物囊泡，其中所述第二有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例46.如实施例45的聚合物囊泡，其中所述第一有效负载和所述第二有效负载不同。
实施例47.一种制剂，其包含如实施例35至46中任一项的聚合物囊泡。
实施例48.如实施例47的制剂，其包含0.01至95％(w/w)的所述聚合物囊泡。
实施例49.如实施例47或实施例48的制剂，其中所述聚合物囊泡为第一聚合物囊泡，并且组合物进一步包含第二聚合物囊泡。
实施例50.如实施例49的制剂，其中所述第一聚合物囊泡和所述第二聚合物囊泡在尺寸、其形成膜的共聚物、包封于所述聚合物囊泡内的有效负载或其组合方面不同。
实施例51.如实施例47至50中任一项的制剂，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、佐剂或其组合。
实施例52.如实施例51的制剂，其中所述赋形剂包含溶剂、分散介质、稀释剂、分散液、悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶或其混合物。
实施例53.如实施例51或实施例52的制剂，其中所述佐剂包含C34、葡糖-C34、7DW8-5、C17、C23、C30、α-半乳糖苷神经酰胺、铝盐、角鲨烯、MF59或QS-21，可用于本公开的组合物中的一些疫苗中的佐剂的其它实例为氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸钾铝)、混合铝盐、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、AS03、MF59和CpG 1018或其组合。
实施例54.一种用于制备聚合物囊泡的试剂盒，其包含：第一试剂，其包含引发剂，其中所述引发剂包含聚糖头和引发剂连接部分；和第二试剂，其包含增长剂，其中所述增长剂包含官能性部分和增长剂连接部分，其中所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；并且其中所述引发剂连接部分被配置成经由包含二硫键的键联与所述增长剂连接部分偶合。
实施例55.如实施例54的试剂盒，其中所述聚糖头包含末端甘露糖苷。
实施例56.如实施例54或实施例55的试剂盒，其中所述聚糖头包含O-芳基甘露糖苷。
实施例57.如实施例54至56中任一项的试剂盒，其中所述聚糖头包含单甘露糖苷、二甘露糖苷或三甘露糖苷。
实施例58.如实施例57的试剂盒，其中所述三甘露糖苷为线性或分支三甘露糖苷。
实施例59.如实施例58的试剂盒，其中所述分支三甘露糖苷为α-1,3-α-1,6-三甘露糖苷。
实施例60.如实施例54至59中任一项的试剂盒，其中所述引发剂进一步包含引发剂间隔基，所述引发剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
实施例61.如实施例60的试剂盒，其中所述饱和碳部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳(任选地，2至6个碳)。
实施例62.如实施例61的试剂盒，其中所述PEG部分包含2至72个(OCH2CH2)亚基。
实施例63.如实施例62的试剂盒，其中所述PEG部分具有线性、分支或星形配置。
实施例64.如实施例54至63中任一项的试剂盒，其中所述聚糖头被配置成结合树突细胞。
实施例65.如实施例64的试剂盒，其中所述聚糖头被配置成选择性地结合DC-SIGN。
实施例66.如实施例65的试剂盒，其中所述聚糖头被配置成在pH 7.4下以5至8000nM的范围内的KD结合DC-SIGN。
实施例67.如实施例66的试剂盒，其中在pH 7.4下所述KD在5至500nM的范围内。
实施例68.如实施例65至67中任一项的试剂盒，其中所述聚糖头被配置成在pH 5下以1至800nM的范围内的KD结合DC-SIGN。
实施例69.如实施例68的试剂盒，其中在pH 5下所述KD在1至600nM的范围内。
实施例70.如实施例54至69中任一项的试剂盒，其中所述聚糖头包含9BPCNeu5Ac缀合的N-聚糖(I2)、Neu5Ac缀合的N-聚糖(I3)、9TCCNeu5Ac缀合的N-聚糖(I4)或其组合。
实施例71.如实施例70的试剂盒，其中所述聚糖头被配置成结合Siglec-2、Siglec-5/E、Siglec-1或其组合。
实施例72.如实施例54至71中任一项的试剂盒，其中所述引发剂连接部分为硫醇基团或二硫杂环戊烷基团。
实施例73.如实施例54至72中任一项的试剂盒，其中所述引发剂选自由以下组成的群组：
实施例74.如实施例54至73中任一项的试剂盒，其中所述增长剂包含超过一个胍基。
实施例75.如实施例74的试剂盒，其中所述增长剂包含三个胍基。
实施例76.如实施例54至75中任一项的试剂盒，其中所述增长剂进一步包含增长剂间隔基，所述增长剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
实施例77.如实施例76的试剂盒，其中所述饱和碳部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳(任选地，2至6个碳)。
实施例78.如实施例76或实施例77的试剂盒，其中所述PEG部分包含2至72个(OCH2CH2)亚基。
实施例79.如实施例78的试剂盒，其中所述PEG部分为线性PEG。
实施例80.如实施例54至79中任一项的试剂盒，其中所述第二试剂的增长剂为第一增长剂，并且其中所述第二试剂进一步包含第二增长剂，或所述试剂盒进一步包含第三试剂，所述第三试剂包含所述第二增长剂；并且其中所述第一增长剂和所述第二增长剂独立地包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合。
实施例81.如实施例80的试剂盒，其中所述第一增长剂包含所述胍基，并且所述第二增长剂包含所述两性离子基团。
实施例82.如实施例80的试剂盒，其中所述第一增长剂包含所述胍基，并且所述第二增长剂包含所述二亚乙基三胺。
实施例83.如实施例54至82中任一项的试剂盒，其中所述增长剂连接部分为硫醇基团或二硫杂环戊烷基团。
实施例84.如实施例54至83中任一项的试剂盒，其中所述增长剂选自由以下组成的群组：
实施例85.如实施例54至84中任一项的试剂盒，其中所述第一试剂和所述第二试剂容纳于同一容器中。
实施例86.如实施例54至84中任一项的试剂盒，其中所述第一试剂和所述第二试剂容纳于单独的容器中。
实施例87.如实施例54至86中任一项的试剂盒，其进一步包含有效负载，其中所述有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例88.如实施例87的试剂盒，其中所述核酸为RNA或DNA。
实施例89.如实施例88的试剂盒，其中所述有效负载编码多肽。
实施例90.如实施例87至89中任一项的试剂盒，其中所述有效负载为免疫原性的，或所述有效负载为被配置用于编码免疫原性多肽或蛋白质的核酸。
实施例91.一种在个体中靶向递送有效负载的方法，其包含向所述个体施用有效量的包含聚合物囊泡的药物制剂，其中所述聚合物囊泡包含包封所述有效负载的膜，并且其中所述膜包含如实施例1至34中任一项的共聚物。
实施例92.如实施例91的方法，其中所述共聚物占所述膜的至少50％、70％、80％、90％、95％或99％。
实施例93.如实施例92的方法，其中所述共聚物为第一共聚物，并且所述膜进一步包含第二共聚物，其中所述第一共聚物和所述第二共聚物独立于实施例1至34中任一项。
实施例94.如实施例91至93中任一项的方法，其中所述有效负载为核酸、化合物、肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例95.如实施例94的方法，其中所述核酸为RNA或DNA。
实施例96.如实施例95的方法，其中所述有效负载编码多肽。
实施例97.如实施例91至96中任一项的方法，其中所述有效负载为免疫原性的，或所述有效负载为被配置用于编码免疫原性多肽或蛋白质的核酸。
实施例98.如实施例91至97中任一项的方法，其中所述有效负载为第一有效负载，并且所述膜进一步包封第二有效负载。
实施例99.如实施例98的方法，其中所述第二有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例100.如实施例99的方法，其中所述第一有效负载和所述第二有效负载不同。
实施例101.一种预防或治疗个体中的疾病的方法，其包含向所述个体施用有效量的包含聚合物囊泡的药物制剂，其中所述聚合物囊泡包含膜，其中所述膜包含如实施例1至34中任一项的聚合物组分；和包封于所述膜内的有效负载；并且其中所述有效负载为治疗剂或衍生治疗剂。
实施例102.如实施例101的方法，其中所述聚合物组分占所述膜的至少50％、70％、80％、90％、95％或99％。
实施例103.如实施例101或实施例102的方法，其中所述有效负载为核酸、化合物、肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例104.如实施例103的方法，其中核酸为RNA或DNA。
实施例105.如实施例104的方法，其中所述有效负载编码多肽。
实施例106.如实施例101至105中任一项的方法，其中所述有效负载为第一有效负载，并且所述膜进一步包封第二有效负载。
实施例107.如实施例106的方法，其中所述第二有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例108.如实施例107的方法，其中所述第一有效负载和所述第二有效负载不同。
实施例109.如实施例101至108中任一项的方法，其中以初始剂量施用所述聚合物囊泡，随后施用一次、两次、三次、四次、五次或更多次加强剂量。
实施例110.如实施例109的方法，其中在所述初始剂量之后约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月或约六个月或更长时间施用所述加强剂量。
实施例111.如实施例101至110中任一项的方法，其中所述有效量在约5μg至1000μg的范围内。
实施例112.一种增强适应性免疫反应的方法，其包含向个体施用有效量的包含聚合物囊泡的药物制剂；其中所述聚合物囊泡包含包封有效负载的膜，并且其中所述膜包含如实施例1至34中任一项的共聚物；其中所述有效负载为免疫原性的或衍生免疫原性生物分子。
实施例113.如实施例112的方法，其中所述聚合物组分占所述膜的至少50％、70％、80％、90％、95％或99％。
实施例114.如实施例83或实施例84的方法，其中所述有效负载为核酸、化合物、肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例115.如实施例85的方法，其中核酸为RNA或DNA。
实施例116.如实施例112至115中任一项的方法，其中所述生物分子为多肽或蛋白质。
实施例117.如实施例112至116中任一项的方法，其中所述有效负载为第一有效负载，并且所述膜进一步包封第二有效负载。
实施例118.如实施例117的方法，其中所述第二有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
实施例119.如实施例118的方法，其中所述第一有效负载和所述第二有效负载不同。
实施例120.如实施例112至119中任一项的方法，其中以初始剂量施用所述聚合物囊泡，随后施用一次、两次、三次、四次、五次或更多次加强剂量。
实施例121.如实施例120的方法，其中在所述初始剂量之后约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月或约六个月或更长时间施用所述加强剂量。
实施例122.如实施例112至121中任一项的方法，其中所述有效量在约5μg至1000μg的范围内。

Claims (30)

1.一种用于形成聚合物囊泡的共聚物，其中所述共聚物包含：
引发剂嵌段，其包含聚糖头；
增长剂嵌段，其包含官能性部分，所述官能性部分包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；和
键联，其共价连接所述引发剂嵌段和所述增长剂嵌段，其中所述键联包含二硫键。
2.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述聚糖头包含末端甘露糖苷。
3.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述聚糖头包含O-芳基甘露糖苷，所述O-芳基甘露糖苷包含任选取代的苯环。
4.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述聚糖头包含单甘露糖苷、二甘露糖苷或三甘露糖苷。
5.根据权利要求4所述的共聚物，其中所述三甘露糖苷为α-1,3-α-1,6-三甘露糖苷。
6.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述引发剂嵌段进一步包含引发剂间隔基，所述引发剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
7.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述聚糖头被配置成结合树突细胞。
8.根据权利要求7所述的共聚物，其中所述聚糖头被配置成选择性地结合DC-SIGN。
9.根据权利要求8所述的共聚物，其中所述聚糖头被配置成在pH 7.4下以5至8000nM的范围内的KD结合DC-SIGN。
10.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述聚糖头包含9BPCNeu5Ac缀合的N-聚糖、Neu5Ac缀合的N-聚糖、9TCCNeu5Ac缀合的N-聚糖或其组合。
11.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述引发剂嵌段选自由以下组成的群组：
其中实心圆表示甘露糖苷，空心圆表示半乳糖，实心正方形表示GlcNAc，并且菱形表示Neu5Ac。
12.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述增长剂嵌段包含超过一个胍基。
13.根据权利要求12所述的共聚物，其中所述增长剂嵌段包含三个胍基。
14.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述增长剂嵌段包含增长剂间隔基，所述增长剂间隔基包含饱和碳部分、聚乙二醇(PEG)部分或其组合。
15.根据权利要求1所述的共聚物，
其中所述增长剂嵌段为第一增长剂嵌段，所述键联为第一键联，并且所述共聚物进一步包含第二增长剂嵌段，所述第二增长剂嵌段经由第二键联连接到所述第一增长剂嵌段；
其中所述第一增长剂嵌段和所述第二增长剂嵌段独立地包含胍基、两性离子基团、二亚乙基三胺或其组合；并且
其中所述第二键联包含二硫键。
16.根据权利要求15所述的共聚物，其中所述第一增长剂嵌段包含所述胍基，并且所述第二增长剂嵌段包含所述两性离子基团；或其中所述第一增长剂嵌段包含所述胍基，并且所述第二增长剂嵌段包含所述二亚乙基三胺。
17.根据权利要求1所述的共聚物，其中所述增长剂嵌段选自由以下组成的群组：
18.根据权利要求17所述的共聚物，其包含至少两个增长剂嵌段，其中所述至少两个增长剂嵌段为(1)PB1和PB5，(2)PB1和PB4，(3)PB2和PB5，(4)PB2和PB5，或(5)P1、P4和P5。
19.根据权利要求18所述的共聚物，其中所述引发剂嵌段和所述至少两个增长剂嵌段选自由以下组成的群组：IB5-PB1/PB5、IB5-PB1/PB4、IB5-PB2/PB5、IB5-PB2/PB4、IB5-PB1/PB4/PB5、IB6-PB1/PB5、IB6-PB1/PB4、IB6-PB2/PB5、IB6-PB2/PB4、IB6-PB1/PB4/PB5、IB7-PB1/PB5、IB7-PB1/PB4、IB7-PB2/PB5、IB7-PB2/PB4、IB7-PB1/PB4/PB5、IB8-PB1/PB5、IB8-PB1/PB4、IB8-PB2/PB5、IB8-PB2/PB4、IB8-PB1/PB4/PB5、IB9-PB1/PB5、IB9-PB1/PB4、IB9-PB2/PB5、IB9-PB2/PB4、IB9-PB1/PB4/PB5、IB10-PB1/PB5、IB10-PB1/PB4、IB10-PB2/PB5、IB10-PB2/PB4和IB10-PB1/PB4/PB5。
20.一种聚合物囊泡，其包含界定内部空间的膜，其中所述膜包含根据权利要求1至19中任一权利要求所述的共聚物。
21.根据权利要求20所述的聚合物囊泡，其中所述膜将有效负载包封于其内。
22.根据权利要求21所述的聚合物囊泡，其中所述有效负载为核酸、化合物、多肽、蛋白质、聚糖或其组合。
23.根据权利要求22所述的聚合物囊泡，其中所述核酸为RNA或DNA。
24.根据权利要求21所述的聚合物囊泡，其中所述有效负载为免疫原性的，或所述有效负载为被配置用于编码免疫原性多肽或蛋白质的核酸。
25.根据权利要求20所述的聚合物囊泡，其中所述共聚物为第一共聚物，并且所述膜进一步包含第二共聚物，其中所述第一共聚物和所述第二共聚物独立于权利要求1。
26.根据权利要求21所述的聚合物囊泡，其中所述有效负载为第一有效负载，并且所述膜进一步包封第二有效负载。
27.一种制剂，其包含根据权利要求20所述的聚合物囊泡。
28.根据权利要求27所述的制剂，其包含0.01至95％(w/w)的所述聚合物囊泡。
29.根据权利要求27所述的制剂，其中所述聚合物囊泡为第一聚合物囊泡，并且组合物进一步包含第二聚合物囊泡，其中所述第一聚合物囊泡和所述第二聚合物囊泡在尺寸、其形成膜的共聚物、包封于所述聚合物囊泡内的有效负载或其组合方面不同。
30.根据权利要求27所述的制剂，其进一步包含药学上可接受的赋形剂、佐剂或其组合。
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