CN119709552B - 一种具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种c-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种C‑2及其应用，所述动物双歧杆菌乳亚种C‑2的分类命名为Bifidobacterium animalis subsp.lactis，保藏编号为GDMCC No:65455。该菌株能够通过调节肠道微生态、修复肠道机械屏障、改善肠道免疫反应、抑制氧化应激反应等作用机制，抑制有害菌的定植并促进有益菌的定植，优化肠道微生物的组成，从而诱导抗炎反应并改善肠道屏障功能。因此，此动物双歧杆菌乳亚种C‑2菌株适用于制备具有预防、改善或治疗炎症性肠病功效的药物。

Description

一种具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种C-2及 其应用

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种C-2及其应用。

背景技术

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。它们的临床表现通常包括腹痛、腹泻和血便，严重时可导致消化道穿孔、出血等并发症。IBD的发病机制尚未完全明确，但现有研究揭示了多个因素可能在其发生和进展中起重要作用。现代的三代测序技术揭示了IBD患者肠道菌群的多样性和丰富度较低，且有益菌的数量减少，致病菌的数量增加。这些微生物失衡引发了脂多糖的过度生产，进而激活肠道的炎症信号通路，促进炎症反应的发展。肠道屏障功能的破坏也是IBD发病中的重要环节。正常情况下，肠道屏障能够有效隔离肠道内的有害物质和病原微生物，但IBD患者常出现肠道屏障功能的破坏，导致肠道的免疫反应过度。肠道菌群的代谢产物，如短链脂肪酸，能维持肠道屏障的完整性，并支持免疫系统的平衡。IBD患者中这些有益代谢物的减少，使得肠道上皮细胞的营养供应不足，免疫功能异常，进一步加剧了肠道炎症。

当前的IBD治疗主要依赖药物治疗，主要包括氨基水杨酸盐类药物、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂等。氨基水杨酸盐类药物（如美沙拉嗪）对控制轻度至中度的活动性疾病有效，但效果一般，仅能缓解相关症状；皮质类固醇类药物可用于控制急性发作，但长期使用可能会导致骨质疏松、糖尿病等副作用；免疫抑制剂（如硫唑嘌呤、环磷酰胺）长期使用也会增加感染风险；生物制剂，尤其是肿瘤坏死因子（TNF）特异性抑制剂（如英夫利昔单抗、阿达木单抗），已成为治疗IBD的重要手段，但部分患者对生物制剂产生耐药或不响应。因此，探索新的治疗策略成为一种迫切的需求。

益生菌被定义为“活的微生物”，当摄入足够的量时，会对宿主产生健康影响。而肠道作为营养物质消化吸收的最主要的器官，其健康水平决定着机体的整体健康。益生菌能够通过改善肠道屏障功能、调节肠道菌群的结构及抑制有害菌的生长等途径，发挥在溃疡性结肠炎防治中的潜在作用。因此，如何提供一种高效的含益生菌的微生物制剂，可用于改善炎症性肠病、促进肠道健康已成为亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种C-2及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种C-2，所述动物双歧杆菌乳亚种C-2的分类命名为Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏编号为GDMCC No: 65455，保藏日期为2024年11月8日。

本发明从乳基中分离获得并保藏了一株新的具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株，该菌株能够调节肠道环境，抑制有害菌的定植并促进有益菌的定植，优化肠道微生物的组成，从而诱导抗炎反应并改善肠道屏障功能。因此，此动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株能用于制备具有预防、改善或治疗炎症性肠病功效的药物。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种C-2的培养物，所述培养物采用如下方法制备：将动物双歧杆菌乳亚种C-2接种于培养基中在35-38℃下培养22-26 h。

其中，上述“35-38℃”例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

上述“22-26 h”例如可以是22 h、22.5 h、23 h、23.5 h、24 h、24.5 h、25 h、25.5h、26 h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第三方面，本发明提供一种具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂，所述具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株。

优选地，在所述益生菌剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种C-2的活菌数不低于1×10⁹CFU/mL或1×10⁹ CFU/g，例如1×10⁹ CFU/mL（CFU/g）、2×10⁹ CFU/mL（CFU/g）、5×10⁹ CFU/mL（CFU/g）、8×10⁹ CFU/mL（CFU/g）、1×10¹⁰ CFU/mL（CFU/g）、5×10¹⁰ CFU/mL（CFU/g）、1×10¹¹ CFU/mL（CFU/g）等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂中的菌株还包括格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri CKCC 1913，保藏编号为CGMCC No. 23175，保藏日期为2021年08月23日。

本发明还创造性地发现上述格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri CKCC 1913菌株能够与动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis C-2菌株进行复配用于预防、改善或治疗炎症性肠病，具有比单一菌剂或者其他复配方式更优异的效果，说明CKCC 1913菌与C-2菌在调节肠道菌群平衡，诱导抗炎反应以改善肠道屏障功能等方面具有协同增效作用。

优选地，所述动物双歧杆菌乳亚种C-2和格氏乳杆菌CKCC 1913的活菌数之比为1:10-10:1，例如可以是1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、5:1、6:1、8:1、10:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

优选地，所述益生菌剂还包括保护剂。

优选地，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种C-2或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备调节肠道微生态环境的产品中的应用。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种C-2或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备具有预防、改善或治疗炎症性肠病功效的制剂中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明从乳基中分离获得并保藏了一株新的具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株，该菌株能够调节肠道环境，抑制有害菌的定植并促进有益菌的定植，优化肠道微生物的组成，从而诱导抗炎反应并改善肠道屏障功能。因此，此动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株能用于制备具有预防、改善或治疗炎症性肠病功效的药物。

本发明所涉及的C-2菌株的分类命名为Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 65455，保藏日期为2024年11月8日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；

本发明所涉及的CKCC 1913菌株的分类命名为格式乳杆菌Lactobacillus gasseri，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 23175，保藏日期为2021年08月23日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1是各组小鼠试验的体重变化率统计结果图；

图2是各组小鼠结肠样本中各细胞因子含量水平统计结果图；

图3是各组小鼠血清样本中各细胞因子含量水平统计结果图；

图4是各组小鼠结肠样本中各关键粘性蛋白含量水平统计结果图；

图5是各组小鼠血清样本中各免疫球蛋白浓度水平统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述涉及的菌种信息为：

① 下述实施例涉及的C-2菌株的分类命名为Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏编号为GDMCC No: 65455；

② 下述实施例涉及的CKCC 1913菌株的分类命名为格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri，保藏编号为CGMCC No. 23175；

③ 下述实施例涉及的ATCC 700541为动物双歧杆菌乳亚种 ATCC 700541菌种。

下述涉及的培养基及其配方为：

① MRS液体培养基：牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，氯化钠5.0 g，柠檬酸氢二胺2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，吐温-80 1.0 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 6.2～6.4。

MRS固体培养基：牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，氯化钠5.0 g，柠檬酸氢二胺2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，吐温-801.0 g，2 %琼脂粉，蒸馏水定容至1000 mL，pH 6.2～6.4。

② TPY液体培养基：称取26.4 g市售TPY培养基粉末，蒸馏水定容至1000 mL，

TPY固体培养基：称取26.4 g市售TPY培养基粉末，蒸馏水定容至1000 mL，2 %琼脂粉。

下述实施例涉及的模拟胃液（pH3.0）：配制0.85%生理盐水，用稀盐酸调节pH至3.0，然后加入0.3%胃蛋白酶，充分溶解后用微孔滤膜过滤除菌，即得。

下述涉及的菌悬液及菌粉制备方法为：将菌株活化后，分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，菌体重悬得到菌悬液，或者进一步地加入保护剂进行冷冻干燥，制得冻干菌粉产品。

实施例1

本实施例分离筛选得到一株具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌乳亚种，步骤如下：

（1）选取分离自乳基的样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48 h后，挑取出不同形态的菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为35%的甘油进行保藏。

实施例2

本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：

（1）形态鉴定：

将该菌株接种于TPY培养基中，于37℃厌氧培养48 h后，在显微镜下进行观察。经涂片和革兰染色后镜检观察到：革兰氏染色为阳性，菌株形态为多形态、乳白色、直径0.1-0.2 cm，表面光滑、湿润、隆起，边缘齐整的菌落。

（2）16S rRNA分子生物学鉴定：

将-80℃保藏的菌株取出，按2%（v/v）比例接种于装有20 mL TPY液体培养基的离心管中，在37℃下培养24 h后进行离心分离，8000 rpm下离心10 min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交测序公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌乳亚种。

SEQ ID No:1：

CCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTT。

基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于动物双歧杆菌乳亚种，命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis C-2菌株。

测试例1

本测试例探究C-2菌株对于肠炎小鼠各症状指标的影响，具体步骤如下：

（1）试验动物：6周龄SPF级雄性Balb/C小鼠，饲养环境：温度25℃，湿度：50%，照明12 h。用基础鼠粮适应性饲养一周（自由进食和饮水）。

（2）分组：适应性试验后，随机分为9组：S1组（C-2菌悬液）、S2组（CKCC 1913菌悬液）、S3组（C-2菌悬液+CKCC 1913菌悬液，活菌数比例10:1）、S4组（C-2菌悬液+CKCC 1913菌悬液，活菌数比例1:1）、S5组（C-2菌悬液+CKCC 1913菌悬液，活菌数比例1:10）、S6组（ATCC700541菌悬液+CKCC 1913菌悬液，活菌数比例10:1）、S7组为阳性对照组（0.01 g/ml 5-ASA溶液），S8组为模型组，S9组为空白组，每组12只鼠，S1-S6组各组的总活菌均为1×10⁹ CFU/mL。

（3）干预方式：

试验期间各组小鼠均自由饮食饮水。

第0-14天，S1-S6组分别灌胃200 μL对应菌悬液，S7组灌胃200 μL 5-ASA溶液，S8-S9组分别灌胃等体积的生理盐水，每日灌胃一次，每次200 μL；

第8-14天，将S1-S8组小鼠的饮用水均换为2.5%的DSS水溶液；

第15天对小鼠进行处死，眼球取血，血液样本静置30 min后离心收集血清样本，同时收集结肠组织和肠道内容物样本进行相关指标的检测分析。

（a）体重变化情况

在试验第14天的时候分别对各组小鼠进行称重，小鼠体重变化率通过如下公式进行计算，计算结果取平均值，如图1所示。

体重变化率=[(第N天小鼠体重-第0天小鼠体重)/第0天小鼠体重]×100%

通过图中统计结果可知，C-2和CKCC 1913菌株均可以延缓和减弱肠炎小鼠的体重下降现象，且C-2菌悬液的效果最好，另外，意外发现C-2和CKCC 1913菌株两菌联合使用时，延缓和减弱肠炎小鼠体重下降的作用更优。

（b）疾病活动指数（DAI）变化情况

观察各组小鼠排便情况，按照表1中的评分标准对各组小鼠进行DAI评分，评分结果如表2所示。

表1

表2

通过表中数据可知，与S9对照组小鼠相比，S8模型组小鼠的DAI评分显著升高，C-2和CKCC 1913菌株对于结肠炎导致的体重下降、腹泻、便血等症状均具有缓解作用，且C-2菌悬液的效果最好，另外，意外发现C-2和CKCC 1913菌株两菌联合使用时，相关效果更优。

（c）抑制炎症反应效果

收集各组小鼠的结肠匀浆离心，收集上清，收集小鼠血清，对结肠匀浆液和血清样本按照ELISA试剂盒说明书步骤进行检测，分别检测所收集细胞上清液和血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）及白细胞介素-10（IL-10）的含量，通过数据处理软件分析实验结果，结肠样本中各细胞因子的含量水平统计结果如图2所示，血清样本中各细胞因子的含量水平统计结果如图3所示。

由图中结果可知，与S9对照组小鼠相比，S8模型组小鼠的结肠组织和血清中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著升高，促炎细胞因子IL-6表达水平也有升高，抑炎因子IL-10的mRNA表达水平降低。C-2和CKCC 1913菌株均具有抗炎作用，且C-2菌悬液的效果最好，另外，意外发现C-2和CKCC 1913菌株两菌联合使用时，相关效果更优。

（d）结肠关键粘性蛋白变化情况

采用qRT-PCR检测法对小鼠结肠匀浆上清液进行免疫组化分析，检测Claudin、Occludin、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、黏蛋白-2（MUC2）四种蛋白的mRNA表达变化情况，结果如图4所示。

由图中结果可知，与S9对照组小鼠相比，S8模型组小鼠的结肠组织中的Claudin、Occludin、ZO-1、MUC2四种关键粘性蛋白的mRNA表达水平均显著降低。C-2和CKCC 1913菌株均可以促进相关结肠关键粘性蛋白的表达，且C-2菌悬液的效果最好，另外，意外发现C-2和CKCC 1913菌株两菌联合使用时，相关效果更优。

（e）血清免疫球蛋白表达水平变化情况

采用ELISA试剂盒对各组小鼠血清中的免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）三种免疫球蛋白水平进行检测，检测结果如图5所示。

由图中结果可知，与S9对照组小鼠相比，S8模型组小鼠血清中的Ig A、Ig G、Ig M三种免疫球蛋白的表达水平均显著降低。C-2和CKCC 1913菌株均可以促进相关免疫球蛋白的表达，且C-2菌悬液的效果最好，另外，意外发现C-2和CKCC 1913菌株两菌联合使用时，相关效果更优。

综上所述，本发明分离获得并保藏了一株新的具有改善炎症性肠病功效的动物双歧杆菌，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株，该菌株能够调节肠道环境，抑制有害菌的定植并促进有益菌的定植，优化肠道微生物的组成，从而诱导抗炎反应并改善肠道屏障功能。因此，此动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株能用于制备具有预防、改善或治疗炎症性肠病功效的药物。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (6)

1.一种具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株由活菌数之比为1:10-10:1的动物双歧杆菌乳亚种C-2菌株和格氏乳杆菌CKCC 1913组成；

所述动物双歧杆菌乳亚种C-2的分类命名为Bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏编号为GDMCC No: 65455，保藏日期为2024年11月8日；

所述格氏乳杆菌CKCC 1913的分类命名为格式乳杆菌Lactobacillus gasseri，保藏编号为CGMCC No. 23175，保藏日期为2021年08月23日。

2. 如权利要求1所述的具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种C-2的活菌数不低于1×10⁹ CFU/mL或1×10⁹ CFU/g。

3.如权利要求1所述的具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

4.如权利要求1所述的具有改善炎症性肠病功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂；

所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的益生菌剂在制备调节肠道微生态环境的产品中的应用。

6.一种如权利要求1-4任一项所述的益生菌剂在制备具有预防、改善或治疗炎症性肠病功效的制剂中的应用。