CN1196754A - 寡糖氨基糖醇及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测感兴趣化合物(如酶)的存在,或在感兴趣化合物样品中空间分布的方法。步骤是用可与感兴趣化合物反应或相互作用的标记物浸透或涂覆合适的基底材料,标记物用可被检测的方式如荧光、放射性或上色来作标记,它对基底材料和与感兴趣化合物反应或相互作用产生的产物有不同的亲和性。方法还包括步骤,使浸透的基底材料与测试样品接触,使标记过的标记物与任何样品中的靶化合物反应或相互作用,用合适的溶剂除去不反应的标记过的标记物或标记过的反应产物,检测留在所述基底材料上的标记过的标记物或检测从所述基底材料上释出的标记过的反应产物,以指示感兴趣化合物的存在或不存在。标记物可以是寡糖,最好是寡糖基-1-氨基-1-氨基-糖醇(OAD)。本发明也公开了制备OAD的方法。
Description
本发明涉及对化合物如酶,例如催化糖苷键水解的糖基水解酶、催化转糖苷作用的转糖基酶和催化糖苷键的断裂除去的裂合酶的活性进行定位和测定的方法。
活的有机体中有各种糖基水解酶和转糖基酶,它们通过与糖类底物(包括木聚糖(xyloglucan)、其它半纤维素、纤维素、淀粉、糖原、壳多糖和果胶聚糖)的作用在有机体的生命中起各种不同的作用。检测和测定这些酶的实验方法通常是的将合适底物的水性溶液放在容器内(如试管),用如比色法、放射化学法、色谱法或粘度法来检测它们的酶催化变化。
然而,这些方法是耗时的,且不宜筛选大量的酶样品。而且,这些方法并未提供酶在试样如凝胶电泳图试样或部分有机体中的分布或定位的空间信息。
本发明一方面提供可检测感兴趣化合物的存在,或感兴趣化合物样品的空间分布的方法,方法包括步骤:将可与感兴趣化合物反应或相互作用的标记物浸透或涂覆合适的基底材料,标记物以可被检测的方式如荧光、放射性或上色来作标记,它对基底材料的亲和力和它与感兴趣化合物反应或相互作用的产生产物的亲和力有相当不同,方法还包下列括步骤,使浸透过的基底材料与测试的样品接触,使标记过的标记物得以与存在于样品中的任何靶化合物反应或相互作用,用合适的溶剂除去未反应的标记过的标记物或标记过的反应产物,检测留在所述基底材料上的标记过的标记物或检测从所述基底材料上释出的标记过的反应产物,以指示感兴趣化合物的存在或不存在。
本发明利用了某些糖类而不是其它糖类在选出的溶剂中有与基底材料结合的能力。
较佳的,感兴趣化合物是酶,而标记物是酶的底物。所述酶的底物可以是蛋白质、肽、多糖或寡糖。在一个特别佳的方法中,底物是寡糖基-1-氨基-1-脱氧-糖醇。这些化合物由申请人开发,并认为它们是新的。在本说明书中它们被称作“OAD”类,该术语包括正-糖基-1-氨基-1-脱氧-糖醇、正-寡糖基-1-氨基-1-脱氧-糖醇、正-糖基-6-氨基-6-脱氧-醛糖酸、正-寡糖基-6-氨基-6-脱氧醛糖酸和/或它们的内酯,以及还原性氨基化反应的相关产物。
在一些情况下,还原糖不仅有一个还原性位点,而且有两个或多个还原性位点随机地处于其中,这是有利的。这些额外的还原性位点可通过氧化剂如高碘酸钠获得。
本发明也提供了制备OAD的方法,是还原糖与铵盐和还原剂反应。较佳的,铵盐为碳酸氢铵,还原剂为氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)。本发明更好的特征在附加权利要求中叙述。
如上所述,本发明的方法可用于检测酶活和/或检测样品中酶的空间分布。特别是(但不是唯一的),本发明的方法可用于下列酶:转糖基酶如葡聚糖蔗糖酶、淀粉蔗糖酶、菊糖蔗糖酶(inulosucrase)、糖原磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、木聚糖合成酶、葡聚糖合成酶、果胶合成酶、糖原合成酶、淀粉合成酶、愈伤葡聚糖合成酶、壳多糖合成酶;糖基水解酶(内作用(endoacting)),如木聚糖酶、内切葡聚糖酶、壳多糖酶、甘露聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶;裂合酶如果胶/果胶酸盐裂合酶、藻酸盐裂合酶;糖基水解酶(外作用(exoacting))如α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、外-聚半乳糖醛酸酶、N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶、α-D-木糖苷酶。
现在通过实施例来描述本发明的一个具体例子。在该实施例中待测定的酶是木聚糖内切转糖基酶(XET)(参考文献1)。
1.标记过的寡糖的制备
将还原寡糖4-正-[4-正-[4-正-[6-正-α-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖基]-6-正-(2-正-β-D-吡喃半乳糖基)-α-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖基]-6-正-(2-正-β-D-吡喃半乳糖基)-α-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖基]-D-葡萄糖(“XLLG”,用参考文献2中的缩写命名法)(1克)溶解在25ml含有1克氰基硼氢化钠(NaCNBH3)的碳酸氢铵饱和水溶液中,并在暗处25℃下培育7天,以进行还原胺化作用。然后干燥除去碳酸氢铵,用例如凝胶-渗透色谱法或阳离子交换层析来纯化XLLG胺化(与茚三酮有反应活性)的衍生物。认为产物是寡糖基-1-氨基-1-脱氧糖醇,即XLLG的衍生物,其中还原性末端D-葡萄糖被1-氨基-1-脱氧-D-葡萄糖醇代替。
将寡糖基-1-氨基-1-脱氧糖醇(50mg)溶解在3ml 3%的四硼酸钠(四硼酸二钠;pH=9.0-9.5)溶液中,在搅拌下逐渐加入含10mg新鲜制备的丽丝胺若丹明磺酰氯(lissamine rhodamine sulphonyl chioride)(从Molecular Probes Inc.,USA购得)的0.75ml干的二甲基甲酰胺(DMF)溶液,使混合物在暗处培育过夜。再加入另外0.75ml含10mg丽丝胺若丹明磺酰氯的DMF,并使混合物再培育8小时。用凝胶渗透色谱法,然后再在C18-硅石凝胶柱中反相层析来纯化所得亮粉红色的寡糖基-1-氨基-1-脱氧糖醇基-丽丝胺-若丹明共轭物(称作XLLGol-SR)。在水洗后一根柱后,加入甲醇组分并在约50%甲醇下洗出XLLGol-SR。
2.木聚糖浸透过的纸的制备
用1%木聚糖的水性溶液润湿Whatman No.1号滤纸并干燥。将XLLGol-SR制品稀释在足量的75%水性丙酮中使在580nm波长处的吸光度(A580)为0.2;然后将木聚糖涂覆的Whatman No.1号滤纸浸在溶液中并重新干燥;生成物成为“XET纸”。用非水性粘合剂将合适大小的(如72×108mm)的XET纸粘在不吸收光的介质如透明醋酸酯薄片上。
3.进行测定
(a)用斑点印迹法测定水性溶液中的XET活性
(i)将待测定XET活性的原料(如生长植物的茎)在合适的缓冲液(如含有10mM氯化钙和10mM二硫苏糖醇,pH5.5的250mM琥珀酸盐)中均一化,对均浆物离心获得澄清的上清液。其它可测定XET活性的样品包括从层析柱上洗脱下的各部分、植物细胞悬浮培养物的用过的培养基或用对XET活性的影响有待研究的物质处理过的XET样品。
(ii)将每种酶溶液用移液管点涂在XET纸的作过标记的位置上。如果点样量为4μl,则样品间距可方便地为9mm(即中心间距,如标准的96穴测试平板的格式)。
(iii)将XET纸迅速(在点样干之前)夹在两层塑料间(如投影仪上所用的醋酸酯薄片)并在如20℃下培育1小时。
(iv)将培育后的XET纸及其塑料衬底纸面朝下地置于含约150ml溶剂(如新鲜制备的乙醇/甲酸/水,体积比为1∶1∶1)的碟中,溶剂会将未反应的XLLGol-SR从纸上除去,而不除去由于XET催化的经转糖苷化反应已与木聚糖结合的XLLGol-SR。这时纸很容易从塑料衬底上脱下。
(v)然后使纸在流水下冲洗5分钟,再用约100ml丙酮冲洗5分钟,然后完全干燥。如果需要,干燥可在80℃的烘箱内处理5分钟来加速。
(vi)然后在短波紫外灯下检查纸(如发射波长为254nm;需穿戴上合适的眼睛和皮肤保护设施)。粉红色斑点表示活泼的XET,它可用扫描分光荧光仪来定量。该测定方法可用来测试促进或抑制XET活性的物质存在。
(b)活性印染对植物组织或酶谱中的XET活性定位
将XET-纸用缓冲液处理,如喷洒含10mM氯化钙和10mM二硫苏糖醇,pH5.5的500mM琥珀酸盐。将植物组织切开,形成外露的表面;为对叶子表面的XET活性作区域图,最好将叶子压在试纸和一粗糙表面(如砂纸)间或将试纸上的叶子压在非常冷(如-80℃)而重的金属平面下来促进组织的破裂(然后升至室温)。然后将外露的组织表面、或凝胶电泳图谱或其它可在其上作XET活性区域图的表面在湿纸上压1分钟,使酶转移至纸上。然后将酶原料从XET纸上除去,并进行上述步骤(iii)至(vi)。
上述实施例描述了本发明用于转糖基酶XET时的情况。该方法也适用于测定糖基水解酶。例如被XLLGol-SR(没有木聚糖)浸透的Whatman No.1号纸可用于斑点印迹法测定糖基水解酶(α-木聚糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶)一起催化XLLGol外水解活性。测定用上述3(a)相同的方法进行,除了:在步骤(iv)中选用一种溶剂(如90%乙醇)将低于一定大小的XLLGol-SR水解产物而不是XLLGol-SR本身从纸上去掉;步骤(v)不用其它溶剂,而只是干燥。相应的糖基水解酶的活性在荧光纸背景上产生了非荧光的各点。
上述制备XLLGol-SR的方法很容易现成的作为有普遍价值的方法用于制备荧光标记的还原性寡糖或多糖。这些标记过的糖(如寡糖)可用于:
-对内切-和外切-糖基水解酶和转糖基酶(包括那些与淀粉新陈代谢有关的酶)的各种酶测定;
-用HPLC或TLC与纯的糖基水解酶结合使用,以检测、分离和表征感兴趣的寡糖,寡糖作为可靠标记物;
-作为植物组织适用的探针,在加入或不加入未标记木聚糖的情况下,用荧光显微术来绘制组织化学中的XET活性区域分布。
正-糖基-1-氨基-1-脱氧-糖醇和/或正-寡糖基-1-氨基-1-脱氧糖醇用所述方法(还原性胺化)可从任何还原性寡糖出发来制得。从寡糖可获得类似的产物,其中还原性末端是修饰过的糖;例如,当寡糖的还原性末端是己糖醛酸时,反应产物是正寡糖基-6-氨基-6-脱氧醛酸或其内酯。任何这些还原性胺化反应的产物可通过它们的氨基基团被检测出(如用茚三酮着色),它们可用于各种目的,包括
-寡糖的色谱和电泳测定;
-用作酶反应的调节剂。
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Claims (20)
1.一种检测感兴趣化合物的存在、或感兴趣化合物样品中的空间分布的方法,方法包括步骤:用可与感兴趣化合物反应或相互作用的标记物浸透或涂覆合适的基底材料,标记物用可被检测的方式如荧光、放射性或上色来作标记,并对基底材料及与感兴趣化合物反应或相互作用产生的产物有不同的亲和性,方法还包括步骤,使浸透过的基底材料与测试的样品接触,使标记过的标记物与任何存在于样品中的靶化合物反应或相互作用,用合适的溶剂除去不反应的标记过的标记物或标记过的反应产物,检测留在所述基底材料上的标记过的标记物或检测从所述基底材料上释出的标记过的反应产物,以指示感兴趣化合物的存在或不存在。
2.根据权利要求1所述的方法,其中感兴趣的化合物是酶,标记物是酶的底物。
3.根据权利要求2所述的方法,其中酶是糖基水解酶、转糖基酶或裂合酶。
4.根据权利要求3所述的方法,其中的酶与木聚糖、其它半纤维素、淀粉、糖原、壳多糖或果胶聚糖反应。
5.根据权利要求1至4的任一条所述的方法,其中标记物是如所确定的寡糖基-1-氨基-1-脱氧-糖醇OAD。
6.根据前述任一条权利要求所述的方法,其中标记物用丽丝胺若丹明磺酰氯作标记。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法,适用于(a)水溶液斑点印迹测定(i)α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性或(ii)提高或降低α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性的物质的存在,或(b)进行组织染色以研究植物组织中α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性的分布,或(c)进行凝胶电泳图谱印迹以研究α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性在酶谱上的分布,其中底物是从木聚糖衍生获得的寡糖如XLLG。
8.根据权利要求2或其任一附属权利要求所述的方法,其中基底材料还用未标记过的所述酶的共同底物来浸透。
9.根据权利要求8所述的方法,适用于(a)进行水性溶液斑点印迹法测定(i)木聚糖内切转糖基酶XET的活性,或(ii)是否存在促进或抑制XET活性的物质,或(b)进行组织染色以研究植物组织中XET活性的分布,或(c)进行凝胶电泳图谱印迹法以研究XET活性在酶谱上的分布,其中底物是从木聚糖衍生获得的寡糖如XLLG,基底材料还用未标记过的木聚糖浸透。
10.一种如所定义的寡糖基-1-氨基-1-脱氧-糖醇OAD。
11.一种生产权利要求10所述的OAD的方法,包括还原糖与铵盐和还原剂的反应。
12.根据权利要求11所述的方法,其中铵盐是碳酸氢铵。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中还原剂是氰基硼氢化钠。
14.一种标记权利要求10所述的OAD的方法,包括使OAD与丽丝胺若丹明磺酰氯反应。
15.根据权利要求1至9的任一条所述的方法,其中基底材料是滤纸、硝基纤维素片,或电泳凝胶,如聚丙烯酰胺、琼脂糖或淀粉。
16.根据权利要求15所述的方法,如依附于权利要求1至9的任一条,其中基底物质是合适的凝胶如聚丙烯酰胺,方法包括电泳分离蛋白质并原地鉴别这些可与浸透过的底物作用的蛋白质糖基水解酶和转糖基酶,以形成一个酶谱。
17.如权利要求10所述并从XLLG衍生获得的OAD和丽丝胺若丹明磺酰氯间形成的标记过的共轭物的应用,它用作植物组织适用的探针,在加入或没有加入的未标记的木聚糖下绘制XET组织化学的活性区域分布。
18.如权利要求10所述的有与茚三酮反应活性的OAD在用包括HPLC和阳离子交换层析分析的色谱法或包括毛细管电泳或高压纸电泳的电泳法来测定寡糖作为可靠的标准标记物的应用。
19.如权利要求10所述的OAD的标记过的共轭物在用包括HPLC、薄层层析或纸层析的色谱法或电泳法测定寡糖时用作可靠的标准标记物的应用。
20.一种测定如XET的工具,包括用权利要求10所述的OAD浸透的基底材料。
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