CN1198842C - 具有细胞趋化作用和造血刺激活性的趋化素样因子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个人类细胞来源的具有细胞趋化活性和促进细胞增殖作用的趋化素样因子CKLF1及其变异体，编码CKLF1及其变异体的核苷酸序列，以基因重组技术生产趋化素样因子的方法和抗CKLF1的抗体和拮抗剂。本发明进一步公开了含有有效剂量趋化素样因子和药学上可接受载体或赋形剂的药物组合，以及所趋化素样因子及其核酸编码序列在制备用于诊断或治疗免疫细胞功能异常疾病、多种原发性肿瘤、造血功能低下、肌肉萎缩、肌肉病变、脱发等病症等疾病的药物中的应用。

Description

具有细胞趋化作用和造血刺激活性的趋化素样因子

发明领域

本发明涉及新的具有细胞趋化作用和造血刺激活性的趋化素样因子CKLF1及其变异体、编码趋化素样因子及其变异体的多核苷酸序列、生产趋化素样因子的方法、趋化素样因子的抗体及拮抗剂，以及趋化素样因子及其核酸编码序列在诊断或治疗免疫系统疾病、造血系统疾病及肿瘤中的应用。

发明背景

细胞因子是指由机体细胞合成并分泌的小分子多肽类因子，它们参与多种细胞的增殖和分化，在机体的生理及病理过程中具有重要作用。细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子、趋化因子等。利用基因工程技术生产的多种重组细胞因子或细胞因子拮抗剂药物已用于临床并收到良好疗效，展示了细胞因子广阔的应用前景。

趋化素(chemokine，又称趋化因子)是一类结构相似、分子量8-12KD、具有细胞趋化作用的小分子多肽，它们在机体的免疫防御、免疫调节、炎症反应、造血调节、血管生成等方面具有重要作用。大多数趋化因子的氨基酸序列都具有4个保守的半胱氨酸，根据第一和第二个半胱氨酸的位置，趋化因子可以分为CXC、CC、CX₃C和C四个亚家族，其中的C代表半胱氨酸，X代表任一种氨基酸。CXC趋化因子主要活化和趋化中性粒细胞和T淋巴细胞，其基因多数定位于人体第4对染色体上，其成员包括白细胞介素-8(IL-8)、干扰素诱导蛋白-10(IFN-IP-10)、MGSA等。CC趋化因子主要活化和趋化单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞等细胞，其基因大多位于第17对染色体上，成员包括巨噬细胞炎性蛋白-1α、β(MIP-1α，β)、巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES等。CX₃C亚家族目前只发现了Fractalkine，它具有活化和趋化T细胞及单核细胞的功能。C亚家族目前也只有Lymphotactin(Ltn)一个成员，它主要趋化淋巴细胞。趋化因子受体属于G蛋白受体家族，它们具有7个穿膜区的结构。根据结合趋化因子亚家族成员的不同，趋化因子受体被相应地命名为CXCR1，2，3，4；CCR1，2，3，4，5，6，7；CX₃CR等(参见Marco B et al，Human Chemokines：An Update Annu.Rev.Immunol.1997.15：675-705)。由于趋化因子在机体免疫、炎症反应及造血调节等方面的重要作用，趋化因子及其受体的异常变化，如趋化因子或其受体缺陷、趋化因子过度表达、可溶性趋化因子受体水平的增加往往会引起某些感染性疾病、自身免疫性疾病甚至肿瘤的发生，因而对趋化因子的检测可以用于疾病的辅助诊断、病程观察、疗效判断及治疗监测等过程。近年还发现人类免疫缺陷病毒(HIV)可以通过与趋化因子受体的结合入侵机体的免疫细胞，提示趋化因子与HIV的感染和致病过程密切关联，用趋化因子做药物可能会阻断HIV侵入免疫细胞(Cocchi F，et al.Identification of RANTES，MIP-1，and MIP-1 as the Major HIV-Suppressive Factors Produced byCD8+T Cells。Science，15 December 1995，p.1811)。此外，用基因工程方法生产的趋化因子及其相关药物已经陆续进入临床试验，有望成为新一代的生物技术药物。例如，髓样造血祖细胞抑制因子(MPIF-1)被作为造血保护剂用于大剂量的肿瘤放、化疗(Marshall A，HGS launches″first″genomics product in clinic.Nat Biotechnol 1998，16：129)。

本发明的构思如下：鉴于有丝分裂原植物血凝素(PHA)能够刺激产生多种细胞因子或趋化因子(Brantschen S，Gauchat JF，de Weck AL etal.Differential expression of cytokine mRNAs in human cell lines.Lymphokine Res 1989 8(3)：163-72)，而白细胞介素-10(IL-10)是一个广谱的细胞因子抑制剂(Di-Hwei，H et al，Science，1990，250，830)，通过抑制性递减杂交(SSH)技术(Diatchenko L，YFC，CampbellA P，et al.Suppression subtractive hybridization：A method forgenerating differentially regulated or tissue-specific cDNAprobes and libraries.Pro Natl Acad Sci USA.1996，术93：6025-30)，或许能够找到目前尚未发现的受IL-10抑制的细胞因子。基于上述思路，本发明人利用抑制性递减杂交(SSH)技术，从人髓样白血病细胞系U937的cDNA中分离并克隆了趋化素样因子CKLF1的基因，并公开了CKLF1及其变异体的生物学活性及功能。

发明概述

本发明的第一个目的是提供一个具有免疫细胞趋化作用及造血刺激活性的趋化素样因子CKLF1(chemokine like factor 1，简称CKLF1)，以及趋化素样因子CKLF1的变异体、类似物、衍生物及多肽片段。

本发明的第二个目的是提供编码趋化素样因子及其类似物的多核苷酸序列，所述多核苷酸包括DNA、cDNA、基因组DNA及mRNA。

本发明的第三个目的是提供以DNA重组技术生产趋化素样因子的方法，该方法包括用基因工程的技术将趋化素样因子的编码序列克隆到适合的载体，然后通过转导、转染或转化等方法，将重组体转入原核或真核宿主细胞，并从宿主细胞得到表达产物，包括从培养基或溶胞产物中回收表达产物。

本发明的第四个目的是提供所述趋化素样因子或编码趋化素样因子的核酸序列，在制备用于诊断或治疗免疫细胞功能异常疾病、多种原发性肿瘤、造血功能低下等疾病的药物中的应用。

本发明的第五个目的是提供含有趋化素样因子或其活性成分的药物组合物，所述药物组合物包括将趋化素样因子或其活性成分与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂相混合。

本发明的第六个目的是提供对所述趋化素样因子具有特异性的多克隆或单克隆抗体。

本发明的第七个目的是提供用于抑制所述趋化素样因子作用的拮抗剂，以及拮抗剂在治疗类风湿性关节炎、自身免疫病、肿瘤、病毒感染等疾病中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中是否存在编码所述趋化素样因子多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中是否存在所述趋化素样因子多肽。

为了更清楚地理解本发明的实质，现参照下列附图和实施例对其进行解释，附图和实施例的目的只是为了解释而不以任何方式限制本发明。

附图及序列表简要说明

图1是U937细胞白细胞介素-10抑制表达研究中抑制性底物杂交(SSH)的示意图。

图2是CKLF1及其变异体CKLF2，3，4的结构示意图。

图3是Northern blot检测U937细胞中CKLF1 mRNA的表达。

图4是pMTY4-CKLF1在原核细胞中的表达结果。

图5由图5A-I的9幅图组成，显示了趋化素样因子CKLF1对多种细胞的趋化活性，其中，

图5A显示重组CKLF1转染上清对DMSO刺激的HL-60细胞的趋化作用；

图5B显示重组CKLF1转染上清对小鼠腹腔巨噬细胞的趋化作用；

图5C显示重组CKLF1转染上清对小鼠淋巴细胞的趋化作用；

图5D显示重组CKLF1转染上清对单核细胞(PBMC)的趋化作用；

图5E显示重组CKLF1转染上清对噬中性线细胞的趋化作用；

图5F显示重组CKLF1转染上清对U937细胞的趋化作用；

图5G显示重组CKLF1转染上清对K562细胞的趋化作用；

图5H-I分别显示人CKLF1对小鼠腹腔巨噬细胞和淋巴细胞的趋化效应。

图6是CKLF1的重组表达载体pcDI-CKLF1的构建示意图。质粒pcDI-CKLF2，3，4的构建与其类似。

图7显示CKLF1，2，3蛋白质对小鼠骨髓细胞的促增殖作用。

图8由图8A和图8B组成，显示CKLF1刺激后，小鼠骨髓细胞的形态变化：图8A为pcd I组小鼠骨髓细胞形态；图8B为pcd I-CKLF1组骨髓细胞形态。

图9是利用MTT法测CKLF1转染上清对人骨髓细胞的促增殖作用的结果。

图10是CKLF1刺激形成的人骨髓细胞集落形态(培养20天)。

图11包括11A-11D，其中图11A-B显示了CKLF1及其变异体在正常成人组织中的表达；图11C、11D分别显示了CKLF1及其变异体在胚胎组织和多种肿瘤组织中的表达。

图12A-B显示了小鼠骨骼肌注射pcDI-CKLF1 10天后，AcP染色观察注射部位横断面组织的结果，图12A为实验对照组，小鼠骨骼肌注射pcDI-CKLF1 10天后注射部位横断面组织，AcP组织化学染色，HE复染，40×；图12B为实验组，鼠骨骼肌注射pcDI-CKLF1 10天后注射部位横断面组织，AcP组织化学染色，HE复染，40×。

图13A-B显示了小鼠骨骼肌注射pcDI-CKLF1 10天后，HE染色观察注射部位纵切面组织的结果，图13A为对照组，HE染色，40×；图13B为实验组，HE染色，40×。

序列表中SEQ ID NO：1显示了趋化素样因子CKLF1的核酸序列，其中包括CKLF1的cDNA编码区序列。SEQ ID NO：2显示了由SEQ ID NO：1的编码序列推测的CKLF1氨基酸序列。SEQ ID NO：3显示了趋化素样因子变异体CKLF2的核酸序列，SEQ ID NO：4显示了由SEQ ID NO：3推测的CKLF2氨基酸序列。SEQ ID NO：5显示了趋化素样因子变异体CKLF3的核酸序列，SEQ ID NO：6显示了由SEQ ID NO：5推测的CKLF3氨基酸序列。SEQ ID NO：7显示了趋化素样因子变异体CKLF4的核酸序列，SEQ ID NO：8显示了由SEQ ID NO：7推测的CKLF4氨基酸序列。

发明详述

根据本发明的第一个目的，本发明提供了一个具有免疫细胞趋化作用及造血细胞刺激活性的趋化素样因子CKLF1，所述趋化素样因子CKLF1具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或保藏登记号CGMCC No.0392大肠杆菌中的重组质粒编码的氨基酸序列。CKLF1是由SEQ ID NO：1所示的核酸序列编码产生的。趋化素样因子最初被称为U937细胞来源的趋化因子(U937-derived chemokine，简称UCK)，后经国际基因标准化命名委员会(International Committee on Standardized GeneticNomenclature)建议，将其命名为趋化素样因子(chemokine likefactor，简称CKLF)。

CKLF1由99个氨基酸残基组成，分子量为10,923道尔顿。氨基酸序列分析显示：CKLF1具有趋化因子CC亚家族的显著特征，序列中存在两个连续的半胱氨酸。CKLF1没有明显的信号肽序列、DNA结合位点及N-糖基化位点，其氮端的12-20位氨基酸为疏水区，可能含有天然切割位点。CKLF1与已知蛋白无明显同源性，CKLF1的第35-79位氨基酸与线虫permease蛋白有46％的同源性。CKLF1属于分泌性蛋白，可以在人体结肠、胰腺、脑、心脏和胚胎组织以及在相关组织来源的肿瘤中检测到CKLF1。实验表明CKLF1具有明显的趋化作用和促进造血细胞和骨骼肌细胞增殖作用(参见实施例6，7，8，10)。

本发明还涉及趋化素样因子的变异体，变异体可以包括本发明人已检测并命名为CKLF2、CKLF3和CKLF4的多肽，它们分别具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，以及相应的SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示的核酸序列。CKLF2、CKLF3和CKLF4依次具有152、67和120个氨基酸，这几种变异体可能是CKLF1基因不同的剪切过程形成的。可以在结肠癌、肺腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中以及胚胎组织中检测到CKLF2、CKLF3和CKLF4的存在。尤其是CKLF2在正常细胞少量表达，而在多种原发性肿瘤细胞和胚胎细胞中表达水平较高。

本发明还涉及所述趋化素样因子的类似物、衍生物及多肽片段。趋化素样因子类似物是指与趋化素样因子具有至少70％，较好90％，最好95％同源性的多肽。“同源性”是通过多肽之间氨基酸序列的比较以及保守氨基酸残基的数量而确定的。趋化素样因子的衍生物是指CKLF1氨基酸序列中的一或多个残基带有取代基团，衍生物也包括具有附加序列的、或与其他化合物融合的CKLF1。例如为了便于纯化，在CKLF1的侧翼融合其它的氨基酸残基，又如与聚乙二醇或脂质融合以提高多肽的半寿期。所谓趋化素样因子的多肽片段是指具有部分或全部SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，它至少由20个氨基酸组成，最好由40个以上的氨基酸组成，多肽片段最好具有与CKLF1相同或相似的生物学活性。

本发明的多肽可以是天然产生的，或化学合成的，或用DNA重组技术由原核或真核细胞产生的，或用衍生于CKLF1核酸序列的mRNA在无细胞翻译系统中产生。优选重组产生的多肽。化学合成可以用CKLF1的多肽片段作中间体，进而合成全长的趋化素样因子。重组生产方法中可以选用不同的宿主，因此本发明的多肽可以是糖基化或非糖基化的，并且可以包括一个起始蛋氨酸残基。

本发明的趋化素样因子最好是以分离的形式提供的，更好是经过纯化的。“分离的”是指脱离了原有环境的存在状态，如脱离了生物活体或脱离了天然的生存环境。

根据本发明的第二个目的，本发明提供了趋化因子CKLF1的核酸序列。如SEQ ID NO：1所示，CKLF1的核酸序列全长534个碱基，带有polyA和ATTAAA加尾信号，其中的第152-448位是编码序列。CKLF1的核酸序列与已知的基因无明显的同源性，在Genebank的注册登记号为AF096895。

本发明所述的核酸序列可以是DNA或是RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。所述趋化素样因子的核酸序列最好是以分离形式提供的，分离的核酸序列可以只包括成熟多肽的编码序列，也可以包括成熟多肽的编码序列和附加编码序列，还可以包括成熟多肽的编码序列和非编码序列，例如内含子、编码序列5′或3′端的非编码序列等。趋化素样因子的编码序列可以完全相同于SEQ ID NO：1所示的编码序列或保藏菌种CGMCC No.0392重组体携带的编码序列，此外由于遗传密码的简并性，它可以不同于SEQ ID NO：1所示的或保藏物所携带的编码序列。

CKLF1的基因片段可作为寡核苷酸探针来分离CKLF1全基因或探察与其有高度同源性的核酸序列。探针至少含有30个碱基，最好含有50个以上的碱基。在合适的条件下用标记的探针与cDNA文库、基因组DNA文库或RNA文库杂交，从中可以分离出与探针杂交的核酸序列。与探针杂交的核酸序列可以具有至少10个碱基，最好30个以上的碱基。

本发明进一步涉及CKLF1变异体的核酸序列，具体地说是CKLF2、CKLF3和CKLF4的核酸序列，依次如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。这些序列编码的蛋白产物相对于CKLF1没有发生移码变化，可以视作CKLF1核酸编码序列的等位基因变异体。可以在1999年10月以后GenBank公布的资料中查询到上述序列，CKLF2为AF135380；CKLF3为AF135381；CKLF4为AF145216。

本发明还涉及与CKLF1的基因序列至少有70％，较好90％，最好95％同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与上述CKLF1基因杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备95％的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括CKLF1核酸序列的等位基因变异体、也可以包括CKLF1核酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的多肽可以在功能上与本发明的CKLF1相同、相似、或不同，但最好是编码与CKLF1生物学活性基本相同的多肽。

根据本发明的第三个目的，本发明提供了用DNA重组技术生产趋化素样因子的方法，其中涉及携带所述CKLF1核酸序列的载体、载体转入宿主细胞的途径、带有载体的宿主细胞以及由宿主细胞产生多肽的方法。

可以通过限制性内切酶位点将CKLF1基因引入载体。载体可以是染色体来源、非染色体来源或人工改造的，例如SV40的衍生物，细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、噬菌粒(由质粒和噬菌体DNA组合体衍生的载体)、以及病毒(如杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)载体。载体一般带有复制原点、启动子、选择标志等遗传元件。启动子的例子有RSV、HIV、CMV或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λP_L启动子等。选择标志基因的例子有适用于真核细胞的新霉素抗性或二氢叶酸还原酶基因，适用于大肠杆菌的氨苄青霉素或四环素抗性基因。表达载体还可以带有启动翻译的核糖体结合位点和转录终止子序列。用于真核细胞的表达载体一般带有CMV、SV40、HSV胸苷激酶等真核细胞启动子和增强子(通过作用于启动子提高转录效率，由10-300个核苷酸组成的顺式作用元件)等调控元件，必要时还可在启动子和结构基因之间插入一段指导翻译产物向周质或细胞外分泌的前导序列。适用于真核细胞的载体包括pMT-hIL3(马大龙，狄春辉，庞健等，(1991)高技术通讯11：26-29)，pQE-9(Qiagen)，pD10和pNH18A(Stratagene)，pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia)，pcDNA3(Invitrogen？)，pCI(Promega)，pWLNEO和pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。

携带本发明CKLF1基因的载体可以通过转导、转化或转染的方法转入宿主细胞。常用的方法包括氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法。可以选择任何适当的宿主细胞表达本发明的CKLF1基因，例如细菌细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等，真菌细胞如酵母细胞等，昆虫细胞如果蝇、中国家蚕细胞等，哺乳动物细胞如CHO、COS和HEK293细胞等，以及人细胞如TF-1、U937和Hela细胞等。在本发明的实施例方案中，选择了高等真核细胞如哺乳动物细胞及人肿瘤细胞，低等真核细胞如酵母细胞，及原核细胞如大肠杆菌细胞作为宿主细胞。

宿主细胞可以在普通营养培养基中或特殊培养基中生长。特殊培养基是指为活化启动子、筛选转化体或扩增基因等目的而特别配制的培养基。温度、pH值等培养条件依不同的宿主细胞而定，待宿主细胞的生长密度适合时，可以用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。并从宿主细胞或培养基中回收和纯化本发明的CKLF1及其变异体多肽，方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

根据本发明的第四个目的，本发明公开了CKLF1及其编码序列在疾病治疗和的诊断中的用途。第一，CKLF1具有广谱的细胞趋化作用(参见实施例5)，提示它可以用于感染性疾病等多种病症的治疗。例如，对炎症细胞的趋化作用使其有可能作为抗炎症药物治疗自身免疫性疾病。

第二，CKLF1具有促进骨髓细胞增殖及集落形成的作用，如实施例7，8所示。因而可以刺激机体的造血功能，用于治疗造血系统疾病，包括原发性或继发性造血功能障碍等病症。

第三，CKLF1具有促进细胞增殖的作用。在实施例10中，CKLF1可以在体内刺激骨骼肌细胞和毛囊增殖，因此可以用它治疗肌肉萎缩或其他退行性病变。应该提及的是增殖中的骨骼肌细胞更易于接受外源DNA，因而在使用DNA疫苗或注射DNA药物治疗疾病时，可以同时注射CKLF1以促进DNA疫苗或药物的吸收，提高免疫及治疗效果。本发明的CKLF1具有体内刺激毛囊细胞增殖的作用，可以用作促进毛囊增生剂治疗脱发症。

第四，CKLF1基因在多种组织和细胞中表达，尤其是在胚胎组织和肿瘤细胞中高水平表达(参见实施例9)。可以用本发明的核酸序列作诊断试剂，结合限制性片段长度多态性分析(RFLP)、萤光原位杂交法(FISH)等方法，检测体内突变的CKLF1基因以诊断因CKLF1表达不足或过量所致的病理状态。也可以用CKLF1蛋白的纯化产物，通过放射免疫分析、竞争性结合法、Western印迹分析或酶联免疫吸附法(ELISA)达到同样目的。，

根据本发明的第五个目的，本发明的CKLF1及其活性成分可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂相混合以制备药物组合物。可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成多种剂型，例如溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。载体或赋形剂的例子包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。可根据需要在组合物中添加辅助成：例如与本发明CKLF1有协同作用的化合物；又如人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或赖氨酸)和金属阳离子(如Zn²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺和Ca²⁺)等蛋白保护剂；聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽等稳定剂；蛋白酶抑制剂及自由基清除剂；以及在粘膜或皮肤局部给药的情况下，添加二甲基亚砜或月桂氮卓酮等皮肤渗透剂。

根据本发明的第六个目的，可以用本发明的CKLF1多肽及其片段、类似物或衍生物作为免疫原制备相应的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体，可以是嵌合的、单链的或人源化抗体及其Fab片段。可以用杂交瘤技术生产人单克隆抗体，可以用转基因小鼠制备人源化抗体。可以用CKLF1的抗体来分离趋化素样因子，由CKLF1的多肽片段产生的抗体也能够与整个趋化素样因子结合。

根据本发明的第七个目的，本发明涉及可以阻断或封闭CKLF1活性的CKLF1拮抗剂。拮抗剂可以与一或多种药学上可接受的载体、赋形剂或辅料结合形成药物组合物。将本发明的拮抗剂作为疫苗导入肿瘤细胞，有可能在肿瘤治疗中发挥疗效。拮抗剂同样有可能应用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫病、变态反应、异常增生性疾病及病毒感染等疾病。

根据本发明的另一个目的，本发明涉及一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中是否存在编码所述趋化素样因子多肽的多核苷酸。

优选地，上述来自宿主的样品是包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌在内的肿瘤细胞。

另外，本发明还涉及一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中是否存在所述趋化素样因子多肽。

优选地，上述来自宿主的样品是包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌在内的肿瘤细胞。

最佳实施方案

下述实施例并不以任何方式，构成对本发明创作权利要求范围的限制。

实施例1：从U937细胞cDNA中分离IL-10抑制的相关基因

1.1细胞培养

U937细胞(ATCC Deposit No.CRL-2367)培养在含10％胎牛血清，100U/ml青链霉素的RPMI1640培养基中。每3-4天传代一次。细胞批量培养至2×10⁷细胞，离心，收集细胞用Hank’s液洗三遍后悬于含10ng/mlPHA的10％FCS RPMI1640中，其中半数细胞(1×10⁷细胞)作为SSH中的tester，另一半细胞中加入终浓度为100ng/ml的IL-10作为driver，继续培养8小时后收集细胞，用于提取mRNA合成双链cDNA。

1.3双链cDNA的合成

用Pharmacia公司的QuickPrepmicro mRNA purification kit，依照说明书提取U937细胞的mRNA。用CLONTECH公司PCR-Select^TM cDNASubtraction Kit提供的试剂和酶，分别以上述Driver和Tester mRNA为模板，依照说明书合成单链及双链cDNA。

1.4 SSH差示杂交

如图1所示，tester和driver组cDNA 2μg用Rsa I切后，分为两组的tester在连接酶作用下分别与Adapter1和Adapter2连接。与变性driver杂交后，将两组杂交产物混合物并加入变性driver。再次杂交的产物稀释1000倍，利用试剂盒提供的PCR引物，第一轮PCR扩增27个循环。将第一轮PCR产物稀释10倍，以NESTED引物1和NESTED引物2进行第二轮PCR，扩增15个循环。扩增产物即为差异基因片段，回收200-1600bp的片段克隆至pGEM-T easy载体(promega公司)，转化XL-Blue菌后筛选阳性克隆。

1.6测序反应：

测序质粒用Qiagen公司tip-20 Minipreparation Kit纯化，用ALFexpress II自动DNA测序仪(Pharmacia)在大连宝生生物工程公司测序。

结果

测得的序列如SEQ ID NO：1所示，用EST Assembly Machine(http：//www.tigem.it)进行序列拼接。用于CKLF1拼接的EST片段编号为W38899，N95062，AA429945，AA987264，AA927461，W19056，N89912，AA516431，AA479657，AA455042，AA989129，W52820。拼接后得到完整CKLF1的cDNA序列，序列分析显示CKLF1全长cDNA为534bp，包括PolyA序列及“ATTAAA”加尾信号。从第152-448个碱基为开放读码框架，编码99个氨基酸。通过国际互连网(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)与GenBank中的序列进行同源性比较，新基因CKLF1的登记号为AF096895。

用网站 http：//www.chs.dtu.dk/services/Signal P提供的PcGene、Prosite和Signal P server软件分析CKLF1的氨基酸序列(如SEQ IDNO：2所示)特征。分析表明CKLF1蛋白结构中存在2个连续的半胱氨酸(CC)，具有趋化因子C-C家族的特征。成熟蛋白的第一个氨基酸是甘氨酸。CKLF1没有典型的信号肽序列，其N端的17个疏水性的氨基酸可能是前导序列，未发现穿膜区序列、DNA结合位点及N-糖基化位点。多肽同源性分析发现CKLF1的35-79位氨基酸与线虫(Caenorhabditiselegans)的permease蛋白有46％的同源性，与其它蛋白无同源性。

实施例2 CKLF1变异体的发现

根据CKLF1编码区设计引物P1和P2的序列如下：

P1：5’ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA AT 3’

P2：5’CCG CTC GAG TTA CAA AAC TTC TTT TTT TTC 3’

以P1和P2为引物，分别以PHA刺激，PHA刺激、IL-10抑制的U937细胞cDNA文库为模板进行半定量RT-PCR。扩增条件如下：94℃，2分钟；94℃，15秒，58℃，15秒，72℃，30秒，30个循环；72℃，7分钟。

结果

从两个cDNA文库中扩增出不同大小的PCR产物，克隆入pGEM-T Easy载体，测序得到变异体CKLF2、CKLF3和CKLF4的核酸序列，分别如SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7所示，在GenBank中的登录号依次为AF135380，AF135381，AF145216。

如图2所示，相对于CKLF1的核酸序列(SEQ ID NO：1)而言，CKLF2，3，4的核酸序列没有移码突变，它们分别编码152个、67个和120个氨基酸。CKLF2、CKLF3、CKLF4的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8所示。CKLF3具有保守的氨基端和羧基端序列，CKLF2和CKLF4各自具有不同的外显子序列。PcGene分析显示CKLF2和CKLF4有穿膜区。变异体可能是mRNA的不同剪切造成的。

实施例3：Northern blot检测U937细胞中CKLF1 mRNA的表达

用GIBCO-BRL公司的TRI_ZOL ^TM剂提取组织及细胞的总RNA。分别取1×10⁷tester组和driver组U937细胞，离心后加入1ml TRI_ZOL ^TM试剂，破碎细胞后加入0.2ml氯仿，离心后的上清用异丙醇沉淀，乙醇洗涤，干燥后的总RNA复悬于无RNase的H₂O中，用分光光度计(Beckman公司，640nm)定量。

每4倍体积的RNA样品加入1倍体积的5X RNA上样缓冲液，混匀65℃孵育3-5分钟，冰浴。本实验每个上样孔中的RNA均为20μg。在5-7V/cm的电压下、1.2％的甲醛变性胶上电泳，用毛细管吸引法将RNA转到尼龙膜上。

用探针标记SSH杂交得到的CKLF1全长EST片段，随机引物荧光素标记试剂盒(DuPont NEN^NELMGC-803，Random Primer FluoresceinLabeling kit with Antifluorescein-HRP)购自DUPONT公司，标记、杂交、洗膜及显色的操作详见说明书。

结果

由图3可见：CKLF1基因大小约500bp，在PHA培养8小时后的U937细胞中高表达，IL-10能够抑制其表达。

实施例4 CKLF1在原核细胞中的表达

4.1原核表达载体的构建

根据CKLF1的cDNA序列设计上、下游引物P1和P2：

P1’：5’CTG ATA CCA GAA ACC ACA ACA TT 3’

P2’：5’GGA AGA ATA CAG AAA TAT GTT TAA TAC 3’

以实施例1中的测序质粒为模板，P1’和P2’(带有XhoI酶切位点)为引物进行PCR扩增。PCR产物用Klenow去除3′端多余的碱基“A”，用XhoI酶切后，与StuI-XhoI酶切的pMTY4连接，构建重组质粒pMTY4CKLF1。

4.2 CKLF1的表达及纯化

pMTY4CKLF1能够在42℃的温度诱导下，在pop2136大肠杆菌中以包涵体的形式表达融合蛋白MS2-CKLF1，两种表达产物由带凝血酶切点的多肽连接。收集细菌，超声裂解包涵体，包涵体在8M尿素，20mMGlysine-NaOH(pH10.0)中37℃变性30分钟、尿素稀释至1M复性，凝血酶25℃酶切过夜。利用Q-琼脂糖凝胶离子交换层析进行蛋白纯化。酶切后的蛋白在20mM Glysine-NaOH(pH10.0)中上样，用50mM Tris-HCl(pH8.9)洗柱，在0.04M NaCl盐浓度洗脱下目的蛋白。

结果

如图4所示：MS2-CKLF1融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，表达量约占菌体蛋白的30％，并且有双体蛋白存在，双体分子约占单体表达蛋白质的1/4。

实施例5 CKLF1，2，4在真核细胞内的定位

重组质粒的构建类似实施例4，P1’和P2’扩增CKLF1，2，4片段，PCR产物用Klenow处理、XhoI酶切，载体pEGFP-C3(购自CLOTECH公司)经EcoRI切割、Klenow处理后再用SalI酶切，表达载体pEGFPC3-CKLF1可在真核细胞中表达加强的绿色荧光蛋白(EGFP)和CKLF1的融合蛋白，CKLF1的读码框架与EGFP的一致。

利用SuperFect(Qiagen公司)将pEGFPC3-CKLF1，2，4转染进Hela细胞，转染的细胞爬片，72小时后，玻片用PBS洗三遍，用PBS或4％多聚甲醛固定，室温放置30分钟后用PBS清洗。在荧光显微镜下观察CKLF1所在的部位。

结果

观察到荧光标记的CKLF1在细胞内少量弥散性存在，结合COS-7细胞的转染上清活性实验，表明CKLF1为分泌型蛋白；荧光标记的CKLF2和CKLF4主要存在于细胞膜上。

实施例6：CKLF1的细胞趋化作用

6.1细胞及细胞株的制备：

K562细胞是人慢性粒白血病细胞株，U937细胞是人髓性白血病细胞株，TF-1是人红系白白血病细胞株，HL-60细胞是人早幼粒白血病细胞株，在常规细胞培养基1640中加入1.3％DMSO，培养4天，HL-60分化为粒系白细胞。

外周血嗜中性粒白细胞，淋巴细胞和单核细胞的分离：取健康成人外周血12ml，加入终浓度25-50单位/毫升无防腐剂肝素注射液和2倍体积Hank’s液，轻轻混匀，分别取4ml Hank’s液稀释后的抗凝血缓缓加入含2ml Ficoll-Hypaque(1.077g/cm³±0.002)分层液中，2000转/分钟，4C离心25分钟，吸取血浆与分层液界面的单核细胞，将单核细胞悬于1640中37C培养30分钟，上清中的非粘附细胞即淋巴细胞，将平皿中加入5％FCS的1640和0.5％EDTA，消化粘附的单核细胞，即可得到淋巴细胞和单核细胞；吸取红细胞上面的粒细胞，用PH7.2的NH4Cl-Tris溶解残留的红细胞以纯化粒细胞。

6.2趋化实验

用EcoRI从pGEM-T切下CKLF1基因片段，将其克隆入用EcoRI酶切的pcDI载体，得到重组质粒pcDI-CKLF1(+)。用pcDI空载体作对照，将pcDI和pcDI-CKLF1的转染上清作倍比稀释，加入趋化小室下层孔。调整细胞浓度至1×10⁶/ml，加入趋化小室上层孔。嗜中性粒细胞37·孵育1小时，其余细胞孵育3小时。取膜，刮去非特异细胞，甲醇固定，Giemsa染色。在40倍显微镜下，随机选5个视野记数，取平均值计算趋化指数(实验组迁移的细胞数与对照组非特异迁移的细胞数的比值)。

结果

如图5A-I所示，pcDI-CKLF1的转染上清对人外周血的嗜中性粒细胞，单核细胞，U937细胞，K562细胞和DMSO刺激的HL-60细胞和小鼠腹腔巨噬细胞及淋巴细胞具有明显的趋化作用，而对TF-1细胞，NFS-60细胞及未经刺激的HL-60细胞没有趋化作用。这表明CKLF1是一个具有广谱趋化活性的分泌蛋白。强还原剂DTT能够完全阻断CKLF1的趋化活性。CKLF1的趋化作用表现出剂量依赖性。

实施例7：CKLF1，2，3对小鼠骨髓细胞增殖作用分析：

7.1真核表达载体的构建

质粒pCI购自Promega公司，pcDNA3购自Invirtogen公司，质粒pcDI为本室构建，是将pcDNA3的BglI-KpnI片段与pCI的BglI-KpnI片段置换后得到的一个真核表达质粒。

以P1和P2为引物，从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中扩增CKLF1，2，3基因，分别将其克隆到pGEM-T easy载体，用EcoRI酶切产生带有粘末端的基因片段，再将其克隆到真核表达载体pcDI的EcoRI位点中，筛选正确插入的质粒，分别命名为pcDI-CKLF1，2，3(如图6所示)。用高效转染剂Superfect(Qiagen公司)将纯化质粒转入COS-7细胞，收集转染上清用作活性分析。

7.2 MTT法测定细胞的增殖

取Balb/c小鼠骨髓细胞，用pH7.2的NH₄Cl-Tris溶解红细胞，调整细胞浓度至1.5×10⁶/ml，铺到96孔细胞培养板中，阴性对照组为培养72小时的COS-7细胞上清(10μl)，阳性对照组为终浓度100ng/ml的小鼠IL-3和SCF。实验组分别加10μl pcDI-CKLF1，pcDI-CKLF2和pcDI-CKLF3转染上清，每组做6个复孔，37℃，5％CO2培养90小时后，加入10μl 10mg/ml的MTT，6小时后加裂解液(50％DMSO，20％SDS，pH 4.4)，用酶标仪测定570mM的光吸收值。

结果

如图7所示，CKLF1，2转染上清对小鼠骨髓细胞有明显的促增殖作用，CKLF3的作用较弱。细胞培养72小时时，各组细胞之间没有明显区别，有较多细胞死亡；当培养至80小时后，CKLF1和CKLF2组即有大量的中等大小、形态相似的圆形细胞出现，CKLF3组该种形态的细胞很少，细胞形态和数量与pcDI相比，没有显著性区别。如图8A和图8B所示。

实施例8：CKLF1对人低密度骨髓细胞生长的作用

8.1促增殖作用

用Ficoll-Hypaque分层液分离健康人低密度骨髓细胞，将分离纯化后的骨髓细胞调整为2×10⁶/ml，铺到96孔板中。阴性对照组为10μl常培养72小时的COS-7细胞上清，阳性对照组为10μl终浓度100ng/ml的rhGM-CSF，实验组加10μl相应的原浓度转染上清，MTT法测定光吸收值的操作同上。

结果

如图9所示：终浓度10倍稀释的CKLF1转染上清，能明显促进人低密度骨髓细胞的增殖，增殖程度与终浓度100ng/ml的GM-CSF相似。

8.2促进集落形成

正常人外周血低密度骨髓细胞经Ficoll-Hypaque(1,077g/cm³)分离纯化后，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，接种到0.3％软琼脂中。对照组加相同体积1640培养基，实验组加终浓度为100ng/ml的rhGM-CSF和不同稀释度的pcDI-CKLF1转染上清及pcDI转染上清。37℃，5％CO2培养两星期，统计不同组的集落数，多于50细胞的为一个集落。

结果

如表1所示：CKLF1正义转染上清本身能明显促进人低密度骨髓细胞集落的形成，与终浓度100ng/ml的GM-CSF有明显的协同作用。CKLF1刺激的骨髓细胞中含有巨型细胞，如图10所示，且细胞比单纯GM-CSF刺激的细胞存活时间更长。

表1：CKLF1转染上清对人低密度骨髓细胞粒单系集落形成的促进作用

Concentration	GM-CSF	pcDI	CKLF1	GM-CSF+pcDI	GM-CSF+CKLF1
						10-1	22±3	11±2	28±3	21±2	36±3
15-1	11±1	16±2	23±1	28+2
					30-1	10±3		10±2	20±2	22±2

实施例9：CKLF1及其变异体在正常细胞和肿瘤细胞的表达。

为分析CKLF1在各种胚胎组织，成人组织及肿瘤组织的表达水平和剪切形式，以Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒提供的单链cDNA文库作模板，利用CKLF1编码区特异性引物(同构建pcDI载体的引物)，进行PCR扩增，扩增条件同前。

结果

CKLF1及其变异体在正常成人组织中表达水平低或不表达(图11A和B)，尤其在胰腺和前列腺中几乎检测不到；CKLF1和CKLF2在多种胚胎组织和肿瘤组织如乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌中高表达(图11C和11D)，但CKLF3和CKLF4的表达水平较低。上述结果提示CKLF1可能与胚胎发育及肿瘤的发生有密切关系。

实施例10：CKLF1基因在哺乳动物体内的生物活性研究

选择4-6周龄的BABL/c小鼠(购自中国医学科学院遗传所)为实验动物。利用Qiagen公司的质粒纯化系统纯化真核表达质粒pcDI-CKLF1，应用基因直接注射的方法将pcDI-CKLF 1注射至小鼠肌肉组织及皮下组织(100μg/只)。注射后第10天、第30天分别采取注射局部的小鼠肌肉组织及皮下组织，冰冻切片，并作苏木精-伊红(HE)、孚尔根(Feulgen)、酸性磷酸酶(AcP)酶染色分析，高倍镜观察。通过组织学、免疫组织化学、酶学的方法观察pcDI-CKLF1表达产物在注射组织局部的生物学效应。

结果

pcDI-CKLF1表达产物具有：(1)趋化炎症细胞至注射局部组织的作用；(2)促进骨骼肌细胞增殖及分化的作用；(3)促进毛囊角质细胞增殖及分化的作用。

结果

AcP染色(图12A和12B)和HE染色(图13A和13B)的结果显示：注射0.9％生理盐水及空质粒的对照组骨骼肌细胞(实验对照组)与小鼠正常骨骼肌细胞的形态结构相比，形态结构未见明显改变。而注pcDI-CKLF1(实验组)的骨骼肌局部组织出现细胞核增多，细胞核居中，并呈串装排列现象，同时伴随着单核吞噬细胞等细胞的浸润现象。第10，20，30天非常明显，尤以第10天最为显著。

Feulgen反应显示脱氧核糖核酸(DNA)结果：经Leica Q500MC图象分析仪分析，与实验对照组相比，实验组中骨骼肌组织的DNA着色反应的平均光密度值(MOD)明显增高(参见表2)，提示骨骼肌组织内细胞核显著增多.其中肌注+针刺组中胞核增多较对照更为明显(t检验p＜0.01)。

表2注射局部骨骼肌组织Feulgen氏反应结果分析(x±s，单位MOD)

质粒	PcDI-CKLF1(实验组)		PcDI(对照组)
					组别	A	B	A	B
细胞核个数	514.33±32.18	666.7±42.51	67.18±11.21	63.43±14.34
					细胞核光密度值	0.134±0.017	0.118±0.023	0.098±0.008	0.094±0.001

注：A为布比卡因+肌注，B为肌注+针刺。

                       1

                     序列表

(1)、一般信息

    (i)申请人：北京医科大学、北京北医联合生物工程公司

    (ii)发明名称：具有免疫细胞趋化作用和造血刺激作用的趋化素样因子

    (iii)序列数：8

    (iv)通讯地址：

        (A)联系人：马大龙

        (B)街道：海淀区学院路38号

        (C)城市：北京

        (D)国家：中华人民共和国

        (E)邮编：100083

    (v)计算机可读形式：

        (A)介体类型：3.5英寸软盘

        (B)计算机：奔腾166MMX

        (C)操作系统：WINDOWS 95

        (D)软件：WORD 97

    (vi)电讯信息：

        (A)电话：86-10-62091149

        (B)电传：86-10-62091149

                                2

(1)SEQ ID NO：1的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：534个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：cDNA

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：1

      3       9      15      21      27      33      39      45

      |       |       |       |       |       |       |       |

  1 GTT CCC AAT CTG AAG TGA AGC CGA GCT GGG CGA GAA GTA GGG GAG

 46 GGC GGT GCT CCG CCG CGG TGG CGG TTG CTA TCG CTT CGC AGA ACC

 91 TAC TCA GGC AGC CAG CTG AGA AGA GTT GAG GGA AAG TGC TGC TGC

136 TGG GTC TGC AGA CGC GAT GGA TAA CGT GCA GCC GAA AAT AAA ACA

181 TCG CCC CTT CTG CTT CAG TGT GAA AGG CCA CGT GAA GAT GCT GCG

226 GCT GGA TAT TAT CAA CTC ACT GGT AAC AAC AGT ATT CAT GCT CAT

271 CGT ATC TGT GTT GGC ACT GAT ACC AGA AAC CAC AAC ATT GAC AGT

316 TGG TGG AGG GGT GTT TGC ACT TGT GAC AGC AGT ATG CTG TCT TGC

361 CGA CGG GGC CCT TAT TTA CCG GAA GCT TCT GTT CAA TCC CAG CGG

406 TCC TTA CCA GAA AAA GCC TGT GCA TGA AAA AAA AGA AGT TTT GTA

451 ATT TTA TAT TAC TTT TTA GTT TGA TAC TAA GTA TTA AAC ATA TTT

496 CTG TAT TCT TCC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA

(2)SEQ ID NO：2的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：99个氨基酸

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：蛋白质

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：2

                     5                  10                  15

                     |                   |                   |

 1 Met Asp Asn Val Gln Pro Lys Ile Lys His Arg Pro Phe Cys Phe

16 Ser Val Lys Gly His Val Lys Met Leu Arg Leu Asp Ile Ile Asn

31 Ser Leu Val Thr Thr Val Phe Met Leu Ile Val Ser Val Leu Ala

46 Leu Ile Pro Glu Thr Thr Thr Leu Thr Val Gly Gly Gly Val Phe

61 Ala Leu Val Thr Ala Val Cys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Leu Ile

76 Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys

91 Pro Val His Glu Lys Lys Glu Val Leu

                                3

(1)SEQ ID NO：3的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：459个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：cDNA

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：3

      3       9      15      21      27      33      39      45

      |       |       |       |       |       |       |       |

  1 ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA ATA AAA CAT CGC CCC TTC TGC TTC

 46 AGT GTG AAA GGC CAC GTG AAG ATG CTG CGG CTG GCA CTA ACT GTG

 91 ACA TCT ATG ACC TTT TTT ATC ATC GCA CAA GCC CCT GAA CCA TAT

136 ATT GTT ATC ACT GGA TTT GAA GTC ACC GTT ATC TTA TTT TTC ATA

181 CTT TTA TAT GTA CTC AGA CTT GAT CGA TTA ATG AAG TGG TTA TTT

226 TGG CCT TTG CTT GAT ATT ATC AAC TCA CTG GTA ACA ACA GTA TTC

271 ATG CTC ATC GTA TCT GTG TTG GCA CTG ATA CCA GAA ACC ACA ACA

316 TTG ACA GTT GGT GGA GGG GTG TTT GCA CTT GTG ACA GCA GTA TGC

361 TGT CTT GCC GAC GGG GCC CTT ATT TAC CGG AAG CTT CTG TTC AAT

406 CCC AGC GGT CCT TAC CAG AAA AAG CCT GTG CAT GAA AAA AAA GAA

451 GTT TTG TAA

(2)SEQ ID NO：4的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：152个氨基酸

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：蛋白质

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：4

                      5                  10                  15

                      |                   |                   |

  1 Met Asp Asn Val Gln Pro Lys Ile Lys His Arg Pro Phe Cys Phe

 16 Ser Val Lys Gly His Val Lys Met Leu Arg Leu Ala Leu Thr Val

 31 Thr Ser Met Thr Phe Phe Ile Ile Ala Gln Ala Pro Glu Pro Tyr

 46 Ile Val Ile Thr Gly Phe Glu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Ile

 61 Leu Leu Tyr Val Leu Arg Leu Asp Arg Leu Met Lys Trp Leu Phe

 76 Trp Pro Leu Leu Asp Ile Ile Asn Ser Leu Val Thr Thr Val Phe

 91 Met Leu Ile Val Ser Val Leu Ala Leu Ile Pro Glu Thr Thr Thr

106 Leu Thr Val Gly Gly Gly Val Phe Ala Leu Val Thr Ala Val Cys

121 Cys Leu Ala Asp Gly Ala Leu Ile Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn

136 Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro Val His Glu Lys Lys Glu

151 Val Leu

                               4

(1)SEQ ID NO：5的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：204个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：cDNA

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：5

      3       9      15      21      27      33      39      45

      |       |       |       |       |       |       |       |

  1 ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA ATA AAA CAT CGC CCC TTC TGC TTC

 46 AGT GTG AAA GGC CAC GTG AAG ATG CTG CGG CTG GTG TTT GCA CTT

 91 GTG ACA GCA GTA TGC TGT CTT GCC GAC GGG GCC CTT ATT TAC CGG

136 AAG CTT CTG TTC AAT CCC AGC GGT CCT TAC CAG AAA AAG CCT GTG

181 CAT GAA AAA AAA GAA GTT TTG TAA

(2)SEQ ID NO：6的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：67个氨基酸

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：蛋白质

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：6

                     5                  10                  15

                     |                   |                   |

 1 Met Asp Asn Val Gln Pro Lys Ile Lys His Arg Pro Phe Cys Phe

16 Ser Val Lys Gly His Val Lys Met Leu Arg Leu Val Phe Ala Leu

31 Val Thr Ala Val Cys Cys Leu Ala Asp Gly Ala Leu Ile Tyr Arg

46 Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro Val

61 His Glu Lys Lys Glu Val Leu

                         5

(1)SEQ ID N0：7的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：363个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：cDNA

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：7

      3       9      15      21      27      33      39      45

      |       |       |       |       |       |       |       |

  1 ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA ATA AAA CAT CGC CCC TTC TGC TTC

 46 AGT GTG AAA GGC CAC GTG AAG ATG CTG CGG CTG GCA CTA ACT GTG

 91 ACA TCT ATG ACC TTT TTT ATC ATC GCA CAA GCC CCT GAA CCA TAT

136 ATT GTT ATC ACT GGA TTT GAA GTC ACC GTT ATC TTA TTT TTC ATA

181 CTT TTA TAT GTA CTC AGA CTT GAT CGA TTA ATG AAG TGG TTA TTT

226 TGG CCT TTG CTT GTG TTT GCA CTT GTG ACA GCA GTA TGC TGT CTT

271 GCC GAC GGG GCC CTT ATT TAC CGG AAG CTT CTG TTC AAT CCC AGC

316 GGT CCT TAC CAG AAA AAG CCT GTG CAT GAA AAA AAA GAA GTT TTG

361 TAA

(2)SEQ ID NO：8的信息

    (i)序列特征：

        (A)长度：120个氨基酸

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：蛋白质

    (iii)序列描述：SEQ ID NO：8

                      5                  10                  15

                      |                   |                   |

  1 Met Asp Asn Val Gln Pro Lys Ile Lys His Arg Pro Phe Cys Phe

 16 Ser Val Lys Gly His Val Lys Met Leu Arg Leu Ala Leu Thr Val

 31 Thr Ser Met Thr Phe Phe Ile Ile Ala Gln Ala Pro Glu Pro Tyr

 46 Ile Val Ile Thr Gly Phe Glu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Ile

 61 Leu Leu Tyr Val Leu Arg Leu Asp Arg Leu Met Lys Trp Leu Phe

 76 Trp Pro Leu Leu Val Phe Ala Leu Val Thr Ala Val Cys Cys Leu

 91 Ala Asp Gly Ala Leu Ile Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser

106 Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro Val His Glu Lys Lys Glu Val Leu

Claims (21)

1、一种分离的选自下列物质组之一的多核苷酸：

(a)一种编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸；

(b)一种编码保藏物CGMCC NO.0392中的cDNA所编码的氨基酸序列的多核苷酸。

2、如权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是cDNA。

3、如权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。

4、如权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是基因组DNA。

5、如权利要求2的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

6、一种用于原核细胞和/或真核细胞的载体，其特征在于，该载体含有权利要求1-5任一项所述的多核苷酸。

7、一种含有权利要求6的载体的宿主细胞，其经权利要求6的载体转化、转染或转导得到。

8、一种生产趋化素样因子的方法，包括将权利要求6的载体导入宿主细胞，在合适的条件下培养宿主细胞，并从细胞裂解物或细胞外培养基中获得由所述载体携带的多核苷酸编码的多肽。

9、一种趋化素样因子多肽，其选自下列物质组之一：

(a)一种具有推定的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；

(b)一种具有保藏物CGMCC NO.0392中的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽。

10、如权利要求9的多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并且具有趋化作用和促进细胞增殖作用。

11、如权利要求9的多肽，其具有保藏物CGMCC NO.0392中的cDNA所编码的氨基酸序列，并且具有趋化作用和促进细胞增殖作用。

12、一种单克隆或多克隆抗体，该单克隆或多克隆抗体与权利要求9所述的多肽结合。

13、一种药物组合物，其含有权利要求9的多肽，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

14、权利要求9的多肽在制备免疫佐剂中的用途，其中所述免疫佐剂能够提高机体对DNA疫苗或DNA药物的吸收。

15、权利要求9的多肽在制备能够治疗炎症、退行性病变和造血功能障碍的药物组合物中的用途。

16、如权利要求15的用途，其中所述退行性病变包括肌肉萎缩、肌肉病变和脱发。

17、一种体外检测方法，包括检测编码权利要求9的多肽的多核苷酸序列中的突变。

18、一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中是否存在编码权利要求9的多肽的多核苷酸。

19、如权利要求18的方法，其中所述来自宿主的样品是包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌在内的肿瘤细胞。

20、一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中是否存在权利要求9的多肽。

21、如权利要求20的方法，其中所述来自宿主的样品是包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌在内的肿瘤细胞。

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