CN1197210A - 同时检测多项肿瘤标志物的多带薄层分析法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种能同时检测多项肿瘤标志物指标的薄层分析法,它可应用于对常见肿瘤的普查、肿瘤的早期诊断、辅助诊断、鉴别诊断以及对肿瘤治疗效果的监测。本发明的检测装置由加样垫片(1)、层析膜起始端(2)、显色颗粒储存区(3)、检测带(4)——(9)、对照控制带10、层析膜终末端(11)和吸水垫片(12)组成。本发明的特点是提供了一种可同时对多项肿瘤标志物指标进行检测的技术方案。

Description

同时检测多项肿瘤标志物的多带薄层分析法

本发明涉及一种同时检测多项肿瘤标志物的技术方案，它可广泛应用于肿瘤的普查、早期诊断、辅助诊断、鉴别诊断以及对肿瘤治疗效果的监测。本发明还涉及上述检测方法的专用装置。

由于对传染病的逐渐控制，人类平均寿命普遍延长，恶性肿瘤对人类的威胁显得日益突出，使得肿瘤的防治工作变得越来越重要。肿瘤的早期诊断是肿瘤防治领域的一个重要环节，能否及早发现肿瘤的存在，直接影响到对肿瘤的治疗及其预后，许多肿瘤治疗的关键在于早期发现和早期治疗，从而使病人有可能得到根治的机会。

许多肿瘤细胞能制造和释放抗原、激素和酶等多种产物，有些产物来自肿瘤本身，有些则是异位性的。如果在患者的体液、血液、分泌液或排泄物中，测出这些产物，或者这些产物的含量超过其正常范围，则揭示体内存在着某种肿瘤，这些产物被称为肿瘤标志物(tumor markers)。通过检测这些肿瘤标志物，可为肿瘤的诊断提供依据。

近年来，越来越多的肿瘤标志物已被发现，其中很多已开始应用于肿瘤的诊断，例如：甲胎蛋(AEP)可用于肝癌的普查(参见高等医药学院统编教材-内科学，第三版404页)，抗EB病毒壳抗原的IgA抗体(VCA-IgA抗体)可用于鼻咽癌的早期发现(参见高等医药学院统编教材-外科学，第三版220页)，前列腺特异性抗原(PSA)可用于前列腺癌的早期诊断及其疗效检测(参见美国密执安大学医学院的研究人员Gao X和Porter AT在杂志“Prostate，31(4)：264-81，1997 Jun”上发表的文章)，癌抗原CA125和OVX1可用于卵巢癌的检测(参见美国加州大学的Berek JS在杂志“Cancer，76(10 Suppl)：2092-6，1995Nov15”上所发表的文章)，肿瘤标志物CA153和GCDFP-15可用于乳癌的检查(参见美国哥伦比亚大学的Farghaly SA在杂志“Gynecologic &Obstetric Investigation，34(2)65-72，1992”上所发表的文章)，以及糖抗原CA19-9可用于消化道肿瘤的检验(参见意大利的GulloL在杂志“Pancreas，9(6)：717-9，1994Nov”上所发表的文章)等。

现在常用的肿瘤标志物检测方法有：放射免疫测定法、放射火箭自显术、对流免疫电泳法和酶联免疫测定法等，虽然这些方法已被应用于临床实践，但它们普遍存在着许多不足之处，主要包括：1.操作复杂：大多数检测需要几个甚至十几个操作步骤才能完成；2.测定时间较长：一般需要1-2小时以上，有的需要1-2天；3.操作专业性强：只能经过特出训练的化验人员才能进行操作，所以不便用于大规模普查；4.价格相对昂贵：需要有一定的仪器设备才能进行检测；5.检测指标单一：一项验一次只能检测一项肿瘤标志物指标。

本发明的目的是要提供一种能一次同时检测多项肿瘤标志物的检验方法，从而为肿瘤的普查、早期诊断、鉴别诊断及其疗效监测等方面提供一种快速简便的检测工具。

1、本发明的主要组成部分及材料：

1).多对抗体：针对每一种被测肿瘤标志物都需选用一对与此标志物能特异结合的抗体，因为本检测方法需要同时检测二种或二种以上的肿瘤标志物，所以需要选用二对或二对以上抗体，常用抗体对的数目为二至十对，但也可为十对以上，抗体可用单克隆重抗体，也可用多克隆重抗体，在产品制备过程中，将每对抗体中的一种抗体固定在层析膜上形成检测带，将另一种抗体固定在显色颗粒上形成检测颗粒。

2).显色颗粒：可用多种其表面能结合抗体等蛋白质的有色颗粒，常用种类包括胶体金颗粒(可从美国圣路易斯SIGMA等公司购买)、乳胶颗粒(可从加拿大温哥华BHT科技有限公司等厂家购买)和其它有色胶体颗粒等。

3).层析膜：层析膜是一种能使液体带动直径小于1微米的颗粒在其上移动的薄膜样品在其上进行层析的薄膜，常用种类包括醋酸纤维素薄膜和一些尼龙薄膜等(可从美国加利福尼亚S&S公司等厂家购买)。在层析膜上根据不同位置可人为划分出几个区域，层析膜上用于加样的一端为起始端，另一端为终末端，在二端之间，从起始端向终末端方向依次为显色颗粒储存区，检测区和对照控制区。在制备过程中，在显色颗粒储存区内加上显色颗粒，在检测区内制备多条检测带，每条检测带上分别固定有抗一种肿瘤标志物的抗体，每条检测带用于一种肿瘤标志物的检测。

4).吸水垫片：它是据有较强吸水能力的膜片或厚纸片等(可从美国新泽西Whatman公司等厂家购买)。

5).加样垫片：此垫片可为多种纤维组成的膜片(可从美国新泽西Whatman公司和加拿大多伦多Fisher科技公司等厂家购买)。在检测时，被测样品将被加到此垫片上。

2、技术实现方案：

1).选择多对抗体：根据待测肿瘤标志物指标的种类和数目选择数对抗体，每一对抗体用于一种肿瘤标志物的检测，对于多种肿瘤标志物的检测，需要选择多对抗体。

2).制备检测带：将每对抗体中的一种抗体固定在层析膜上的检测区内(可用美国北卡罗兰TECAN等公司生产的连续性微量液体加样机将抗体液体喷涂在层析膜上)，使之形成一条抗体带，每条抗体带对应一种被测肿瘤标志物，它可做为相应肿瘤标志物的检测带，对于多种肿瘤标志物，需要制备与之相应的多条抗体带。

3).制备带有抗体的显色颗粒：将每对抗体对中的另外一种抗体，分别连接到显色颗粒上，使之成为带有一种抗体的显色颗粒，一个显色颗粒上只带有抗一种肿瘤标志物的抗体，抗体与显色颗粒之间的连接可以是共价结合，也可以是非特异性吸附，对于多种肿瘤标志物，需要分别制备多种带有相应抗体的显色颗粒，它们分别与层析膜检测区中相应的抗体带一起，共同对应一种相应的肿瘤标志物。

4).制备显色颗粒储存区：将所制备的多种带有不同抗体的显色颗粒按比例混合在一起，然后将它们加在层析膜一端的显色颗粒储存区中，在制作过程中，可以将这些颗粒直接加在层析膜上，也可以将它们先加在另一个垫片上，然后再将垫片放在层析膜上。

5).制备对照控制带：在检测区和终末端之间的层析膜上，制备一条对照控制带，此带由能与显色颗粒表面抗体发生特异性结合的抗抗体组成。

6).各部件的组合：在层析膜起始端放上加样垫片，在层析膜终末端加上吸水垫片，层析膜和各种垫片之间的组合，可以用胶或胶带固定，也可以将之固定于塑料等制品所制的外壳中，然后将所得产品干燥保存直至使用。

7).检测原理及过程：当把液体样品加在加样垫片上后，由于毛细现象，液体样品将自动从起始端沿层析膜向终末端移动，途中依次经过显色颗粒储存区、多条检测带以及对照控制带。

如果被测样品中含有待测肿瘤标志物，当样品经过显色颗粒储存区并与带有抗体的显色颗粒接触时，由于抗原和抗体之间特异的相互作用，该肿瘤标志物将和显色颗粒表面与之相应的抗体相结合，形成肿瘤标志物-抗体一显色颗粒复合物，当这种复合物沿层析膜移动并经过检测区时，将与检测区内相应检测带上的抗体结合，从而被固定在相应的抗体带上，因为显色颗粒带有颜色，所以相应检测带会变成一条有颜色的带，通过观察检测带颜色的变化，便可知道被测样品中是否含有相应的肿瘤标志物。

如果被测样品中不含肿瘤标志物，则所有检测带都不显色，如果被测样品中含有多种肿瘤标志物，将会有与之相应的多条检测带显色，通过对多条检测带进行观察，便可达到同时检测多种肿瘤标志物的目的。

当带有抗体的显色颗粒到达对照控制带后，显色颗粒上的抗体可与对照控制带上的抗抗体结结合，从而使对照控制带显色，此带的显色，标志着该项检测有效。

本发明技术方案所具有的特点：

1.能同时检测多项指标：在一个装置上，一次检验操作就能同时获得多项肿瘤标志物的检测结果。

2.速度快：一般几分钟内，最多十几分钟内，便可完成检测。

3.操作简便：整个操作过程只有一个步骤，即在检测装置上加上被测液体样品，然后通过观测检测带颜色的变化，便可得知检测结果，操作人员不必经过特殊训练，一般成人都可进行操作。

本发明所述的抗原抗体特异性相互作用，也可以是受体和配体之间、抗体和蛋白A或蛋白G之间、生物素及其配体之间的特异相互作用。

下面结合附图1对本发明技术方案的组成结构做进一步详细的说明。

附图1中标号1为加样垫片，此垫片与层析膜起始端相接，当把被测液体样品加于此处后，液体样品可通过此垫片逐渐向层析膜起始端扩散，此垫片的作用在于接受被测液体样品，然后使液体样品能够均匀的逐步向层析膜起始端释放。此垫片所用的材料可根据被测样品液体的种类而定，例如，对于尿液和血清，可选用大孔径吸水性较强的厚滤纸片(可从美国新泽西Whatman等公司购买)，对于全血样品，可选用对血细胞有分离作用的纤维素垫片(可从加拿大温哥华BHT科技公司购买)，当把全血样品加到此垫片上后，此垫片可将血细胞等有形成分与全血中的液体成分分离，并将血细胞等有形成分滞留于垫片上，而只将全血中的液体成分释放到层析膜起始端，从而可避免血细胞对测试结果的干扰。

附图1中标号2为层析膜起始端，从加样垫片扩散到此的液体样品将沿层析膜向终末端移动，途中会依次经过显色颗粒储存区、检测区以及对照控制带，如果将层析膜的组成材料在电子显微镜下观察，此材料呈现为一种网状纤维结构，这种网状纤维结构具有一定的孔径，常用孔径直径为1至20微米，此孔径远大于显色颗粒的直径，因此显色颗粒可随液体在层析膜网状结构中泳动。

附图1中标号3为显色颗粒储存区，此区内含有混合在一起的多种带有抗体的显色颗粒，每一种显色颗粒与相应的检测带一起，共同用于检测同一种肿瘤标志物，一种显色颗粒表面可带有抗一种肿瘤标志物的一种抗体，也可带有抗同一种肿瘤标志物的多种抗体。抗体与显色颗粒之间的连接，既可利用共价结合，也可利用非特异性吸附，对于胶体金颗粒和表面无活性基团的乳胶颗粒，可利用非特异性吸附使之与抗体结合，制备时可先用硼酸或磷酸等缓冲液将胶体金颗粒或乳胶颗粒稀释，然后将含有这些颗粒的液体与含有抗体的液体按一定比例混合(具体比例需按不同抗体效价的高低进行调整，这种比例的调整，对于本领域普通技术人员来说是一种常规操作，可以很容易地实现。)，因为胶体表面具有疏水特性，而抗体表面同时存在疏水部分和亲水部分，由于疏水作用，抗体蛋白的疏水部分会与显色颗粒表面结合，亲水部分暴露在外，因此显色颗粒表面会吸附一层抗体，对于其表面带有羧基、羰基或氨基等活性基团的乳胶颗粒(可从加拿大温哥华CDI生物试剂公司等厂家购买)，可利用共价结合，制备时将带有活性基团的显色颗粒与抗体混合在一起，对于表面带有羧基或羰基的显色颗粒，其羰基或羧基可与抗体蛋白氨基末端的氨基共价结合，对于表面带有氨基的显色颗粒，其氨基可与抗体蛋白羧基末端共价结合，从而将抗体共价连接在显色颗粒表面，抗体和显色颗粒的具体比例，需按不同抗体具体效价的高低进行调整，这种比例调整是本领域中的常规技术。将抗体结合到显色颗粒上以后，可在含有这些颗粒的液体中加入过量的与检测指标无关的非特异性蛋白(如牛血清白蛋白等)，让这些蛋白占据显色颗粒表面未被抗体饱和的结合位点，从而避免检测时显色颗粒与被测样品之间的非特异性吸附，将抗体连接到显色颗粒上以后，可用微量加样机把含有这种显色颗粒的液体喷涂到显色颗粒储存区处，然后令其干燥，这样显色颗粒便可附着于储存区处。由于显色颗粒表面已被抗体和非特异蛋所包裹，其表面特性已由疏水变为亲水，所以只有在干燥状态下，这些颗粒才可附着于储存区内，一旦与液体相遇，这些颗粒将随液体在层析膜纤维网状结构中移动。

附图1中标号4为检测区，此区内含有多条检测带，每一条检测带用于检测一种肿瘤标志物，一条检测带可由抗一种肿标志物的一种抗体组成，也可由抗同一种肿瘤标志物的多种抗体混合而成，每一条检测带和带有相应抗体的显色颗粒一起，共同对应于一种肿瘤标志物，检测带的数目为二条或二条以上，常用为二至十条，但也可为十条以上。制备时可用连续性微量液体加样机将多种针对不同肿瘤标志物的抗体溶液分别喷涂在层析膜上，使之形成多条抗体带，然后将层析膜干燥，由于层析膜表面的疏水特性及电荷特性，抗体会固定于层析膜上，即使遇到液体，抗体也不会脱落。这些抗体被固定在层析膜网状纤维上，当液体样品在层析膜网状结构中移动时，会与这些抗体相遇，如果样品中含有能与这些抗体特异结合的物质，则此物质将与抗体结合，从而被固定在层析膜相应的检测带上。

附图1中标号5为对照控制带，此带上含有能与显色颗粒表面抗体发生结合的抗抗体，制备时，可用微量液体加样机将抗抗体溶液进行喷涂，然后干燥，使之固定在层析膜上形成对照控制带。

附图1中标号6为层析膜终末端。

附图1中标号7为吸水垫片，此垫片与终末端相连，可吸收终末端处的液体，从而使液体从起始端沿层析膜向终末端移动，此垫片的材料可用吸水性强的滤纸片等。

下面通过二个具体实例进一步说明本发明的实际应用，以下二个实例的目的在于帮助对本发明的技术方案进行理解，本发明不局限于这二个实例。

实例1：乳腺癌和卵巢癌的联合装置。

乳腺癌和卵巢癌都是女性常见的肿瘤，如果能定期对高发年令段的妇女进行普查，将能大大提高对这二种疾病的治疗效果。

许多研究表明，肿瘤标志物糖抗原CA15-3(以下简称CA15-3)可用于乳腺癌的检测，肿瘤标志物糖抗原CA125(以下简称CA125)可用于卵巢癌的检测，本实例是一个同时检测CA15-3和CA125的联合检测装置，它的特点是在该检测装置的检测区内有二条检测带，一条用于检测CA15-3，另一条用于检测CA125，利用此装置，一次检测可同时获得有关乳腺癌和卵巢癌的信息，下面结合附图二对本实例进行具体说明。

1.结构特点：

附图2中标号1为加样垫片，当把被测液体样品加到此处后，液体样品将向层析膜起始端扩散。

附图2中标号2为层析膜起始端，当液体样品人加样垫片扩散到此后，会继续沿层析膜向终末端移动，途中依次经过显色颗粒储存区、CA15-3检测带、CA125检测带以及对照控制带。

附图2中标号3为显色颗粒储存区，此区中含有混合在一起的二种分别带有不同抗体的显色颗粒，一些显色颗粒表面带有抗CA15-3的特异抗体，另一些显色颗粒表面带有抗CA125的特异抗体。

附图2中标号4为CA15-3检测带。此带中含有固定在层析膜上的抗CA15-3抗体，此抗体与显色颗粒表面的抗CA15-3抗体相对应，它们可与肿瘤标志物CA15-3发生特异结合，此带显色时，说明CA15-3阳性。

附图2中标号5为CA125检测带。此带中含有固定在层析膜上的抗CA125抗体，此抗体与显色颗粒表面所带的抗CA125抗体相对应，它们都可与肿瘤标志物CA125结合，此带显色时，说明CA125阳性。

附图2中标号6为对照控制带。此带中含有固定在层析膜上的并且可与显色颗粒表面所带抗体发生特异结合的抗抗体。此带显色时，说明检测结果可靠。

附图2中标号8为吸水垫片。它可吸收到达层析膜终末端的液全，从而确保液体样品从起始端向终末端移动。

2.制备方法：

1)制备层析膜：将硝酸纤维素膜剪裁成5毫米×80毫米，硝酸纤维素膜可从美国加利福尼亚S&S公司购买。

2)制备CA15-3检测带：用50毫摩尔的磷酸缓冲液稀释羊抗人CA15-3抗体(可从加拿大温哥华CDI生物试剂公司购置)，稀释体积比为5∶1，然后用微量液体加样机将此抗体溶液喷涂在层析膜上，使之成为一条抗体带，带宽约为1毫米，此带和层析膜起始端边缘的距离为45毫米。

3)制备CA125检测带：用50毫摩尔磷酸缓冲液将羊抗人CA125抗体(此抗体可从加拿大温哥华CDI公司购买)稀释五倍，然后用微量液体加样机将此抗体喷涂在层析膜上，使之形成一条抗体带，带宽约为1毫米，此带距层析膜起始端边缘50毫米，距CA15-3检测带5毫米。

4)制备对照控制带：用50毫摩尔磷酸缓冲液将羊抗小鼠IgG的抗体(从美国圣路易斯SIGMA公司购买)稀释五倍，然后将此抗体溶液喷涂在层析膜上，形成一条抗体带，带宽约1毫米，此带距起始端边缘60毫米，距CA125检测带10毫米。

5)将各种抗体溶液喷涂到层析膜上以后，在室温下用吹风机把膜吹干，然后将它浸泡于含有1％牛血清白蛋白的50毫摩尔磷酸缓冲液中，在室温下温浴一小时后，用50毫摩尔磷酸缓冲液洗三遍，之后将洗净的层析膜在室温下吹干。

6)制备CA15-3显色颗粒：用50毫摩尔硼酸缓冲液将小鼠抗人CA15-3的单克隆抗体(从加拿大CDI公司购买)稀释五倍，同时用50毫摩尔硼酸缓冲液稀释胶体金浓缩液(从美国SIGMA化学试剂公司购买)，使最终胶体金浓度为0.05％，将上述抗体溶液与稀释的胶体金按1∶9的体积比混合，并在摄氏37度水浴中温浴一小时后，在此液体中加入含有3％牛血清白蛋白的硼酸缓冲液，抗体胶体金温合液与牛血清白蛋白硼酸缓冲液的体积比为5∶1，混合后继续温浴30分钟，然后用每分钟15000转的速度将上述液体离心60分钟，将上清液除去，并用离心法把沉淀的胶体金在50毫摩尔硼酸缓冲液中洗三次，最后用离心法将胶体金液体浓缩十倍，这样便得到了连接有抗CA15-3单克隆抗体的胶体金颗粒，此胶体金颗粒呈红色。

7)制备CA125显色颗粒：将小鼠抗人CA125单克隆抗体(从加拿大温哥华CDI公司购买)连接到胶体金颗粒表面，所用方法、条件和比例与制备CA15-3显色颗粒时相同。

8)将浓缩后的CA15-3显色颗粒和CA125显色颗粒按1∶1体积比混合，然后用加拿大CDI公司生产的胶体稀释保存液稀释五倍，在摄氏4度可长期保存。

9)用液体加样机将上述含有混合颗粒的液体喷涂在层析膜显色颗粒储存区，使之成为一条约5毫米宽的带，此带位于层析膜起始端和CA15-3检测带之间，带的中点距起始端边缘30毫米。距CA15-3检测带15毫米，喷涂步骤完成以后，需真空干燥5小时。

10)制备加样垫片：将约10毫米厚的加样纤维滤纸片(美国新泽西Whatman公司生产)剪裁成5×20毫米的垫片，将此垫片用胶带固定在层析膜起始端上，在加样垫片上方需保留至少3×8毫米的面积不被胶带覆盖，此处用于向加样垫片上加样。

11)制备吸水垫片：将约20毫米厚的吸水滤纸片(美国Whatman公司生产)剪裁成5×25毫米的垫片，将此垫片用胶带固定于层析膜终末端，此垫片与终末端的重叠部分为5×10毫米。

12)将上述所制产品的室温下密封保存，直至使用。

3.检测过程及原理：

检测时，将约200毫升的血清样品(不用稀释)加到加样垫片上，在室温下放置5至10分钟后，通过观察检测带是否显色便可得知检测结果。

如果被测样品中含有CA15-3，不含CA125，当液体样品经过层析膜起始端到达显色颗粒储存区后，由于抗原和抗体之间特异的相互作用，样品中的CA15-3会与显色颗粒表面的抗CA15-3抗体发生特异结合，形成CA15-3-抗CA15-3抗体-显色颗粒复合物，此复合物将随样品液体一起向CA15-3检测带移动，当此复合物到达CA15-3检测带时，将与该检测带上的抗CA15-3抗体结合，从而使CA15-3检测带显色，与此同时，带有抗CA125抗体的显色颗粒以及部分剩余的未与CA15-3结合的并带有抗CA15-3抗体的显色颗粒也将随液体一起流向检测区，但它们不会滞留在检测区中的任何一条检测带上，它们将继续向对照控制带移动，并可与对照控制带上的抗抗体结合，使对照控制带显色。

如果被测样品中含有CA125，不含CA15-3，当液体样品流经显色颗粒储存区后，可形成CA125-抗CA125抗体-显色颗粒复合物，当此复合物到达检测区时，可使CA125检测带显色。

如果被测样品中同时含有CA15-3和CA125，当样品流经显色颗粒储存区后，可同时形成CA15-3-抗CA15-3抗体-显色颗粒以及CA125-抗CA125抗体-显色颗粒二种复合物。当这二种复合物到达检测区后，可分别使CA15-3检测带和CA125检测带都显色。

如果样品中既不含CA15-3，也不含CA125，则检测区内无检测带显色。

在本实例中，通过对CA15-3检测带和CA125检测带的观察，便可得知样品中是含有肿瘤标志物CA15-3和CA125。

实例二：多种常见肿瘤的普查筛选检测装置。

本实例是对与多种肿瘤相关的多种肿瘤标志物同时进行检测的装置。

许多研究表明，肝癌病人血中甲胎蛋白AFP(以上简称AFP)普遍生高；肺癌病人体内神经元烯醇化醇NSE(以下简称NSE)普遍升高；在胃肠道肿瘤病人血中，肿瘤标志物糖抗原CA72-4(以下简称CA72-4)普遍升高；在胰腺癌病人血中，肿瘤标志物糖抗原CA19-9(以下简称CA19-9)普遍升高；在前列腺癌病人血中，前列腺特异抗原PSA(以下简称PSA)普遍升高；癌胚抗原CEA(以下简称CEA)在多种肿瘤病人体内都可升高，虽然它缺乏器官特异性，但它的存在可揭示体内可能存在某种肿瘤，需做进一步检查。

本实例的特点是在其检测区内有六条检测带，它们分别为AFP检测带、NSE检测带、CA72-4检测带、CA19-9检测带、PSA检测带和CEA检测带。用此法可一次同时检测上述六种肿瘤标志物，此法适用于对一定年龄以上的中老年人做定期普查，也可对肿瘤病人的鉴别诊断提供信息。

下面结合附图3对本实例进行具体说明。

1.结构特点：

附图3中标号1为加样垫片。

附图3中标号2为层析膜起始端，当液体样品到达此处后会沿层析膜向终末端扩散，途中首先经过显色颗粒储存区，然后依次经过AFP检测带、NSE检测带、CA72-4检测带、CA19-9检测带、PSA检测带以及CEA检测带，最后通过对照控制带到达终末端。

附图3中标号3为显色颗粒储存区。此区内含有混合在一起的六种分别用于检测不同肿瘤标志物的显色颗粒，它们分别是AFP显色颗粒、NSE显色颗粒、CA72-4显色颗粒、CA19-9显色颗粒、PSA显色颗粒以及CEA显色颗粒，这些颗粒表面分别连接着抗AFP抗体、抗NSE抗体、抗CA72-4抗体、抗CA19-9抗体、抗PSA抗体、抗CEA抗体。当液体样品到达此处后，可带动六种显色颗粒向检测区移动，如果样品中含有上述六种当中的某种肿瘤标志物，此肿瘤标志物将和与之相应的显色颗粒结合，然后向检测区移动，并在到达检测区后可停留在相应的检测带上。

附图3中标号4为AFP检测带，此带含有固定在层析膜上的抗AFP抗体，如果样品中含有AFP，当它通过显色颗粒储存区时，由于抗原和抗体之间的特异相互作用，AFP会与带有抗AFP抗体的显色颗粒结合，形成AFP-抗AFP抗体-显色颗粒复合物，此复合物到达AFP检测带时，可与该带上抗AFP抗体结合，从而使AFP检测带显色。如果样品中不含AFP，则AFP检测带不会显色，所以此带可用于AFP的检测。

附图3中标号5为NSE检测带，此带含有固定在层析膜上的抗NSE抗体，与AFP检测原理相同，当样品中含有NSE时，可形成NSE-抗NSE抗体-显色颗粒复合物，此复合物到达NSE检测带时，可使NSE检测带显色，所以此带可用于NSE的检测。

附图3中标号6为CA72-4S检测带，此带中含有抗CA72-4的抗体，与AFP检测带同理，此带可用于检测样品中CA72-4的存在。

附图3中标号7为CA19-9检测带，此带中含有抗CA19-9抗体，与AFP检测带同理，此带可用于样品中CA19-9的检测。

附图3中标号8为PSA检测带。此带含有抗PSA抗体，与AFP检测带同理，此带可用于检测PSA的存在。

附图3中标号9为CEA检测带，此带含有抗CEA抗体，与AFP检测带同理，此带可用于CEA的检测。

附图3中标号10为对照控制带，此带含有能与显色颗粒表面抗体结合的抗抗体，它可与带有抗体的显色颗粒结合，使对照控制带显色。

附图3中标号11为层析膜终末端。

附图3中标号12为吸水垫片。它吸收水分，确保液体样品从起始端向终末移动。

2.制备方法：

1)制备层析膜：把从美国加利福尼亚S&S公司购买的硝酸纤维素膜剪裁成5毫米×90毫米。

2)制备检测区：在位于层析膜中部检测区的位置，制备六条检测带，从层析膜起始端向终末端方向依次为AFP检测带、NSE检测带、CA72-4检测带、CA19-9检测带、PSA检测带和CEA检测带，每条检测带分别由与之相应的抗体组成，具体制备方法是，用50毫摩尔的磷酸缓冲液分别将兔抗人AFP抗体、兔抗人NSE抗体、兔抗人CA72-4抗体、兔抗人CA19-9抗体、兔抗人PSA抗体和兔抗人CEA抗体稀释五倍，然后用微量液体加样机将此六种抗体分别喷涂在层析膜上，形成六条抗体带，每条抗体带宽约1毫米，相邻二带间距5毫米，具体喷涂位置是，在距层析膜起始端边缘40毫米处喷涂抗AFP抗体，在距起始端边缘45毫米处喷涂抗NSE抗，在距起始端边缘50毫米处喷涂抗CA72-4抗体，在距起始端边缘55毫米处喷涂抗CA19-9抗体，在距起始端边缘60毫米处喷涂抗PSA抗体，在距起始端边缘65毫米处喷涂抗CEA抗体，以上抗体可从加拿大温哥华CDI生物试剂公司购买。

3)制备对照控制带：用50毫摩尔磷酸缓冲液将羊抗小鼠IgG的抗体(从美国圣路易斯SIGMA公司购买)稀释五倍，然后将此抗体溶液喷涂在层析膜上，形成一条抗体带，带宽约1毫米，此带距起始端边缘75毫米，距CEA检测带10毫米。

4)将上述各种抗体溶液喷涂到层析膜上以后，在室温下用吹风机把膜吹干，然后将膜浸泡于含有1％牛血清白蛋白的50毫摩尔磷缓冲液中，在室温下温浴一小时后，用50毫摩尔磷酸缓冲液洗三遍，之后将洗净的层析膜在室温下吹干。

5)制备带有抗体的显色颗粒：分别制备AFP显色颗粒、NSE显色颗粒、CA72-4显色颗粒、CA19-9显色颗粒、PSA显色颗粒和CEA显色颗粒。具体方法是：用50毫摩尔硼酸缓冲液将从美国SIGMA公司购买的胶体金稀释到0.05％，需同时准备六份稀释的胶体金样品，然后用50毫摩尔硼酸缓冲液分别把从加拿大温哥华CDI公司购买的小鼠抗人AFP单克隆抗体、小鼠抗人NSE单克隆抗体、小鼠抗人CA72-4单克隆抗体、小鼠抗人CA19-9单克隆抗体、小鼠抗人PSA单克降抗体和小鼠抗人CEA单克隆抗体稀释五倍，然后将这些抗体溶液分别与一份胶体金样品混合，抗体溶液与胶体金液体之比为1∶9，混合后在摄氏三十七度水浴中温浴一小时，然后加入牛血清白蛋白(从美国圣路易斯SIGNA公司购买)，牛血清白蛋白的最终浓度为0.5％，继续温浴30分钟后，用离心法将上述六种分别带有不同抗体的胶体金颗粒在50毫摩尔硼酸缓冲液中洗三遍，然后浓缩十倍，这样便可得到六种分别带有抗AFP抗体、抗NSE抗体、抗CA72-4抗体、抗CA19-9抗体、抗PSA抗体、抗CEA抗体的胶体金颗粒。

6)将上述六种胶体金液体按等体积比混合在一起之后，用加拿大CDI公司生产的胶体金稀释保存液稀释二倍，在摄氏四度下保存。

7)用液体加样机把上述六种胶体金的混合液喷涂在位于层析膜起始端和AFP检测带之间的层析膜上，使之成为一条5毫米宽的带，带的中心距层析膜起始端边缘25毫米，距AFP检测带15毫米，喷涂完毕后，真空干燥5小时从而使混合的显色颗粒附着在层析膜上的显色颗粒储存区。

8)制备加样垫片：将约10毫米厚的加样纤维滤纸片(美国新泽西Whatman公司生产)剪裁成5×20毫米的垫片，将此垫片用胶带固定在层析膜起始端上，在加样垫片上方需保留至少3×8毫米的面积不被胶带覆盖，此处用于向加样垫片上加样。

9)制备吸水垫片：将约20毫米厚的吸水滤纸片(美国Whatman公司生产)剪裁成5×25毫米的垫片，将此垫片用胶带固定于层析膜终末端，此垫片与终末端的重叠部分为5×5毫米。

10)将上述所制产品在室温下密封保存，直至使用。

3.检测过程及原理：

检测时，将约200微升的血清样品(不用稀释)加到加样垫片上，在室温下放置5至10分钟后，通过观测各条测检测带是否显色来判别检测结果，如果某条检测带显色，则说明与之相应的肿瘤标志物阳性。

当把被测血清样品加到加样垫片上后，血清会沿层析膜从起始端向终末端扩散，在流经显色颗粒储存区时会带动显色颗粒一起向终末端方向移动，途中依次经过检测区中的六条检测带和对照控制带。

如果被测血清中含有上述六种当中的某种肿瘤标志物，当它随血清流经显色颗粒储存区时，会结合到带有相应抗体的胶体金颗粒表面，当这种带有肿瘤标志物的胶体金颗粒流经检测区时，会结合到相应的检测带上并使该检测带显色。

如果被测血清中不含上述六种肿瘤标志物，所有胶体金颗粒将通过检测区，不会滞留于任何一条检测带上，因此全部检测带都不会显色。

在本实例中，通过观察六条检测带的颜色变化，可同时获得六种肿瘤指标的信息。

Claims (12)

1、同时检测多项肿瘤标志物的多带薄层分析法，此分析方法的实现需在所用层析膜上划分出加样区、显色颗粒储存区、检测区、对照控制区和吸水区，显色颗粒储存区的显色颗粒可与相应的肿瘤标志物结合，检测区内的检测带也可与相应肿瘤标志物结合，检测时将液体样品加到加样区，由于毛细作用，液体样品将自动沿层析膜向末端移动，途中依次经过显色颗储区、检测区、及对照控制区，被测样品中含有的肿瘤标志物在样品经过显色颗粒储存区时与带直相应抗体的显色颗粒结合，形成抗原抗体显色颗粒复合物，该复合物移动经过检测区时，与检测区内相应检测带上的抗体结合，使该检测带显色，根据检测带的显色情况判断样品中肿瘤标志物的存在，本分析方法的特征是在所用检测区内含有多条检测带，每一条检测带分别对应于一项被测肿瘤标志物，于此同时所用显色颗粒由多种分别对应于不同肿瘤标志物的显色颗粒混合而成，每一种显色颗粒分别对应于一条检测带，从而使得多条检测带可同时检测多项肿瘤标志物指标。

2、根据权利要求1的分析方法，其特征在于检测区内的检测带数目为2条或2条以上，每一条检测带上分别固定有对应于一项被测肿瘤标志物的抗体。

3、根据权利要求2的分析方法，其特征在于每一条检测带上即可由抗一种肿瘤标志物的一种抗体组成，也可由抗同一种肿瘤标志物的多种抗体混合而成。

4、根据权利要求1的分析方法，其特征是在显色颗粒储存区内含有多种分别对应于不同肿瘤标志物的显色颗粒，每一种显色颗粒分别对应于一种肿瘤标志物。

5、根据权利要求4的分析方法，其特征在于每一种显色颗粒表面即可带有抗一种肿瘤标志物的一种抗体，也可带有抗同一种肿瘤标志物的多种抗体。

6、根据权利要求1的分析方法，其特征在于所说的抗原抗体之间的相互作用可被下述相互作用所替代：受体和配体之间的相互作用、抗体和蛋白A或蛋白G之间的相互作用、生物素及其配体之间的相互作用。

7、一种可同时检测多项肿瘤标志物的多带薄层检测装置，该装置主要包括加样垫片、层析膜起始端、显色颗粒储存区、检测区、对照控制区、层析膜终末端和吸水垫片，其特征是在该装置的检测区内制备多条分别用于检测不同肿瘤标志物的检测带。

8、根据权利要求7的检测装置，其特征在于检测带的数目为2条或2条以上，每条检测带分别对应于一种肿瘤标志物。

9、根据权利要求7或8的检测装置，其特征在于所说的每一条检测带上即可固定有抗一种肿瘤标志物的一种抗体，也可固定有抗同一种肿瘤标志物的多种抗体。

10、根据权利要求7的检测装置，其特征在于显色颗粒储存区中含有多种分别对应于不同肿瘤标志物的显色颗粒。

11、根据权利要求7或10的检测装置，其特征是每一种显色颗粒上即可连接有抗一种肿瘤标志物的一种抗体，也可连接有抗同一种肿瘤标志物的多种抗体。

12、根据权利要求7的检测装置，其特征在于所说的抗原抗体之间的相互作用可被下述相互作用所替代：受体和配体之间的相互作用、抗体和蛋白A或蛋白G之间的相互作用、生物素及其配体之间的相互作用。

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