CN1194029C - 油水两相法制备磁性琼脂糖凝胶微球的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油水两相法制备磁性琼脂糖凝胶微球的方法。该方法将钕铁硼颗粒分散在琼脂糖溶液中，通过搅拌将该混合物悬浮于掺有乳化剂Span80的色拉油中，钕铁硼颗粒封装在琼脂糖微球中，降温使其固化，接着进行交联和还原，得到密度可达2.04g/mL磁性琼脂糖凝胶微球。其特征是对油相、乳化剂、琼脂糖溶液用量的确定，以及交联剂和还原剂的选用。本发明过程简便经济，制备的磁性微球粒径在50～300μm，密度高，对蛋白质的分离有良好的效果。
Description
本发明涉及一种油水两相法制备磁性琼脂糖凝胶微球的方法，属于磁性颗粒负载于载体中的微球制备技术。
近年来，随着重组DNA技术和细胞融合技术的发展，各种生物活性物质如细胞因子、酶、抗体和核酸等的大量生产成为可能。这些生物活性物质的附加价值极高，但在原料液中含量很低。因此，低成本、高收率纯化目的产物以及有效控制有害物质是这些生物产物分离纯化过程所追求的目标。由于生物产物的多样性，要求研究开发新型高效以及具有针对性的分离技术。20世纪80年代开始有学者将磁稳流化床用于生物产物的分离。磁稳流化床是一种集成分离过程，集流化床、固定床和磁分离技术的优点于一身，即可以减少离心或过滤等单元操作步骤、分离速度快、操作条件温和、过程效率高、产物活性收率高、降低分离纯化的成本，在生物分离中具有诱人的开发前景。磁稳流化床的核心是磁性分离介质，因此适用于磁稳流化床的磁性分离介质的合成是磁稳流化床操作实现的关键。
目前，常用的磁性分离介质中铁磁性物质所占的比例较高，有些高达40％，大大降低了分离介质的吸附量，这严重限制了磁稳流化床在生物产品分离中的发展。而且，Fee在1996年《AIChE Journal》的第42卷中发表论文，认为适用于磁稳流化床操作的磁性分离介质的最佳密度是在1.6-1.9g/mL之间，但现有的磁性分离介质的密度一般都小于1.3g/mL。因此，研究开发新型的具有高密度、高比表面积、高吸附容量的磁性分离介质已经引起各国科学家的重视。例如Goetz等在1991年《Biotechnology and Bioengineeing》的第37卷发表论文，涉及利用硅胶粒子与镍粉表面间的静电作用，将硅胶包裹在镍粉周围，制备了磁性硅胶载体。但对吸附后硅胶载体的洗脱，条件要求较苛刻，所以其使用范围受到限制。天然高分子材料由于拥有大量易于修饰的官能团，并且生物相容性好，洗脱条件温和。因此，利用天然高分子材料与磁性物质相结合制备磁性微球特别引起研究者的关注。油水两相法由于其制备的微球形状规则、操作简单、设备要求低，在微球制备方面被广泛应用，在现有技术中其通常是已知的。例如德特勒夫·米勒-舒尔特在中国专利CN 1198104A中，通过油水两相法以聚乙烯醇为基质制备一种球形聚合体颗粒，其中通过封装磁性胶体制备了低密度磁性聚乙烯醇聚合物。
针对现有的磁性分离介质中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种油水两相法制备磁性琼脂糖凝胶微球的方法，以此方法制备的磁性微球粒径为50-300μm，密度可以高达2.04g/mL，对蛋白质的分离有良好的效果。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。在80-90℃下，将钕铁硼合金颗粒分散在琼脂糖溶液中，然后通过搅拌将该混合物悬浮于掺有乳化剂Span80的色拉油中，将钕铁硼合金颗粒封装在琼脂糖微球中，迅速降温使其固化。接着对其进行交联和还原，得到密度可达2.04g/mL磁性琼脂糖凝胶微球，其特征在于，钕铁硼合金颗粒粒径为20-50μm，其密度为7.4g/mL；其中色拉油的用量为水相体积的8-12倍，水相中琼脂糖溶液用量是钕铁硼合金颗粒体积的10-60倍，乳化剂Span80的加入量为10-50g/L；采用的交联剂为环氧氯丙烷，在0.3-0.7M NaOH条件下，环氧氯丙烷的浓度为1-5％(体积)，还原剂采用硼氢化钠，其用量在0.8-1.4M NaOH条件下为4-6g/L。
上述的色拉油的用量为水相的9～10倍。
上述的水相中的琼脂糖溶液是钕铁硼合金颗粒体积的15～30倍。
上述的环氧氯丙烷的用量，在0.3～0.7MNaOH条件下为2～4％(体积)。
上述的硼氢化钠的用量，在0.8～1.4M NaOH条件下为5g/L。
下面对本发明进行详细说明。
本发明的关键技术有五点：一是钕铁硼合金颗粒的选择。钕铁硼合金颗粒的密度为7.4g/mL，磁饱和度高，可以用来制备高密度、饱和磁化强度强的微球。关键技术之二是确定选用钕铁硼合金颗粒大小。材料的粒径是制备合适粒径的磁性微球的先决条件，为制备粒径为50-300μm的磁性微球，本发明选择了钕铁硼合金颗粒的粒径为20-50μm。关键技术之三是采用油水两相法制备磁性微球。本发明提出通过油水两相法在掺有乳化剂Span80的色拉油中对磁性颗粒进行包裹反应，这有利于对磁性颗粒的包裹完全，包层均匀以及提高防聚性。关键技术之四是通过调节水相琼脂糖溶液和钕铁硼颗粒体积比，可以实现对制备的磁性微球密度的控制。关键技术之五是在制备过程中经过交联和还原等步骤处理，这有利于提高微球的强度，从而提高抗压性，并可同时改善微球表面的某些化学功能团，有利于修饰配基。
本发明制备的磁性琼脂糖凝胶微球同现有的磁性分离介质相比较，其明显的优点是，制备过程简便经济，对设备要求不高；具有较强的磁响应性，在磁场下可以实现迅速分离；活性基团多，易于修饰配基；通过修饰配基，例如色素配基、离子交换基团等，对蛋白质、细胞等具有较高的吸附容量，并且洗脱条件温和；生物相容性好，亲水性好，在酶的固定化、细胞分离、DNA检测、蛋白质的纯化等方面具有广泛的应用前景；由于微球具有较高的密度，因此可以用于磁稳化床和膨胀床等多种分离操作。
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例一：
在90℃下，通过超声分散将30g的粒径为25-50μm的钕铁硼合金颗粒分散于60mL的40g/L的琼脂糖溶液中。将该混合物滴入含10g/L Span80的600mL有机相中，保持反应温度90℃，控制搅拌速度1400rpm，搅拌30min后，迅速降温，控制温度为15℃，并且维持搅拌速度1400rpm，继续搅拌30min。接着，在磁场下沉降磁性微球，沉降下的微球先用丙酮后用蒸馏水反复洗涤，直至有机相洗净。然后，取50mL洗净的微球(沉积重量为50g)与50mL的1mol/L NaOH混合，加入NaBH4使溶液中NaBH4的浓度为5g/L。在水浴摇床中，25℃，150rpm下，反应30min。接着，加入4mL的环氧氯丙烷，在水浴摇床中，25℃，150rpm下，反应5h。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性。然后，将50mL微球与50mL的2mol/LNaOH混合，加入NaBH4使溶液NaBH4的浓度为5g/L，煮沸。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性，即得到大小分布于50-300μm磁性微球。通过优选筛分得到大小分布于50-150μm，密度为1.875g/mL且钕铁硼合金颗粒含量为13％(体积)和大小分布于150-300μm，密度为2.04g/mL(体积)且钕铁硼合金颗粒含量为16％的磁性琼脂糖微球。
实施例二：
在90℃下，通过超声分散将8.75g的粒径为25-50μm的钕铁硼合金颗粒分散于70mL的50g/L的琼脂糖溶液中。将该混合物滴入含50g/L Span80的700mL有机相中，保持反应温度90℃，维持搅拌速度1500rpm，搅拌35min后，迅速降温，控制温度为15℃，并且维持搅拌速度1500rpm，继续搅拌15min。接着，在磁场下沉降磁性微球，沉降下的微球先用丙酮后用蒸馏水反复洗涤，直至有机相洗净。然后，取20mL洗净的微球(沉积重量为20g)与60mL的1mol/L NaOH混合，加入NaBH4使溶液中NaBH4的浓度为5g/L。在水浴摇床中，25℃，150rpm下，反应30min。接着，加入1.6mL的环氧氯丙烷，在水浴摇床中，25℃，150rpm下，反应5h。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性。然后，将50mL微球与50mL的2mol/LNaOH混合，加入NaBH4使溶液NaBH4的浓度为5g/L，煮沸。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性，即得到大小分布于50-300μm磁性微球。通过优选筛分得到大小分布于50-150μm，密度为1.26g/mL且钕铁硼合金颗粒含量为3.6％(体积)和大小分布于150-300μm，密度为1.19g/mL(体积)且钕铁硼合金颗粒含量为2.5％的磁性琼脂糖微球。
Claims (2)
1.一种油水两相法制备磁性琼脂糖凝胶微球的方法，该方法在80-90℃下，将钕铁硼合金颗粒分散在琼脂糖溶液中，然后通过搅拌将该混合物悬浮于掺有乳化剂Span 80的色拉油中，将钕铁硼合金颗粒封装在琼脂糖微球中，迅速降温使其固化，接着对其进行交联和还原，得到密度可达2.04g/mL磁性琼脂糖凝胶微球，其特征在于：钕铁硼合金颗粒粒径为20-50μm，其密度为7.4g/mL；其中色拉油的用量为水相体积的8-12倍，水相中琼脂糖溶液用量是钕铁硼合金颗粒体积的10-60倍，乳化剂Span 80的加入量为10-50g/L；采用的交联剂为环氧氯丙烷，在0.3-0.7M NaOH条件下，环氧氯丙烷的体积浓度为1-5％，还原剂采用硼氢化钠，其用量在0.8-1.4M NaOH条件下为4-6g/L。
2.根据权利要求1所述的一种油水两相法制备磁性琼脂糖凝胶微球的方法，其特征在于：色拉油的用量为水相的9-10倍；水相中琼脂糖溶液是钕铁硼合金颗粒体积的15-30倍；在0.3-0.7M NaOH条件下，环氧氯丙烷的体积浓度为2-4％；硼氢化钠的用量，在0.8-1.4M NaOH条件下为5g/L。
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