CN1205642A - 糖链识别抗体及治疗hiv感染疾病的药物 - Google Patents

糖链识别抗体及治疗hiv感染疾病的药物 Download PDF

Info

Publication number
CN1205642A
CN1205642A CN96199124A CN96199124A CN1205642A CN 1205642 A CN1205642 A CN 1205642A CN 96199124 A CN96199124 A CN 96199124A CN 96199124 A CN96199124 A CN 96199124A CN 1205642 A CN1205642 A CN 1205642A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hiv
cell
igm
sugar chain
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN96199124A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1171638C (zh
Inventor
冈田秀亲
冈田则子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Otsuka Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN1205642A publication Critical patent/CN1205642A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1171638C publication Critical patent/CN1171638C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及出现在HIV感染细胞上的属于IgM同种型并且识别Gg4Cer(Galβ1－3GalNAcβ1－4Galβ1－4GlcβCer)或GM2的糖链识别抗体,并且涉及含有这些IgM的用于治疗HIV疾病的药物。

Description

糖链识别抗体及治疗HIV感染疾病的药物
技术领域：
本发明涉及新的糖链识别抗体，更具体地涉及属于IgM类并且识别在HIV感染细胞中表达的糖链的抗体，以及涉及用于治疗HIV患者的含有该抗体为有效成分的药物。
技术背景：
1981年在圣弗兰西斯科第一次发现AIDS(后天免疫缺陷综合症)，为同性恋男性致命的免疫缺陷疾病(Gottlieb，M．S．，Schroff，R．，等，N．Engl．J．Med．，305，1425-1430(1981))。两年以后，法国Pasteur研究所Montanie研究小组发现引起AIDS的病毒(Barre-Sinoussi，F．，Chermann，J．C．，等，《(科学》(Science)，220，868-871(1983))。1985年，该病毒被统一命名为HIV(人免疫缺陷病毒)(Coffin，J．，Haase，A．，等，《(科学》(Science)，232，697(1986))。
AIDS是具有下面特征和性质的疾病：当一个个体通过性交，输血等感染了HIV，则该病毒破坏受感染个体的免疫功能，引起宿主，即该感染个体后天性免疫缺陷。甚至，该宿主出现多种症状，例如腹泻和肺炎，导致宿主的最终死亡。
迄今为止，很多研究人员力图开发出治疗AIDS的药物。例如，从Mitsuya等发现叠氮基胸苷(AZT)(Mitsuya，H．，等，《美国国家科学院院刊》(Proc．Natl．Acad．Sci．，USA．)，82，7096(1985))开始，临床条件下已经研究了ddI(2’，3’-二脱氧肌苷)，ddC(2’，3’-二脱氧胞苷)，和其它物质。但是，还没有获得提供令人满意效果的药物。
尽管从HIV感染到发病的潜伏期根据个体而大大不同，但是大约感染HIV人数的50％肯定会在感染后10年内出现病症，并且几乎所有的感染患者在出现病症后1-3年内死亡。超过40岁的成年和儿童在感染HIV后很快发展病情。解释感染与出现AIDS相关综合症(ARC)之间的潜伏期的原因可能包括患者一般的健康状况，遗传素因，与其它感染疾病的并发症，和其它依赖宿主的原因，以及感染病毒菌株间的差异。
由于灌输血液成分而感染的情况下，大多数HIV感染个体出现AIDS而死亡。但是一些感染个体即使在感染10年后也不出现AIDS，而且另一些感染个体在出现AIDS之前甚至需要更长时间。这种病例分布世界各地，而且据报道5％的HIV感染个体长时间生存。HIV感染人员中长时间保持没有症状的称作长时间生存者已经引起了很大关注，因为认为他们提供了解释他们对HIV病毒的抗性或防止出现病理症状的机理的线索。因此对这些长时间生存者进行了大量的研究和探讨。
但是还没有清楚地明白为什么长时间生存者尽管感染了HIV但是不出现AIDS的原因。因此期望澄清HIV抗性原因，并以此为基础开发出治疗HIV疾病的药物。
本发明的公开：
本发明人研究了HIV感染人员病毒复制的静止情况和活性情况之间的差别。在该项研究中发现一些感染患者携带的某些糖链的天然抗体中存在的特异性IgMs可能能解释疾病发展的延迟。作为抗原的糖链据认为不存在于处于正常环境下的人体内，或者以有限量存在。但是当细胞受HIV感染时，这些糖链出现在T细胞或巨噬细胞的表面。(一般来说，已知当细胞发生肿瘤或感染一种病毒时，特殊的糖链出现在这些细胞的表面)。如果属于IgM类的这些糖链所属抗体作为天然抗体存在于血清中，则抗体识别HIV感染细胞，并且与这些感染细胞结合。补体级联在该局部位点被激活，在该位点IgM与糖抗原结合，导致HIV感染细胞的溶胞作用。这样，含有上述天然IgM抗体的血清建立一个特定的环境，在该环境下HIV感染细胞不容易增殖。本发明人还发现HIV感染细胞增强了补体敏感性。这些事实不仅在体外得到了证明，而且在感染了HIV且延迟出现AIDS的患者体内也得到了证明。即，实际证明了这些长期生存患者出现属于IgM类的与HIV感染细胞反应的抗体。
也发现通常抵抗补体的细胞在神经节四糖(Gg4)的抗体结合这些细胞后被补体溶胞。另外，属于IgM类的具有与感染细胞结合能力的抗体减少了感染细胞，这是补体激活介导的细胞溶解的结果，并且该抗体使HIV感染细胞出现了一个洞孔。于是可以知道施用属于IgM类的并且具有与HIV感染细胞反应性的抗体对于治疗HIV携带者是有用的。
因此，本发明提供一种糖链识别抗体，其属于IgM类并且其识别Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2。
本发明还提供一种治疗HIV疾病(AIDS)的含有糖链识别抗体作为有效成分的药物。
本发明还提供一种用糖链识别抗体治疗HIV疾病的组合物。
本发明还提供糖链识别抗体的用途及治疗HIV疾病的治疗剂的制备方法。
本发明还提供一种治疗HIV感染患者的方法，其特征在于对HIV患者施用有效量的糖链识别抗体。
附图的简要说明：
图1是表明对血清样品No．1进行表位分析结果的图示。
图2是表明对血清样品No．56进行表位分析结果的图示。
图3是表明含有来自健康HIV血清阴性供者的IgM的人血清对HIV感染的MOLT4细胞的溶胞能力的图示。
图4是表明一项试验结果的图示，在该项试验中，用来自正常人血清-1(NHS-1)的IgM抗体级分分别处理神经氨酸酶处理的MOLT4细胞，未处理的MOLT4细胞，和HIV-MOLT4细胞，然后用荧光素标记的抗人IgM抗体免疫染色。
图5是表明被各种糖包被的脂质体吸收的IgM抗体残留的溶细胞能力的结果，以及被IgM处理的靶细胞的免疫染色的结果的图示。
图6是表明测定HIV-感染-MOLT4细胞上补体灭活膜的表达量的流式细胞测量法的结果的图示。
进行本发明的最佳方式：
这里所使用的糖链用本领域习惯缩写代表：Gg代表神经元系列，Cer代表神经酰胺，Gal代表半乳糖，GalNAc代表N-乙酰基半乳糖，及Glc代表乳糖。本发明抗体可以从人血清中分离，或者可以通过使用Gg4Cer或GM2作为抗原产生抗体的常规方法制备，只要这些抗体识别Gg4Cer或GM2(神经节苷脂GM2：II3αNeuAc-GgOse3Cer)并且属于IgM免疫球蛋白。
为了从人血清中分离本发明抗体，使用常规方法，用Gg4Cer或GM2作为抗原筛选存在的抗体。血清可以是从血清阴性HIV感染患者采集的样品或是其它的从健康个体采集的样品。抗Gg4Cer或GM2抗体可以通过常规方法获得，例如杂交瘤方法或者使用EB病毒无限增殖化方法。
用于筛选的技术包括常规的ELISA，RIA，荧光抗体技术，斑点免疫结合试验，蛋白质印迹方法，和51Cr-释放方法。
从上述血清分离出来后，本发明抗体容易用公知的免疫球蛋白纯化技术纯化。这些方法的例子包括盐沉淀，凝胶过滤，和亲和层析(使用甘露聚糖柱，偶联甘露糖聚合物来去除甘露糖结合的蛋白质(MBP))。
本发明抗体也可以通过常规的杂交瘤方法用Gg4Cer或GM2作为抗原来制备。本发明抗体可以是单克隆或多克隆抗体，只要他们识别Gg4Cer和／或GM2并且属于IgM类。
本发明抗体对于治疗HIV疾病是有用的，这一点从下文中得到证明。
本发明人获得了具有引起HIV-1感染的T细胞系细胞溶解能力的人血清样品。发现用HIV-1的HTLV-ⅢB菌株感染的人T细胞系(MOLT4)被来自HIV血清阴性健康个体的新鲜正常人血清(NHS)溶胞，但是检验的大多数血清，包括HIV感染携带者的血清对溶解HIV感染的Molt4没有活性。当采集最初样品一年后又采集新鲜样品时，具有溶解HIV感染细胞能力的血清仍然具有相同程度的效能。通过将血清在56℃加热30分钟破坏NHS-1的细胞毒性能力，并且通过加入没有溶胞的新鲜血清(NHS-5)来储存，表明细胞溶解是由补体激活介导的，因为已知热处理可以灭活补体。
血清中甘露糖结合的蛋白质(MBP)据报道与HIV的gp41(C．F．Ebenbichler等，J．Exp．Med．，174，1417(1991))和gp120(C．Sual等，J．Immunol．Med．，152，6028(1994))反应，从而显示出补体活性。但是，当用甘露聚糖柱从NHS-1中去除MBP时，不降低细胞溶解能力。
通过在TSK凝胶G3000SW柱上凝胶过滤分离NHS-1后，发现IgM级分具有使HIV感染MOLT4细胞(HIV-MOLT4)对于通过未溶胞的人血清例如NHS-5的细胞溶解敏感的能力。完全丧失其增敏能力的级分通过与小鼠抗人IgM单克隆抗体偶联的亲和柱而被破坏。这解释了IgM是造成HIV-MOLT4对血清补体引起的细胞溶解敏感的原因。但是在蛋白质印迹分析中该IgM不与HIV抗原反应。因此本发明人推测被该抗体识别的抗原表位可能是由于HIV感染而产生改变的糖部分。然后本发明人试图用神经氨酸酶处理未感染的MOLT4细胞，并且发现被处理的细胞与识别一种唾液酸糖缀合物的IgM反应。而且用这些神经氨酸酶处理的MOLT4细胞吸收IgM级分明显降低了对由正常人血清引起的细胞溶解的敏感性。
IgM级分显示出与某些糖苷的反应性，例如Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)，其可以通过从GM1中去除唾液酸而产生。而且带有Gg4的脂质体吸收了IgM对于细胞溶解的敏感能力。通过用小鼠抗Gg4单克隆抗体的免疫染色证明在HIV-MOLT4细胞上和神经氨酸酶处理的MOLT4细胞上存在Gg4抗原识别位点。用识别GM2的抗原或HIV感染的V-937细胞的IgM也证明了这些作用。
另一方面，已知补体活性被特异性膜抑制剂抑制，所述特异性膜抑制剂是例如(1)一种衰变加速因子，其是一种膜补体抑制剂(DAF；A．Nicholson-Weller，J．Burge，D．T．Fearon，P．F．Weller，K．F．Austen，J．Immunol．，129，184(1982))，(2)膜辅因子蛋白(MCP；T．Seya，J．R．Tumer，J．P．Atkinson，J．Exp．Med．，163，837(1986))，和(3)CD59(HRF20；20KDa同源限制性酶切因子，N．Okada，R．Harada，T．Fujita，H．Okada，Int．Immunol．，1，205(1989)；A．DaVis等，J．Exp．Med．，170，637(1989))。
其中Fas抗原被表达的条件下，DAF，MCP，和CD59的表达是负调节的，而HLA-DR的表达保持不变。特则是，CD59在HIV感染的细胞上的表达不大于未感染的MILT4细胞的表达的50％。CD59表达的负调节也可以由Northern印迹分析测定的mRNA的水平而证实。
而且，使抗补体反应抗性由于减少的CD59表达而减弱的HIV感染的-MOLT4进行由IgM和正常人血清补体引起的选择性细胞溶解。溶胞和未溶胞细胞之间gp120表达程度没有不同。DAF，MCP，和特别是CD59的负调节可能作用于由被抗原-IgM配合物激活的人补体引起的HIV感染细胞的细胞溶解。而且HIV感染细胞的膜上的末端唾液酸的量的减少可能有利于补体的激活。但是HIV感染细胞，即使这些细胞结合IgG，也不被HIV-血清阴性血清补体溶胞，这可以通过荧光素标记的抗人IgG抗体检测。
对于通过典型途径来激活补体，需要两个IgG分子，它们以邻近效应相互反应。另一方面只有一个分子IgM就足以用于补体激活。因此，补体激活通过IgM触发比通过IgG触发有效得多
而且IgM引发的补体激活有可能通过靶细胞膜上的补体抑制分子而逃避限制性酶切，因为IgM是900kDa的大分子，与该分子结合的补体成分可能不能接近DAF，MCP，或膜上的其它补体抑制分子。另一方面，由补体激活产生的膜攻击复合体结合在细胞膜的脂双层上。CD59限制结合在这些膜上的这些抗原-IgM复合体的生成，从而防止细胞损伤。HIV感染细胞上CD59减少的表达回复细胞抗膜攻击复合体的抗性并促进细胞溶解。
用其它T细胞系例如CEM和MT4细胞对于MOLT4细胞获得了相同的结果。HIV感染的CEM细胞显示出减少的CD59表达以及对于由IgM和补体引起的细胞溶解敏感。但是，在巨噬细胞系例如HIV感染的U937细胞中没有发现CD59表达的减少，并且这些细胞系抵抗由IgM和补体介导的细胞溶解。
IgM和补体介导的细胞溶解反应在体内在HIV感染的T细胞的减少中起作用。如果个体具有与出现在HIV感染的T细胞上的糖抗原例如Gg4和GM2反应的天然IgM抗体，则认为HIV感染的扩展在HIV感染时被抑制。尽管HIV感染的巨噬细胞可以从涉及IgM和补体的攻击反应中幸存下来，但是感染的T淋巴细胞将被去除。因此，血清IgM可能是决定一些HIV携带者长期存活的机理的关键因素。事实上，当对12个HIV感染后生存了12年或更长时间的长期存活者进行研究时，发现他们所有的人都拥有IgM，而在短期内出现症状的5个人只拥有IgG而没有IgM。
对于黑素瘤患者也发现了类似的IgM保护机理(Ones，P．C．，Sze，L．L．，Morton，D．L．和Irie，R．F．，J．Natl．Cancer Inst．，66，249，1980)。
如上所述，对HIV感染患者施用本发明糖链IgM在于体内保留天然抗体方面将是有效的，因此在治疗和防止AIDS中是有效的。
本发明IgM一般掺合到合适的药物制剂中，一般是肠胃外制剂例如注射液，并对需要治疗的患者给药。可以通过常规方法获得这些制剂，用于制剂的赋形剂是常规的，一般是例如糖，氨基酸，和蛋白质。除了本发明IgM外，这些制剂还含有合适量的合适的添加剂，例如各种无机盐。不同形式本发明制剂中的剂量没有特别的限制。一般优选确定剂量使具有活性并杀死HIV感染的细胞，因此IgM存在的量是体外对于有效成分糖链(IgM效能)来说在10μl／ml至50μl／ml的范围。
因此本发明抗体对于防止和治疗HIV感染患者是有用的。即当对个体施用本发明糖链特异性抗体时，体内提高了天然抗体滴度，从而提供抗AIDS的治疗和预防效果。
实施例：
下面将通过实施例更加详细地描述本发明。实施例1：细胞的培养
在补加有10％小牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100IU／ml青霉素和100mg／ml链霉素的RPMI1640培养基中培养一种人T细胞系的MOLT4细胞，并使没有支原体。细胞用HTLV-ⅢV(HIV-1)感染，并在作为HIV感染的靶细胞源使用之前培养4星期或更长时间。通过流式细胞计量器使用单克隆抗体0．5β(即一种gp120 HTLV-ⅢV的抗体)检测测得大于95％的细胞是HIV-env抗原(gp120)阳性，从而证明大多数细胞中成功地被HIV-1感染。
分别用51Cr标记5×106HIV感染的MOLT4细胞和未感染的对照MOLT4细胞(正常MOLT4细胞)。标记后将两种细胞冲洗并悬浮于没有RPMI1640培养基的血清中，浓度是2×105／ml。
100μl等份的细胞悬浮液和100μl新鲜的或热灭活的血清置于U-底微型板的每一个孔中。血清是从4个HIV-血清阳性患者和13个健康HIV-血清阴性供者获得的
这些平板在37℃保温1．5小时并离心。用下面的公式计算51Cr释放到没有细胞的上清液中的百分数：
％51Cr释放={(用新鲜血清释放-用热灭活血清释放)／(用5％TritonX100释放-用热灭活血清释放)}×100
实施例2：用神经氨酸酶处理
向100μl细胞悬浮液(2×106)中加入100μl神经氨酸酶，并在37℃培养45分钟。向2×106MOLT4，Neu-MOLT4，或HIV-MOLT4细胞小丸加入250μl来自NHS-1的IgM级分--NHS-1是具有强细胞溶解活性的血清，并在4℃培养30分钟。离心后将上清液转移到另一些试管中测定它们的增敏能力。冲洗细胞并用FITC-缀合的小鼠抗人IgM染色并在FACScan上分析。
用MOLT4，Neu-MOLT4，或HIV-MOLT4培养后获得的上清液与HIV-MOLT4一起在没有溶胞的人血清(NHS-5)存在下培养，以测定细胞溶解活性。
实施例3：
根据实施例1的描述筛选来自健康个体的95个血清样品，其中使用用51Cr标记的感染的MOLT4细胞作为靶细胞。作为结果，发现16个个体具有对于感染细胞的15％或更高的细胞溶解活性。接着通过使用感染的U937和MOLT4细胞，对两个血清样品进行选择，这两个血清样品具有对于这两个感染的细胞系的细胞溶解活性。收集血清的IgM级分并在下面的试验中使用。
根据《免疫》(Immunology)，48：129-140(1983)中说明的方法制备脂质体。简要地说，以1∶1∶0．1混合胆固醇，二肉豆蔻酰-卵磷脂，和要插入的各种脂质中的一种，并用旋转蒸发器蒸发溶剂氯仿，从而在玻璃瓶内表面生成一层脂质膜。由胆固醇，二肉豆蔻酰-卵磷脂(1∶1)制备对照脂质体。
向脂质膜加入PBS，膜在涡流混合器中剧烈振动以形成脂质体(多层)。向多层脂质体加入PBS用于离心洗涤，从而获得脂质体悬浮液。
从得到的脂质体悬浮液中取含有10nmol糖脂的等份并进行离心从而得到脂质体小丸。弃除上清液。向小丸加入IgM级分(200μg／200μl)(血清阳性血清通过使用TSK-3000的凝胶过滤分级后)。搅拌混合物，并在室温下静置60分钟，以吸收存在于脂质体膜上面的糖脂的抗体。反应后，离心混合物，沉淀脂质体，并回收上清液。
对上述吸收过程之后IgM级分测定细胞对于HIV感染的MOLT4细胞(HIV-MOLT4)的破坏活性。简要地说，向100μl51Cr-标记的HIV-MOLT4(即51Cr-HIV-MOLT4，2×55／ml)或者对照情况下，向相同量的未感染的51Cr-MOLT4加入50μlIgM级分和50μl血清阴性正常人血清(作为补体来源)，其中IgM级分进行了或者没有进行吸收过程。混合物在37℃反应90分钟，然后离心平板。测定释放到上清液中的51Cr的量，测得对于细胞的破坏程度。
即在试验中分别使用了对照脂质体，Gg4脂质体，和GM2脂质体，它们是纯脂质体，脂质体加Gg2，和脂质体加GM2。通过使用一种类型的脂质体，新鲜的血清，和25％IgM级分引起抗原-抗体反应。在上清液中测得细胞的溶胞活性(细胞溶解百分率)结果见图1和图2。在样品No．1和No．2两种情况下，在“对照”和“Gg4脂质体”中保持溶胞活性，与GM2脂质体接触后该活性完全消失。这些结果证明在来自正常个体的血清中，GM2是产生的抗HIV感染的细胞的IgM天然抗体的抗原表位。实验实施例1：来自正常血清阴性供者个体的人血清(含有IgM)对HIV-MOLT4细胞的细胞溶解作用
结果见图3。x-轴代表细胞溶解百分率，y-轴代表来自供者的血清(NHS-1至NHS-13和PS-1至PS-4)。图3附有图(a)和(b)，它们给出血清样品(NHS-1，NHS-5或PS-1)与HIV-MOLT4细胞反应后进行的免疫染色的结果(x-轴：荧光强度；y-轴：细胞数)，其中图(a)是其中使用IgM的情况，图(b)是其中使用IgG的情况。这些图证明了下面的发现。
(A)来自健康HIV-血清阴性的13个血清样品中，只有一个(NHS-1)引起51Cr-标记的HIV-MOLT4细胞的细胞溶解归因于人血清。
NHS-1显示出43％细胞溶解这样高的百分率，而没有来自健康个体的其它血清(12个个体NHS-2至NHS-13)显示出任何注意得到的细胞溶解。来自HIV-血清阳性患者的血清(PS-1至PS-4)几乎没有显示出细胞溶解。
(B)HIV-MOLT4细胞与等体积血清样品NHS-1，NHS-5或PS-1一起在室温下培养30分钟，然后冲洗细胞，并通过使用FITC-标记的抗人IgM抗体或FITC-标记的抗人IgG抗体免疫染色。
结果在图3中的图(a)和(b)中给出。用NHS-1处理的HIV-MOLT4细胞结合抗IgM抗体，而结合抗IgG抗体的PS-1不与抗IgM抗体反应。实验实施例2：
神经氨酸酶处理的MOLT4细胞，未处理的MOLT4细胞，或HIV-MOLT4细胞用来自NHS-1的IgM抗体级分处理，然后用荧光素标记的抗人IgM抗体免疫染色。结果在类似于图3中的图(a)的图4中给出。与HIV-MOLT4细胞反应的IgM抗体也与神经氨酸酶处理的HIV-MOLT4细胞反应。
作为结果，如图4中的图(a)所示，来自NHS-1的IgM级分与Neu-MOLT4细胞反应和其与HIV-MOLT4细胞的反应一样强。如图4中的图(b)所示，抗-gp120单克隆抗体(抗-gp120，0．5β)只染色HIV-MOLT4细胞。
IgM级分增敏人血清细胞溶解的能力通过用Neu-MOLT4细胞处理而被吸收，就象用HIV-MOLT4细胞处理而吸收一样。换句话说，用吸收其细胞溶解能力的这些细胞处理的IgM级分丧失了用细胞溶解能力传递健康人血清(NHS-5)的效能。实验实施例3：
对HIV-MOLT4有反应性的IgM与Gg4Cer反应。
(A)7种不同类型的下面说明的糖脂在塑料TLC平板上层析，通过使用地衣二酚-硫酸试剂和由NHS-1(a)获得的IgM级分通过免疫染色检测斑点，也可以使用由NHS-1获得的IgM级分通过TLC免疫染色检测斑点。
1．LacCer，2．Gg3Cer，3．nLc4Cer，4．Lc4Cer，5．Gb4Cer，
6．Gy4Cer，7．IV3Galα-nLc4Cer．
Gg4Cer明显被染色。LacCer，Gg3Cer，和LcCer稍有染色。但是IgM级分几乎没有与nLc4Cer，Gb4Cer，IV3Galα-nLc4Cer，唾液基化的糖脂例如GM3，GM2，GM1，GD1a，GT1b，GQ1b，IV3NeuAcα-nLc4Cer，唾液基化的Lea和唾液基化的Lex反应。
将Gg4Cer染色水平作为100，LacCer，Gg3Cer，nLc4Cer，Gb4Cer，和IV3Galα-nLc4Cer的染色水平分别是25．8，31．8，0，29．3，0，和24．6。
根据Okada和其它人的说明(Okada，N．，Yoshida，T．，和(Okada，H．，《自然》(Nature)，299，261(1982))制备脂质体。IgM级分(50μg／200μl)与5nmol各种脂质体制剂混合。离心后根据实施例2描述的方法测定上清液的细胞溶解活性。
IgM级分对于由非溶胞人血清(NHS-5)引起的HIV-MOLT4细胞的细胞溶解的能力通过用Gg4-脂质体处理而吸收到小于一半的水平(图5，A)。
尽管抗Gg4的小鼠单克隆抗体不与正常的MOLT4细胞反应，但是根据流式细胞计量器测定，其更易与HIV-MOLT4和Neu-NOLT4细胞反应(图5，B)。实验实施例4：HIV-MOLT4细胞上CD59表述的明显减少
(A)通过流式细胞计量器测定，发现HIV感染的细胞上的补体调节膜因子(DAF，MCP，和CD59)的表达减少。HIV感染后Fas抗原和HLA-DR的表达保持不变(图6)。
(B)对于补体调节膜因子的Northern印迹分析，根据Thomas，P．S．，《酶学方法》(Method Enzymol．)100，255-2(1983)的说明提取5μg来自未感染的(N)和HIV感染的(H)MOLT4细胞的全RNA，并用乙二醛变性。用CD59，DAF，MCP，和GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶)的cDNA片段作为探针。清楚地发现CD59mRNA的减少。
1×106个细胞与NHS-1在37℃培养30分钟后，对HIV-MOLT4进行两个颜色分析。通过用propiodium iodide(PI)染色测定死亡细胞数。这可以区分用PI染色的死亡细胞和不能用PI染色的存活细胞。用这些抗原的FITC标记的单克隆抗体染色C5b-9(MAC)，CD59，和gp120。结果总结如下。
(a)与NHS-1培养后PI染色的细胞(死亡细胞)比PI染色的阴性细胞染色稍微强一点，后者细胞表明这些细胞被大量C5b-9处理并且没有被杀死。
(b)在10mM EDTA存在下NHS-1不诱导PI阳性死亡细胞。
(c)表达减少量的CD59的细胞在用NHS-1处理后用PI染色，表明表达减少量的CD59的细胞优先被杀死。
(d)gp120的表达在PI染色的细胞(死亡细胞)和未染色细胞(存活细胞)之间基本上相同，表明抗-gp120抗体的量和NHS-1的细胞杀伤能力不直接相关。
工业上的实用性：
因为对HIV感染的个体施用糖链识别抗体引起补体激活介导的HIV感染细胞的细胞溶解作用，因此本发明糖链识别抗体在治疗和防止AIDS中是有用的。

Claims (10)

1．一种糖链识别抗体，其属于IgM类并且识别Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2。
2．一种治疗HIV疾病的药物，其含有属于IgM类并且识别Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖链识别抗体为活性成分。
3．权利要求2的药物，其中糖链识别抗体通过补体激活引起HIV感染的细胞的溶胞。
4．一种治疗HIV疾病的组合物，其含有属于IgM类并且识别Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖链识别抗体。
5．权利要求4的组合物，其中糖链识别抗体通过补体激活引起HIV感染的细胞的溶胞。
6．属于IgM免疫球蛋白亚类并且识别Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖链识别抗体在制备治疗HIV疾病的治疗剂中的用途。
7．权利要求7的用途，其中糖链识别抗体通过补体激活引起HIV感染的细胞的溶胞。
8．一种治疗HIV感染患者的方法，特征在于对所述患者施用有效量的属于IgM类并且识别Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖链识别抗体。
9．权利要求8的方法，其中糖链识别抗体通过补体激活引起HIV感染的细胞的溶胞。
10．权利要求8的方法，用于防止AIDS病症的出现。
CNB961991240A 1995-12-18 1996-12-17 糖链识别抗体及治疗hiv感染疾病的药物 Expired - Fee Related CN1171638C (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32901095 1995-12-18
JP329010/95 1995-12-18
JP329010/1995 1995-12-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1205642A true CN1205642A (zh) 1999-01-20
CN1171638C CN1171638C (zh) 2004-10-20

Family

ID=18216600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB961991240A Expired - Fee Related CN1171638C (zh) 1995-12-18 1996-12-17 糖链识别抗体及治疗hiv感染疾病的药物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6190863B1 (zh)
EP (1) EP0870509B1 (zh)
KR (1) KR100468899B1 (zh)
CN (1) CN1171638C (zh)
AR (1) AR004388A1 (zh)
AT (1) ATE298247T1 (zh)
AU (1) AU719412B2 (zh)
DE (1) DE69634879T2 (zh)
MX (1) MX9804880A (zh)
TW (1) TW505656B (zh)
WO (1) WO1997022361A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101788557B (zh) * 2002-12-26 2012-03-21 盐野义制药株式会社 用捕捉糖链的分子纯化/浓缩糖链的方法和分析糖链结构的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1533320B1 (en) * 2002-07-01 2009-02-18 Nagoya Industrial Science Research Institute HUMAN IgM ANTIBODY INDUCING APOPTOSIS IN HIV-INFECTED CELLS AND REMEDY FOR HIV-INFECTION
AU2003244159A1 (en) * 2002-07-01 2004-01-19 Hidechika Okada HUMAN IgM ANTIBODY LYSING ACTIVATED LYMPHOCYTES UNDER MEDIATION BY HOMOLOGOUS COMPLEMENT
JP6811723B2 (ja) 2015-04-17 2021-01-13 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 多価ヒト免疫不全ウイルス抗原結合分子およびその使用方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101788557B (zh) * 2002-12-26 2012-03-21 盐野义制药株式会社 用捕捉糖链的分子纯化/浓缩糖链的方法和分析糖链结构的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0870509A4 (en) 2001-04-18
TW505656B (en) 2002-10-11
KR100468899B1 (ko) 2006-08-18
EP0870509A1 (en) 1998-10-14
AU719412B2 (en) 2000-05-11
AU1111397A (en) 1997-07-14
DE69634879D1 (de) 2005-07-28
EP0870509B1 (en) 2005-06-22
DE69634879T2 (de) 2005-11-24
CN1171638C (zh) 2004-10-20
AR004388A1 (es) 1998-11-04
ATE298247T1 (de) 2005-07-15
US6190863B1 (en) 2001-02-20
KR20000064360A (ko) 2000-11-06
WO1997022361A1 (fr) 1997-06-26
MX9804880A (es) 1998-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0207984B1 (en) Antiviral agents
Ruvoën-Clouet et al. Binding of rabbit hemorrhagic disease virus to antigens of the ABH histo-blood group family
Ennis et al. Evidence that cytotoxic T cells are part of the host's response to influenza pneumonia.
JP2001502315A (ja) ウイルス感染を処置するための組成物および方法
US4863730A (en) Immunotherapy for AIDS patients
Wedderburn et al. The immunodepressive effect of Friend virus: II. Reduction of splenic haemolysin-producing cells in primary and secondary responses
EP0609305A1 (en) Type c-like human retrovirus linked to multiple sclerosis (ms)
CN1035050A (zh) 双链rna纠正循环免疫复合物及单核细胞功能异常
EP0497825B1 (en) Anti-viral material
CN1171638C (zh) 糖链识别抗体及治疗hiv感染疾病的药物
Iseki et al. Immunodeficiency disorders
Hiemstra et al. Clinical and immunological studies in patients with an increased serum IgD level
JP3463143B2 (ja) 糖鎖認識抗体及びｈｉｖ感染症治療剤
Wu et al. IgM natural antibody against an asialo-oligosaccharide, gangliotetraose (Gg4), sensitizes HIV-I infected cells for cytolysis by homologous complement
CA2239596C (en) Sugar-chain-recognizing antibodies and remedies for hiv infectious diseases
RU2359269C2 (ru) Способ получения диагностикума клещевого энцефалита
KR0123538B1 (ko) 한탄바이러스, 서울바이러스, 푸우말라바이러스, 벨그라드바이러스 및 호왕바이러스 항원을 이용한 유행성출혈열 혼합백신 및 혼합진단제
JPH05506843A (ja) 抗―炭水化物抗体及び炭水化物抗原に作用する後天性免疫不全症候群（ａｉｄｓ）及びａｉｄｓ関連複合体（ａｒｃ）の薬剤及び治療法
Maisch et al. Humoral and cell-mediated immunity: pathogenetic mechanisms in dilated cardiomyopathy
Nash et al. Recovery from Infection
JP2003146999A (ja) Ｈｉｖ−２型ヒトレトロウイルスのトランスメンブランエンベロープ糖タンパク質の抗原、及び、該抗原に免疫類似性を有する抗原
Alter The birth of serological testing for hepatitis B virus infection
Ford Current views on the pathogenesis and etiology of rheumatoid arthritis.
Gravely Applicant Organization e9 Howard University 2400 Sixth Street, NW Washington, DC 20059
Siegel et al. Immunodepressive Effect of Rauscher Leukemia Virus on Antinuclear Antibody Formation in New Zealand Black Mice

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20041020

Termination date: 20131217