CN1193095C - 复合物 - Google Patents
复合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1193095C CN1193095C CNB018145493A CN01814549A CN1193095C CN 1193095 C CN1193095 C CN 1193095C CN B018145493 A CNB018145493 A CN B018145493A CN 01814549 A CN01814549 A CN 01814549A CN 1193095 C CN1193095 C CN 1193095C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- derived
- cell
- retrovirus
- mixture
- retroviral
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims abstract description 96
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 200
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 153
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 142
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 115
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 61
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 42
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 37
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 23
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 claims description 22
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims description 22
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 11
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims 12
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 abstract 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 244000309466 calf Species 0.000 description 25
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 25
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 25
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 11
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 9
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 8
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 6
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 3
- NOFOAYPPHIUXJR-APNQCZIXSA-N aphidicolin Chemical compound C1[C@@]23[C@@]4(C)CC[C@@H](O)[C@@](C)(CO)[C@@H]4CC[C@H]3C[C@H]1[C@](CO)(O)CC2 NOFOAYPPHIUXJR-APNQCZIXSA-N 0.000 description 3
- SEKZNWAQALMJNH-YZUCACDQSA-N aphidicolin Natural products C[C@]1(CO)CC[C@]23C[C@H]1C[C@@H]2CC[C@H]4[C@](C)(CO)[C@H](O)CC[C@]34C SEKZNWAQALMJNH-YZUCACDQSA-N 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 3
- 230000003114 pinocytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000029305 taxis Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZKAYEGOIJEWQB-UHFFFAOYSA-N 1,3-dibromopropane;n,n,n',n'-tetramethylhexane-1,6-diamine Chemical compound BrCCCBr.CN(C)CCCCCCN(C)C KZKAYEGOIJEWQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005768 DNA-Activated Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010006124 DNA-Activated Protein Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 229950007870 hexadimethrine bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 230000004668 G2/M phase Effects 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 1
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091061763 Triple-stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 101150008905 baf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 101150047047 gag-pol gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940029329 intrinsic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
包含其中含有源自逆转录病毒的末端重量并含有逆转录病毒中缺乏的碱基序列的DNA的双链DNA、以及源于逆转录病毒的蛋白成分的复合物。
Description
技术领域
本发明涉及通过将外源基因转移到真核细胞中的转导方法,以及一系列与之相关的技术,而这些技术在医学、药理学、农业研究、林学和渔业以及营养学领域是有用的。
背景技术
利用病毒载体、通过胞饮作用、电穿孔或基因枪等方法转移裸露DNA的方法是将基因转移到真核细胞中的方法。病毒载体可应用于包括基础研究和临床研究在内的广泛的基因治疗领域。例如,腺病毒载体适于靶细胞中大量目的基因的瞬时表达。由于其能稳定整合到宿主染色体中,逆转录病毒载体允许长期的稳定表达。因此,逆转录病毒在遗传疾病的基因治疗领域和转基因动物生产领域很有开发潜力。
然而,按照应用了病毒载体的基因转移方法,基因转移是通过病毒感染来介导的,这样,病毒的趋性就引起了一个问题。特别地,我们无法将一个基因转移到一个在其表面不能表达病毒受体的细胞中。为了克服这个缺陷,我们开发了假型逆转录病毒载体。此假型逆转录病毒载体利用水泡性口炎病毒VSV-G的被膜糖蛋白,可感染大量宿主。此载体不仅可用于将一基因转移到哺乳动物中,而且也可用于将基因转移到鱼、鸟、昆虫、两栖动物等中。已经进行了利用此载体来生产转基因动物的尝试。然而,由于逆转录病毒的性质决定了该载体只能将一个拷贝转移到靶细胞中,另外从开始感染到整合到染色体上这一过程需要至少7个小时,这就使得此载体具有一些问题。
当利用裸露的DNA进行基因转移时,利用大肠杆菌等就可很容易的制备该DNA,并且可对基因进行转移,例如利用磷酸钙转染或阳离子脂质体转染、电穿孔、基因枪或微注射技术介导来进行基因转移。在这种情况下,一些DNA通过重组整合到了染色体中,但整合效率很低。因此,在绝大多数情况下,这些技术仅仅用于需要进行瞬时基因表达的情况中,不适于长期的稳定表达。然而,目前,通过微注射或类似方式对裸露DNA进行转移的技术专门用于转基因生物的生产。如上所述,鉴于基因与染色体的整合仅仅通过意外重组来完成,转基因生物的生产效率相当低。因此,在目前条件下,转基因生物的生产成本很高,并且耗时很大。
发明目的
本发明的主要目的是提供通过基因转移来转导多种细胞的方法,此方法是在不顾及宿主范围的情况下,利用逆转录病毒载体与染色体进行稳定整合的功能特性和用于基因转移的组合物、以及该方法中选用的用于转导的组合物来进行的。因此,有可能发明一种技术,利用其来生产多种转基因生物并开发基因治疗领域中的新颖载体。
发明概述
作为深入研究的结果,本发明的发明者制备了一个重组的整合前复合物(rPIC),将其转移到靶细胞中,令人惊讶的发现,不管原始病毒的趋性如何,rPIC中含有的一个基因整合到了靶细胞的染色体中。在重组的逆转录病毒载体整合到宿主染色体中之前立即形成了rPIC。
此外,本发明的发明者开发了一个可用于将基因转移到多种靶细胞中的复合物、产生该复合物的方法、将基因转移到细胞中的方法以及在上述发现的基础上利用此复合物转化细胞的方法。这样,完成了本发明。
本发明的概要如下。本发明的第一方面涉及一种复合物,其包含含有源自逆转录病毒的长末端重复和逆转录病毒中缺乏的核苷酸序列的双链DNA、以及源于逆转录病毒的蛋白成分。
本发明的第二方面涉及制备第一方面中的复合物的方法。
本发明的第三方面涉及基因转移方法,此方法包括将第一方面中的复合物转移到细胞中。
本发明的第四方面涉及基因转移方法,此方法包括:
将源自逆转录病毒的蛋白成分以及含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA转移到细胞中。
本发明的第五方面涉及一种用于基因转移的组合物,它含有第一方面的复合物。
本发明的第六方面涉及用于基因转移的试剂盒,其可用于第三或第四方面中的基因转移方法。
本发明的第七方面涉及用于将基因转移到细胞中的试剂产品,
此产品含有包装材料和包含于包装材料中用于基因转移的试剂,
其中,用于基因转移的试剂包括本发明第一方面中的复合物和/或用于制备此复合物的试剂,以及
其中,在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此基因转移试剂可用于基因转移,该转移并不包含利用重组逆转录病毒感染目的细胞这一步。
本发明的第八方面涉及将基因转移到细胞中的试剂产品,
此产品含有包装材料和包含于包装材料中用于基因转移的试剂,其中,此基因转移试剂包括本发明第四方面的基因转移方法中应用的试剂,以及
其中,在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此基因转移试剂可用于基因转移,该转移并不包含利用重组逆转录病毒感染目的细胞这一步。
本发明的第九方面涉及转化细胞的方法,此方法包括将第一方面中的复合物转移到细胞中。
本发明的第十方面涉及转导细胞的方法,此方法包括利用第四方面中的方法来转移基因。
本发明的第十一方面涉及用于转导细胞的组合物,其中包括第一方面中的复合物。
本发明的第十二方面涉及用于转导细胞的试剂盒,该转导包含本发明第三或第四方面中的基因转移方法。
本发明的第十三方面涉及用于转导细胞的试剂产品,
此产品含有包装材料和包含于包装材料中的用于转导的试剂,
其中,用于转导的试剂包括本发明第一方面的复合物和/或用于制备此复合物的试剂,以及
其中,在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此转导试剂可用于转导,该转导并不包含利用重组逆转录病毒感染目的细胞这一步。
本发明的第十四方面涉及用于转导细胞的试剂产品,
此产品含有包装材料和包含于包装材料中的用于转导的试剂,
其中,用于转导的试剂包括本发明第十方面的转导方法中应用的试剂,以及
其中,在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此转导试剂可用于转导,该转导并不包含利用重组逆转录病毒感染目的细胞这一步。
发明详述
本发明的详细描述如下。
本发明中的复合物是用于将基因转移到靶细胞中的复合物。特别地,此复合物是包含至少一个含有源自逆转录病毒的长末端重复(LTR)和具有逆转录病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA(也即与逆转录病毒起源不同的DNA)的双链DNA、以及源于逆转录病毒的蛋白成分的复合物。此复合物具有与逆转录病毒不同的结构。特别的,本发明中的复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。在一个实施方案中,此源自逆转录病毒的长末端重复及具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA是来源于重组逆转录病毒。利用此复合物,可将复合物中在源自重组逆转录病毒的双链DNA中包含的基因、或具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA转移到靶细胞中。正如此处所用的,重组逆转录病毒是指对天然逆转录病毒基因组的核苷酸序列进行了部分修饰的逆转录病毒。例如,重组逆转录病毒包括有外源基因插入的逆转录病毒、其病毒基因组中的一个基因或其部分经受缺失、取代、插入或添加的逆转录病毒。没有与重组逆转录病毒相关的特定限制。它可以是亲嗜性病毒或兼嗜性病毒、或假型病毒。例如,可以选用商业购买的重组逆转录病毒载体。
没有与含有源自逆转录病毒的长末端重复(LTR)和含有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA相关的特别限制。优选的,此双链DNA含有两个源自逆转录病毒的LTR及一个含有插入到两LTR间的逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列DNA。
没有与含有逆转录病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA相关的特别限制。可以选用任何DNA,只要其向细胞内的转移是所需的。例如,可选用含有编码蛋白如酶或生长因子的基因的DNA,或含有编码反义核酸、核酶等的基因的DNA。
此DNA可含有适当的标记基因来对含有被转移基因的细胞进行筛选。例如,能对细胞上的抗生素产生抗性的药物抗性基因、使含有被转移基因的细胞可以基于酶活性等而区别的报道基因等都可用做标记基因。
按照本发明,在适当的启动子如逆转录病毒载体中的LTR启动子或外源启动子的控制下,待转移到细胞中的基因可包含在本发明的复合物中的双链DNA中。此外,为了完成外源基因的有效转录,双链DNA可包含与启动子或转录起始位点协同作用的另一调节元件(如一增强子序列或终止子序列)。此外,为了避免染色体位置效应,双链DNA可包含绝缘体序列等。待转移的外源基因可以是天然存在的或人工制备的。另外,可利用已知方法如连接反应来连接不同来源的DNA分子以获得外源基因。
正如此处所用,源于逆转录病毒的蛋白成分指具有将病毒DNA整合到宿主DNA上的整合活性的蛋白成分。尽管没有限制本发明的目的,例如,蛋白成分含有一种酶,此酶具有将源自逆转录病毒的、具有长末端重复的DNA整合到染色体中的活性(例如,源自逆转录病毒的整合酶)。此外,源自逆转录病毒的蛋白成分可含有另一种蛋白,此蛋白已知包含在整合前复合物(PIC)中,而此复合物是在利用逆转录病毒将一基因整合到染色体中之前形成的。这样的蛋白的例子有逆转录酶、核酸结合蛋白、衣壳蛋白或基质蛋白。同样,细胞内因子如非组蛋白蛋白HMG-1或BAF-1,或DNA依赖型蛋白激酶(DNA-PK)也可包括在内。按照本发明,源自逆转录病毒的蛋白成分可在源自逆转录病毒的天然蛋白成分中具有缺失、取代、插入或添加等修饰,只要其具有将病毒DNA整合到宿主染色体中的活性。
逆转录病毒感染了正在分裂和生长的细胞后,其病毒基因就整合到宿主细胞的染色体中。利用逆转录病毒将基因整合到染色体中要进行下列一系列步骤:(1)通过受体将病毒颗粒附着到靶细胞表面上;(2)释放核心以侵入到细胞质中;(3)利用核心中的逆转录酶合成cDNA;(4)利用RNA酶H活性和酶的DNA依赖型DNA合成活性来合成双链DNA;(5)形成整合前复合物(PIC);(6)将PIC转运到核中;及(7)通过具有整合活性的酶的作用对宿主染色体进行稳定的整合。
将基因整合到染色体中时需要通过断裂宿主核膜的方式将PIC转运到宿主的核中。转运是通过宿主细胞的G2/M期完成的。因此,PIC不能转运到不是正在分裂的细胞核中,从而基因与染色体的整合也就不能完成。因此,如果逆转录病毒感染的细胞停止在G1期,不能转运进核中的PIC就堆积在细胞质中。我们能从细胞质中制备堆积的PIC。
例如,利用上述机制,按照下述步骤可优选的制备本发明中的复合物。
利用重组逆转录病毒感染通过细胞周期调节剂如蚜栖菌素处理而停止在G1期的细胞。对感染后的细胞进行培养。正如此处所用的,此培养没有限定在孵育细胞以增加细胞数目上,而还包括维持细胞在细胞周期停止的状态中。感染后7-11小时的时间内,在细胞质中进行了逆转录、双链DNA合成和重组整合前复合物(rPIC)形成过程。由于细胞周期停止在G1期,生成的rPIC没有整合到染色体中,而是聚集在细胞质中。利用去污剂来降解细胞膜可很容易的提取聚集在细胞质中的rPIC。提取到的rPIC可用于本发明中的方法中。此外,利用已知的方法如离心或色谱可对提取到的rPIC进行纯化。从而,纯化得到的rPIC也可用于本发明中的方法中。
用于制备本发明中的复合物的培养细胞可以是任何能被所用的逆转录病毒感染的细胞。例如,可选用NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)、HT-1080细胞(ATCC CCL-121)或293细胞(ATCC CRL-1573)。
利用适当的补充试剂如polybrene或WO 95/26200或WO 97/18318中描述的功能性物质,通过重组逆转录病毒可有效感染停止在G1期的细胞。纤连蛋白片段可用做功能性物质。特别的,优先选用RetroNectin(Takara Shuzo)。
重组逆转录病毒颗粒具有双链DNA合成所必需的逆转录酶活性和DNA合成酶活性,并具有与染色体整合所必需的蛋白成分(如整合酶)。因此,本发明中的复合物也可通过向体外破坏后的重组逆转录病毒颗粒中添加脱氧核糖核苷酸并对此混合物进行孵育而制备得到。
具体地,重组逆转录病毒颗粒是在适当的条件下进行体外破坏的。将脱氧核糖核苷酸添加进去。随后,在体外进行cDNA合成和双链DNA的合成反应。合成的双链DNA与蛋白成分(如整合酶)结合。从而,形成了rPIC。上述形成的rPIC可用于本发明的方法中。此外,利用已知的方法如离心或色谱可对形成的rPIC进行纯化。从而,纯化后的rPIC也可用于本发明中的方法中。
此外,在不选用病毒颗粒的情况下,可以通过分别制备源自逆转录病毒且含有LTR的双链DNA和逆转录病毒中缺乏的核苷酸序列、以及源自逆转录病毒的蛋白成分,并将他们在体外混合就可制备得到本发明中的复合物。
对于含有源自逆转录病毒的LTR的并含有所用病毒中缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA,此处没有特别的限制。例如,双链DNA含有两个源自逆转录病毒的LTR和具有插入到此两LTR间的病毒缺乏的核苷酸序列的DNA。没有对含有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的大小进行特别限定。按照目的不同可选用任何大小的DNA。
对于制备含有一个源自逆转录病毒的LTR和具有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA,此处没有特别的限定。例如,构建一个质粒,此质粒含有包含源自逆转录病毒的LTR和具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的基因盒,培养经此质粒转化过的宿主细胞(如大肠杆菌),这样就能从由培养物中分离到的质粒中制备大量的双链DNA。如果构建的质粒的一个限制性酶(或多个限制性酶)切割位点位于含有源自逆转录病毒的LTR和具有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA的两侧,通过限制性酶的作用就可以很容易制备得到目的双链DNA。利用基因扩增方法如PCR,选用具有上述基因盒的质粒,也可通过扩增来制备含有源自逆转录病毒的LTR和具有病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA。
按照本发明,在源自选用的逆转录病毒的蛋白成分的制备方法上没有特别限定。例如,可从病毒颗粒、利用基因工程或从包装细胞来制备此蛋白成分。按照本发明,通过将编码此蛋白成分的基因克隆到表达载体中,利用表达载体在大肠杆菌等宿主中表达此基因,这样就可很容易制备得到源自所选用的逆转录病毒的蛋白成分(如整合酶)。
培养包装细胞而得到的培养上清液中含有具有DNA整合活性的成分。因此,源自本发明所选用的逆转录病毒的蛋白成分可从培养上清液中制备。例如,对培养包装细胞后得到的培养上清液进行超离心,就能制备得到含有此蛋白成分的蛋白复合物。此外,也可从包装细胞提取物中获得含有此蛋白成分的蛋白复合物。此外,可利用已知的方法从蛋白复合物中纯化具有DNA整合活性的蛋白成分。这样得到的纯化的蛋白成分也可可用于本发明中。
对于选用的包装细胞,此处没有特别的限定。例如,优先选用BOSC23细胞等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8392-8396(1993))。
在不选用病毒颗粒的情况下,可通过将含有源自逆转录病毒的LTR和病毒中缺乏的核苷酸序列的双链DNA与源自逆转录病毒的蛋白成分混合来制备本发明中的复合物,其中双链DNA和蛋白成分是按照上述方法在体外分别制得的。上述制备的复合物可用于本发明的方法中。此外,利用已知方法如离心或色谱法对复合物进行选择性纯化。纯化后的复合物也可用于本发明中的方法中。
如上所述,如果复合物是在体外制备的,那么对于本发明的复合物中的双链DNA大小没有特别的限定。因此,利用此复合物,就可对8kb或更长的基因进行转移,而这是利用逆转录病毒载体进行的基因转移方法所办不到的。
只要不妨碍复合物转移到细胞中和DNA整合到染色体中,此复合物可含有另一元件。
本发明中的复合物不需要包装在逆转录病毒颗粒中。
本发明中的复合物可用于制备后立即进行的基因转移。另外,也可对其进行冷冻保存并在应用前解冻应用。对冷冻保存方法没有特别的限定,例如,可利用干冰对此复合物进行迅速冷冻,随后在-80℃下保存。
将上述制备的复合物转移到靶细胞中,基因就可转移到靶细胞的染色体中,或可对靶细胞进行转导。
对将复合物转移入靶细胞中的方法没有特别的限定。例如,可利用已知方法,如其中应用了胞饮作用的方法(如阳离子脂质体法或磷酸钙法)或穿孔法如电穿孔、基因枪或微注射等,对复合物进行转移。如果利用穿孔法对复合物进行转移,如WO96/17073中所述,那么在转移后,在具有细胞粘附活性的物质存在下,通过培养靶细胞就可有效获得被转导的细胞。
通过将含有源自逆转录病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的双链DNA以及源自逆转录病毒的蛋白成分转移进靶细胞中,就可将基因转移到靶细胞的染色体中,或就可对靶细胞进行转导。
关于含有源自逆转录病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的双链DNA及源自逆转录病毒的蛋白成分的转移顺序,此处没有特别的限定。可首先对含有源自逆转录病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的双链DNA进行转移,或可首先对源自逆转录病毒的蛋白成分进行转移。此外,也可对它们同时进行转移。对于将含有源自逆转录病毒的LTR和病毒缺乏的核苷酸序列的双链DNA及源自逆转录病毒的蛋白成分转移到靶细胞中的方法来讲,此处没有特别的限定。例如,可利用已知的方法如应用胞饮作用的方法(如阳离子脂质体法或磷酸钙法)或穿孔法如电穿孔、基因枪或微注射来对它们进行转移。如果利用穿孔法进行转移,如WO96/17073中所述,那么在转移后,在具有细胞粘附活性的物质存在下,通过培养靶细胞就可有效获得被转导的细胞。
关于本发明中的基因转移法或转导方法中选用的靶细胞的来源,此处没有特别的限定。由于重组逆转录病毒的趋性,多种真核细胞可用做靶细胞而没有任何限制,而本发明中的复合物就是源于此重组逆转录病毒。例如,真核生物如哺乳动物、鸟、鱼、昆虫或植物的细胞都可用做靶细胞。
此处对靶细胞的类型没有特别限制。所有类型的细胞(包括,如干细胞如造血干细胞和胚胎干细胞,生殖细胞如卵子和精子,以及多种体细胞)可用做靶细胞。
靶细胞可以是培养后的细胞或单独的生物体。可利用脊椎动物受精卵或生殖细胞系作为靶细胞来生产转基因动物。
从病毒感染开始到基因整合到染色体中,利用逆转录病毒进行的传统的基因转移需要至少7个小时的时间。这是因为在细胞质中形成整合前复合物需要时间。在此时间内,靶细胞进行分裂,这样就形成了嵌合体,其中产生了具有转移基因的细胞和缺乏转移基因的细胞。这种现象对于生产转基因动物来说是一个大问题。
另一方面,按照本发明中的基因转移方法,转移后基因立即整合到染色体中。因此,不会形成这样的嵌合体。从而,本发明中的基因转移方法和转导方法保证了有效生产转基因生物体。
此外,按照利用逆转录病毒进行的传统基因转移,操作人员只能转移一个基因拷贝到靶细胞中。另一方面,按照本发明中的转移方法,通过调节待转移的复合物的数量,我们能够将多拷贝基因转移进靶细胞中。
用于本发明中的基因转移的组合物和用于本发明中的转导的组合物可分别用于本发明中的基因转移方法和基因转导方法,并且它们含有本发明中的复合物或源自逆转录病毒的蛋白成分。此组合物可含有适当的缓冲物质、盐等。此组合物也可额外的含有可促进基因转移的任何物质。
用于本发明中的基因转移的试剂盒和用于本发明中的转导的试剂盒可分别用于本发明中的基因转移方法和基因转导方法。此组合物以包装形式存在,并含有可用于方法中的试剂和说明,此说明可指导将本发明中的复合物、或本发明中源自逆转录病毒的蛋白成分及含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA转移入细胞中。正如此处所用的,说明是指指导施行本发明中的方法的文件。例如,此说明可以是用来描述本发明中的基因转移方法、本发明中的基因转导方法、利用本发明中的复合物或利用该方法中源自逆转录病毒的蛋白成分进行的方法、推荐使用的反应条件等的打印文档。这些说明包括小册子或传单形式的说明手册、粘贴到试剂盒上的标签、以及在含有试剂盒的包装上的说明书。这些说明也包括通过电子媒体如互联网公开或提供的信息。
本发明中的试剂盒可含有用于制备本发明中的复合物的细胞、用于培养细胞的培养基、试剂和/或培养容器、用于将复合物、源自逆转录病毒的蛋白成分、或含有源自逆转录病毒的长末端重量和具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA转移进靶细胞的试剂。
利用此试剂盒,技术人员可很方便的施行本发明中的基因转移方法和转导方法。
用于本发明中的基因转移或转导的试剂产品是含有包装材料质及包含在包装材料质中、用于基因转移或细胞转导的试剂产品,其中,用于基因转移或转导的试剂含有复合物和/或制备此复合物的试剂,而此复合物含有包含源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA、以及源自逆转录病毒的蛋白成分,其中在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此用于基因转移或转导的试剂可用于基因转移或转导,该转移或转导不包括利用逆转录病毒来感染目的细胞这一步。
此外,本发明中用于基因转移或转导的试剂产品是包含有包装材料和包含在包装材料内用于基因转移或转导的产品,其中用于基因转移或转导的试剂含有具有源自逆转录病毒的蛋白成分的组合物,其中在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此用于基因转移的试剂可用于基因转移或转导,该转移或转导不包括利用重组逆转录病毒来感染目的细胞这一步。
按照本发明,我们克服了与利用逆转录病毒载体进行的传统基因转移法相关的缺陷,也即宿主范围的限制,我们可将基因转移到所有真核细胞中。特别的,由于利用逆转录病毒进行的传统的基因转移涉及通过病毒受体感染这一步,宿主范围就限制在依赖受体的存在。另一方面,不管受体存在与否,可利用已知的方法,如利用了胞饮作用的方法、穿孔法、基因枪或微注射对本发明中的复合物进行转移。结果,可将基因转移进多种细胞中而不受宿主范围限制。此外,按照本发明,在转移到靶细胞中之后,基因立即整合到染色体中。因此,在生产转基因生物时,没有形成具有与传统方法相关的问题的嵌合体。从而可有效生产转基因生物体。
按照利用病毒载体进行的传统方法,制备待应用的病毒颗粒需要进行复杂的操作。此外,由于很难制备高滴度的病毒载体,所以传统方法具有缺陷。另一方面,本发明中的复合物可在不使用病毒颗粒的情况下进行体外制备。这样,可在很短的时间内制备大量的复合物而不需要进行复杂的操作。因此,相对于传统方法,现在可更方便、更有效的对基因进行转移。
如上所述,本发明是一优良的技术,它克服了与传统技术相关的缺陷,并且本发明非常有用,例如,因为当本发明应用到任何基因治疗时,我们可期待产生显著的治疗效用,而这些基因治疗由于与传统方法相关的限制而受到了限制。
实施例
下列实施例更详细的例解了本发明,但并没有限制本发明的范围。
实施例1
制备重组整合前复合物(rPIC)
1.制备ecoGFP病毒上清液
通过将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和新霉素抗性基因的质粒导入包装细胞GP+E-86中而得到了可产生ecoGFP病毒的细胞[Journalof Virology,62:1120-1124(1998)]。37℃下,在5%CO2存在条件下,在Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM,Sigma)中对细胞进行培养,而此培养基补充有含有50单位/ml青霉素(Gibco)和50μg/ml链霉素(Gibco)的10%胎牛血清(Bio Whittaker)。在所有情况下,下文描述的方法中使用的DMEM含有50单位/ml青霉素(Gibco)和50μg/ml链霉素(Gibco)。如下所述制备ecoGFP病毒悬液。将生产细胞在10cm平板中培养到半汇合状态。向其中加入7ml补充有10%胎牛血清的DMEM。在5%CO2存在条件下,32℃下培养24小时,利用0.45微米孔径的滤膜(Millipore)来过滤培养物上清液以制备病毒上清液原液,将其保存在-80℃下待用。
2.确定病毒上清液的滴度
利用NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)、按照标准方法来确定病毒上清液的滴度(Journal of Virology,62:1120-1124(1988))。简单来讲,向6孔组织培养板(Iwaki Glass)的每个孔中添加2ml补充有包含5×104个NIH/3T3细胞的10%小牛血清(Gibco)的DMEM。此平板在5%CO2存在条件下,37℃孵育过夜。然后吸出培养基。对1ml病毒上清液进行梯度稀释,并且在每孔中添加8μg/ml的hexadimethrine bromide(polybrene,Aldrich)。37℃下孵育4小时。进一步向其中添加1ml补充有10%小牛血清的DMEM,孵育此平板20小时。随后,将培养基换做2ml补充有10%小牛血清的DMEM,而此小牛血清含有终浓度为0.5mg/ml的G418(Gibco)。继续进一步进行孵育。以3-4小时的时间间隔更换含有G418的培养基。10-12天后,利用0.2%的亚甲蓝的甲醇溶液对生长后的G-418抗性菌落进行染色并计数。一个孔中的菌落数乘以病毒上清液的稀释比率,这样就计算得到了1ml上清液中的感染性病毒颗粒数目(cfu/ml),以此作为病毒的滴度。上述制备的ecoGFP病毒悬液的滴度为1×107cfu/ml。
3.制备rPIC
在5%CO2存在条件下,在直径10cm、含有10ml补充有10%小牛血清的DMEM的培养板中培养2×106个NIH/3T3细胞,培养温度为37℃,时间为24小时。然后将培养基换为7ml补充有10%小牛血清的DMEM,其中10%、牛血清中含有2μg/ml的蚜栖菌素(Wako Pure ChemicalIndustries)。在5%CO2存在条件下额外孵育14小时,温度为37℃。在添加蚜栖菌素14小时后吸出培养基。将2ml ecoGFP病毒悬液与3ml补充有10%小牛血清的DMEM混合,并且向其中添加终浓度分别为2μg/ml和8μg/ml的阿非迪霉素和polybrene,制得一种混合物,在5%CO2存在条件下,将此混合物添加到NIH/3T3细胞中开始利用病毒进行感染,温度为32℃。起始感染3小时后,取出病毒悬液,并将培养基换为7ml补充有10%、牛血清的DMEM,而此10%小牛血清中含有2μg/ml的阿非迪霉素。在5%CO2存在条件下,额外孵育5小时(从病毒感染开始算为10小时),温度为32℃。在此时间段内,在病毒感染过的NIH/3T3细胞中进行了逆转录和DNA合成反应以形成rPIC。然而,由于阿非迪霉素的作用,NIH/3T3细胞的细胞周期停止在G1期,所以rPIC聚集在细胞质中,而没有将逆转录病毒基因整合到染色体中。
按照下列步骤从细胞质中提取聚集的rPIC。简单来讲,感染后用5ml PBS对细胞进行10小时的洗涤,并分散在2ml胰蛋白酶-EDTA(BioWhittaker)中。向其中添加5ml补充有10%小牛血清的DMEM。用9ml缓冲液A(10mMTris、225mM KCl、5mM MgCl2、1mM DTT、20μg/ml抑酶肽、pH7.4)洗涤200xg离心5分钟后得到的细胞沉淀。将在200xg下离心沉淀5分钟得到的沉淀物悬浮在250μl缓冲液A中。向细胞悬液中添加1.25μl毛地黄皂苷DMSO溶液。25℃下,将混合物静置5分钟就可提取到细胞质部分。将提取物在1000xg下离心3分钟。将上清液在5000xg下进一步离心3分钟。将得到的上清液进行50μl等分,作为rPIC悬液,并在-80℃下保存。
4.检测双链DNA
以上文3中描述的通过提取和冷冻保存得到的rPIC悬液的稀释液作为模板,利用GFP基因特异性引物进行PCR来检测源自重组逆转录病毒的GFP基因。将0.5μl TaKaRa Taq(5单位/μl,TaKaRa Shuzo)、5μl 10x PCR缓冲液(TaKaRa Shuzo)、8μl 1.25mM dNTP混合物、1μl模板、20pmol引物1(SEQ ID NO:1)、20pmol引物2(SEQ IDNO:2)及蒸馏水混合到50μl的体积制得PCR反应混合物,利用矿物油覆盖此混合物,并在94℃下加热1分钟,随后进行30个循环反应,每个循环由94℃下反应30秒、56℃下反应30秒以及72℃下反应30秒组成。反应后,在2%琼脂糖凝胶上对10μl PCR反应混合物进行电泳以确定扩增片段。以rPIC稀释液或以利用苯酚-氯仿提取而从rPIC中纯化得到的DNA作为模板。以相同的方式,对从没有病毒感染的NIH/3T3细胞提取到的片段进行PCT,作为阴性对照。结果,当以rPIC稀释液或以利用苯酚-氯仿提取而从rPIC中纯化得到的DNA作为模板进行PCR时,我们观察到了源自GFP基因的316bp片段的扩增。因此,这表明上文3中制备的rPIC含有源自重组病毒的GFP基因。
实施例2
将rPIC转移到培养后的细胞中
在5%CO2存在条件下,利用补充有10%小牛血清的DMEM和补充有10%胎牛血清的DMEM作为培养基来分别培养小鼠NIH/3T3细胞和人293细胞(ATCC CRL-1573),培养温度为32℃。通过胰蛋白酶消化来分离10cm平板中生长到汇合状态的小鼠NIH/3T3细胞和人293细胞。用不含血清的DMEM分别洗涤这两种细胞,并将他们悬浮在700μlDMEM中。将700μl细胞悬浮液和100μl实施例1中制备的rPIC置于0.4cm宽的电穿孔小杯(Bio-Rad)中,并在250V、975uF和室温下,利用基因脉冲发生器II(Bio-Rad)进行电穿孔。将1/10体积的小鼠NIH/3T3细胞或1/4体积的人293细胞接种到明胶包被的10cm平板中(Iwaki Glass)。从电穿孔后开始,在含有0.5mg/ml G418的培养基中进行细胞培养。
电穿孔后7天,在荧光显微镜下对细胞进行观察。在小鼠NIH/3T3细胞和人293细胞中都可观察到发射绿色荧光的细胞。因此,这表明转移后的GFP基因在源自鼠和人的细胞中都能表达。
在电穿孔后进一步持续培养两周后,在G418选择性培养基中就形成了抗新霉素(G418)菌落。用亚甲蓝对这些菌落进行染色。分别观察到46个小鼠NIH/3T3细胞抗性菌落和196个人293细胞抗性菌落。因此,这表明转移后的基因得到了稳定表达。
上述结果表明,从仅能感染源自鼠的细胞的亲嗜性病毒制得的rPIC也可用于将一基因稳定转移到源自人的细胞中,而按照传统方法,此基因是不能转移到源自人的细胞中的,此外也表明,rPIC可用于对基因进行稳定转移,而不必顾及宿主的范围。
实施例3
制备高滴度rPIC并确定rPIC的整合效率
1.制备高滴度rPIC
在4℃下,对250ml ecoGFP病毒上清液进行为时16小时的低速(2900xg)离心,并将沉淀物悬浮在5ml补充有10%小牛血清的DMEM中,这样就制备得到高滴度的ecoGFP病毒悬液。病毒悬液的滴度为4×108cfu/ml。病毒悬液可用于感染M.O.I为200的NIH/3T3细胞。如实施例2中所描述的来制备高滴度rPIC。
2.确定rPIC的整合效率
对293细胞的基因转移是利用高滴度rPIC、通过电穿孔进行的。作为对照,通过电穿孔或利用含有GFP基因和新霉素抗性基因的质粒载体进行转染来实施对293细胞的基因转移。基因转移后3天,利用流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson)来选择性的收获表达GFP的293细胞。在收获后的293细胞中,表达GFP的细胞的比率为94.3%(利用rPIC转移)、94.3%(通过电穿孔,利用质粒载体来转移)和98.8%(通过转染利用质粒载体来转移),这表明对具有瞬时转移的基因的细胞进行了选择性收获。在G418+和G418-培养基中培养瞬时表达GFP的293细胞,培养时间为2周。按照下列公式:[含有G418的平板中的菌落数]÷[不含G418的平板中的菌落数],来计算长期、稳定的基因表达的效率,以此作为整合效率。整合效率为98.7%(利用rPIC转移)、7.5%(通过电穿孔,利用质粒载体来转移)和1.4%(通过转染利用质粒载体来转移),这表明rPIC是一种可产生良好的整合效率的载体。
实施例4
将rPIC转移到鳉鱼的受精卵中
25℃下,在3L自来水中饲养由一条雄鱼和一条雌鱼组成的一对成熟medaka鱼,光照时间为14小时,而黑暗时间为10小时。每天对他们喂养以TetraFin(TetraWerke)3-5次,设定TetraFin的量,以便在3-5分钟内消耗完毕,并且随后产卵。在产卵后立即收集卵,在8ppm亚甲蓝水溶液中利用镊子将它们单个分开,并用水溶液洗涤。在Superose6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia)上纯化实施例3中制备的高滴度rPIC。将含有rPIC的5μl纯化级分置于微注射吸管中(利用毛细管模型GD-1制得,Narishige),在显微镜下将大约50pl rPIC悬液注射到每个单细胞阶段的鳉受精卵中。96个受精卵接受了微注射,并将它们置于96孔平板中,这样每个孔含有一个受精卵,25℃下将它们培养在8ppm亚甲蓝水溶液中。产卵后8天开始孵化鱼苗,此后开始将它们一条一条转移到鱼缸中。最后,总共孵化了47条鱼苗。16条鱼苗在孵化后立即制成标本,置于1.5ml的微管中,并在-20℃下保存。如下所述,从孵化的鱼苗中提取基因组DNA,并利用PCR来检测新霉素抗性基因。简单来讲,将100μl提取缓冲液(10mM Tris、100mMNaCl、10mM EDTA、39mM DTT、2%SDS、50μg/ml蛋白酶K、pH8)添加到每只含有一条鱼苗的微管中。60℃下孵育微管1小时。将利用苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀后得到的基因组DNA溶解在50μl蒸馏水中。
利用1μl获得的基因组DNA溶液作为模板,选用特异于新霉素抗性基因引物进行PCR以检测转移后的基因。TaKaRa Taq(TaKaRaShuzo)用于PCR反应。将0.5μl TaKaRa Taq、5μl 10x PCR缓冲液(TakaRa Shuzo)、8μl dNTP混合物、1μl稀释后的模板、20pmol引物3(SEQ ID NO:1)、20pmol引物4(SEQ ID NO:2)及蒸馏水混合至50μl的体积,制得PCR反应混合物,利用矿物油覆盖此混合物,并在94℃下加热1分钟,随后进行30个循环反应,每个循环由94℃下反应30秒、56℃下反应30秒以及72℃下反应30秒组成。在2%琼脂糖凝胶上对10μl PCR反应混合物进行电泳以确定扩增片段。结果,在利用微注射进行rPIC转移过的16条鳉鱼中全部检测到了转移后的基因。因此,基因转移效率是100%。受精后1小时,鳉鱼的受精卵处于单细胞阶段。在其后35分钟内,此受精卵分裂一次。如果VSV-G逆转录病毒载体用于分裂很快的细胞中,那么基因只能在高级发育阶段进行整合,因为逆转录过程限制了整合速率。此外,仅仅通过意外重组才能使质粒载体整合到宿主染色体中。另一方面,因为rPIC是在整合到NIH/3T3细胞基因组前立即提取出来的,所以需要在能造成高整合效率的阶段对其进行制备。因此,在细胞分裂的早期将rPIC整合到基因组中是我们所期望的。结果表明,rPIC是可应用于多种对象的载体,例如,其可作为生产转基因动物的载体。
实施例5
利用BOSC23细胞上清液将基因转移进培养后的细胞中
包装细胞BOSC23含有待转移的逆转录病毒gag-pol基因和亲嗜性env基因。37℃下,在5%CO2存在条件下,在补充有10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基中培养BOSC23细胞,而此10%胎牛血清含有50单位/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素。
BOSC23细胞在10cm平板中生长到半汇合状态。将培养基换为5ml补充有10%胎牛血清的新鲜DMEM。37℃下,在5%CO2存在条件下,对其进行为期24小时的培养。
利用孔径为0.45微米(Millipore)的滤膜对培养物上清液进行过滤,并在4℃、30,000rpm下超速离心2小时。
利用DMEM洗涤产生的沉淀,并在4℃、30,000rpm下重新超速离心2小时。将产生的沉淀悬浮在50μl DMEM中。向其中添加含有SDS的试剂。将此混合物在99℃下离心5分钟,随后对蛋白进行电泳(SDS-PAGE)。
结果,我们确定了沉淀物中含有gag蛋白(p30,p15)。
这些结果表明在BSOC23细胞培养上清液中存在含有gag-pol-env蛋白的蛋白复合物。我们期望此蛋白复合物由于其env蛋白的功能而具有感染细胞的能力。利用BOSC23细胞的培养上清液中的蛋白复合物进行试验,检验其将质粒DNA整合到培养后细胞的基因组中的能力。
1.制备BOSC23细胞上清液样品
按照下述步骤可获得BOSC23细胞上清液样品。BOSC23细胞在10cm平板中生长到半汇合状态。将培养基换为10ml补充有10%胎牛血清的新鲜DMEM。利用孔径为0.45微米(Millipore)的滤膜对在32℃、5%CO2存在条件下培养24小时后得到的培养上清液进行过滤。
2.利用BOSC23细胞上清液样品进行基因转移
利用补充有10%小牛血清的DMEM作为培养基,在5%CO2存在条件下,对小鼠NIH/3T3细胞进行培养,培养温度为37℃。利用LipofectAMINE 2000(Gibco),将在逆转录病毒LTR间含有GFP基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒载体质粒pDON-AI-rsGFP转染到在10cm平板中生长到半汇合状态的小鼠NIH/3T3细胞中。在37℃、5%CO2存在的条件下,在10ml补充有小牛血清的DMEM中培养小鼠NIH/3T3细胞以制备检验样品。将编码rsGFP的基因整合到逆转录病毒载体pDON-AI中,从而构建pDON-AI-rsGFP,其中rsGFP是从rsGFP编码质粒pQBI25(Takara Shuzo)制得的。培养5小时后,将培养基从检测样品中吸出。向其中添加4ml上文1中制备的BOSC23细胞上清液样品。进一步向其中添加8μg/ml的Hexadimethrine bromide(polybrene,Aldrich)。在32℃下培养16小时。培养16小时后,将BOSC23细胞上清液样品吸出,向其中添加10ml补充有10%小牛血清的DMEM,并在37℃、5%CO2存在的条件下培养24小时。24小时培养后,对细胞进行收获。将20,000个细胞接种到6cm、明胶包被的平板中。在补充有10%小牛血清的DMEM中培养细胞,其中的10%小牛血清中含有经浓度为0.5mg/ml的G418(Gibco)。14天后,利用0.2%亚甲蓝的甲醇溶液对生长后的G418抗性菌落进行染色并计数。此外,作为对照,将500个细胞接种到6cm、明胶包被的平板中,在37℃、5%CO2存在的条件下,在不含G418的正常培养基中培养14天。随后,利用0.2%亚甲蓝的甲醇溶液对生长后的菌落进行染色并计数。
作为对照,通过转染进行基因转移后5小时,将培养基吸出,向其中添加正常的培养基,并在37℃、5%CO2存在的条件下进行培养。
40小时后,对细胞进行收获。将20,000个细胞接种到6cm、明胶包被的平板中。在补充有10%小牛血清的DMEM中培养细胞,其中的10%小牛血清中含有终浓度为0.5mg/ml的G418(Gibco)。14天后,利用0.2%亚甲蓝的甲醇溶液对生长后的G418抗性菌落进行染色并计数。此外,作为对照,将500个细胞接种到6cm、明胶包被的平板中,在37℃、5%CO2存在的条件下,在正常培养基中培养14天。随后,利用0.2%亚甲蓝的甲醇溶液对生长后的菌落进行染色并计数。
按照下列公式:[含有G418的平板中的菌落数]÷[不含G418的平板中的菌落数],来计算长期的基因表达的效率(整合效率)。对检测样品进行确定得到的整合效率是5.00%,然而对照组的整合效率仅为0.76%。这些结果表明,将质粒载体转移到细胞中,随后利用BOSC23细胞上清液样品感染转移后的细胞,由于BOSC23细胞上清液样品中含有gag-pol-env蛋白的蛋白复合物的作用,质粒载体可以大约高于对照组7倍的效率整合到宿主细胞的基因组中。这些结果表明,具有LTR和逆转录病毒结构蛋白的质粒载体在靶细胞中形成了一个复合物。
工业实用性
本发明提供了在不必顾及宿主范围的情况下,有效的进行基因转移的方法。按照本发明中的基因转移方法,由于转移后的基因是立即整合到宿主染色体中的,所以此方法可保证有效生产转基因生物。
序列表文字
SEQ ID NO:1:用于扩增GFP基因的一部分的PCR引物。
SEQ ID NO:2:用于扩增GFP基因的一部分的PCR引物。
SEQ ID NO:3:用于扩增neor基因的一部分的PCR引物。
SEQ ID NO:4:用于扩增neor基因的一部分的PCR引物。
序列表
<110>宝生物工程株式会社
<120>复合物
<130>662777
<150>JP 2000-285857
<151>2000-09-20
<160>4
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增GFP基因的一部分的PCR引物
<400>1
caccctcgtg accaccctga c 21
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增GFP基因的一部分的PCR引物
<400>2
caccttgatg ccgttcttct gctt 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增neor基因的一部分的PCR引物
<400>3
gcttgatccg gctacctgcc catt 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增neor基因的一部分的PCR引物
<400>4
gccacagtcg atgaatccag aaaa 24
Claims (33)
1.包含含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA、以及源自逆转录病毒的蛋白成分的复合物,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,其中此复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
2.权利要求1中的复合物,其中含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的双链DNA是源自重组逆转录病毒。
3.权利要求2中的复合物,其中重组逆转录病毒可通过利用重组逆转录病毒感染易被重组逆转录病毒感染的细胞来获得。
4.权利要求3中的复合物,其中易被重组逆转录病毒感染的细胞的细胞周期处于停止状态。
5.权利要求1中的复合物,其可通过将含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的核苷酸序列的DNA的分离双链DNA与源自逆转录病毒的分离蛋白成分相混合获得。
6.权利要求1中的复合物,其中源自逆转录病毒的蛋白成分是源自包装细胞的培养上清液和/或源自包装细胞的提取物。
7.制备复合物的方法,此方法包括:
(a)利用含有源自逆转录病毒的长末端重复和逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的重组逆转录病毒来感染易被重组逆转录病毒感染的细胞;
(b)培养在(a)步感染的细胞;并且
(c)从(b)步培养的细胞中收集包含源自重组逆转录病毒的双链DNA和源自逆转录病毒的蛋白成分的复合物,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,其中此复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
8.权利要求7中的方法,其中易被重组逆转录病毒感染的细胞的细胞周期处于停止状态。
9.制备复合物的方法,此方法包括:
(a)破坏含有源自逆转录病毒的长末端重复和逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的重组逆转录病毒颗粒以制备含有病毒成分的混合物;
(b)向在步骤(a)中制备的混合物中添加脱氧核糖核苷酸以制备源自重组逆转录病毒的双链DNA,以形成含有该双链DNA和源自逆转录病毒的蛋白成分的复合物,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性;并且
(c)收集步骤(b)中形成的复合物,其中此复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
10.制备复合物的方法,此方法包括:
(a)分离含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA;
(b)分离源自逆转录病毒的蛋白成分,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性;
(c)将在前面步骤中获得的双链DNA和源自逆转录病毒的蛋白成分混合以形成复合物;并
(d)收集前一步形成的复合物,其中此复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
11.权利要求10中的方法,其中源自逆转录病毒的蛋白成分是包装细胞的培养上清波和/或包装细胞的提取物。
12.一种将基因转移到细胞中的方法,此方法包括:
将一种复合物转移到细胞中,而此复合物包含含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA、以及源自逆转录病毒的蛋白成分,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,其中此复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
13.权利要求12中的方法,其中此复合物是通过权利要求7、9和10中任一项的方法获得的。
14.一种将基因转移到细胞中的方法,此方法包括:
将源自逆转录病毒的蛋白成分及含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA转移进细胞中,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,其中可形成的且包含蛋白成分和双链DNA的复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
15.权利要求14中的方法,其中源自逆转录病毒的蛋白成分是源自包装细胞的培养上清液。
16.用于将基因转移到细胞中的组合物,此组合物含有源自逆转录病毒的蛋白成分,其中该组合物含有一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,且不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
17.权利要求16中的组合物,其中源自逆转录病毒的蛋白成分与含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA形成复合物。
18.权利要求17中的组合物,其中此复合物可以通过权利要求7、9和10中任一项的方法获得。
19.权利要求16中的组合物,其进一步含有具有源自逆转录病毒的长末端重复的载体。
20.权利要求19中的组合物,其中的载体是用于制备重组逆转录病毒的载体。
21.权利要求19中的组合物,其中的载体是质粒载体。
22.权利要求16中的组合物,其中源自逆转录病毒的蛋白成分是源自包装细胞的培养上清液和/或包装细胞的提取物。
23.用于将基因转移至细胞内的试剂盒,其中含有用于将基因转移至细胞内的组合物,而此组合物含有源自逆转录病毒的蛋白成分,其中该组合物含有一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,且不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
24.用于将基因转移至细胞内的试剂盒,
它用于将基因转移至细胞内的方法中,
它以包装形式存在,并且
它含有说明,此说明指导将包含含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA及源自逆转录病毒的蛋白成分的复合物转移入细胞中,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,其中此复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
25.用于将基因转移至细胞内的试剂盒,
它用于将基因转移至细胞的复合物的方法中,
它以包装形式存在。并且
它含有说明,此说明指导将源自逆转录病毒的蛋白成分及含有源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA转移至细胞中,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,其中可形成的且包含蛋白成分和双链DNA的复合物不具感染性,因为其不含RNA基因组和逆转录病毒被膜,或因为其逆转录病毒RNA基因组和被膜缺乏感染能力。
26.用于将基因转移至细胞中的试剂产品,
它含有包装材料及包含在包装材料中、用于基因转移的试剂,
其中,用于基因转移的试剂含有一种复合物和/或制备此复合物的试剂,而此复合物含有包含源自逆转录病毒的长末端重复和具有逆转录病毒所缺乏的向细胞内转移所需的核苷酸序列的DNA的双链DNA、以及源自逆转录病毒的蛋白成分,此蛋白成分包括一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,并且
其中在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明此用于基因转移的试剂可用于基因转移,该基因转移不包括利用逆转录病毒来感染目的细胞这一步。
27.用于将基因转移至细胞中的试剂产品,
它含有包装材料和包含在包装材料中、用于基因转移的试剂产品,
其中用于基因转移的试剂含有源自逆转录病毒的蛋白成分,其中该组合物含有一种酶,此酶具有将一种含有源自逆转录病毒的长末端重复的DNA整合到染色体DNA中的活性,
其中在粘贴到包装材料上的标签或粘贴到包装材料上的说明中指明,此用于基因转移的试剂可用于基因转移,该基因转移不包括利用重组逆转录病毒来感染目的细胞这一步。
28.权利要求12或14中的方法,其中的基因被转移到真核细胞中。
29.权利要求12或14中的方法,其中的基因被转移到源自真核细胞的培养细胞中。
30.权利要求12或14中的方法,其中的基因被转移到真核生物个体中。
31.权利要求12或14中的方法,其中的基因被转移到脊椎动物受精卵中。
32.权利要求12或14的方法,其中的基因被转移到脊椎动物的生殖系中。
33.一种用于转导细胞的方法,此方法包括利用权利要求12或14中的方法将基因转移到细胞中。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP285857/2000 | 2000-09-20 | ||
JP2000285857 | 2000-09-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1447858A CN1447858A (zh) | 2003-10-08 |
CN1193095C true CN1193095C (zh) | 2005-03-16 |
Family
ID=18769861
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB018145493A Expired - Fee Related CN1193095C (zh) | 2000-09-20 | 2001-09-18 | 复合物 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20040214303A1 (zh) |
EP (1) | EP1319713B1 (zh) |
JP (1) | JPWO2002024916A1 (zh) |
KR (1) | KR100801873B1 (zh) |
CN (1) | CN1193095C (zh) |
AT (1) | ATE456660T1 (zh) |
AU (1) | AU2001286269A1 (zh) |
DE (1) | DE60141213D1 (zh) |
TW (1) | TWI316090B (zh) |
WO (1) | WO2002024916A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101006190B1 (ko) * | 2008-12-26 | 2011-01-07 | 주식회사 동양플랙스 | 레버형 사각바 조립클립 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69430646T2 (de) * | 1993-02-17 | 2003-01-02 | Wisconsin Alumni Res Found | Retroviren vom Typ "more-complex", die LTR von gemischtem Typ enthalten und deren Anwendungen |
US5652570A (en) * | 1994-05-19 | 1997-07-29 | Lepkofker; Robert | Individual location system |
CA2275892A1 (en) * | 1996-12-23 | 1998-07-02 | Gene-Cell, Inc. | Nucleic acid constructs and uses thereof for direct nucleic acid incorporation into cells |
AU4315000A (en) * | 1999-06-04 | 2000-12-28 | Nippon Institute For Biological Science | Novel plasmid vector |
-
2001
- 2001-09-18 WO PCT/JP2001/008090 patent/WO2002024916A1/ja active Application Filing
- 2001-09-18 CN CNB018145493A patent/CN1193095C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-09-18 US US10/332,704 patent/US20040214303A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-18 EP EP01965692A patent/EP1319713B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-18 AT AT01965692T patent/ATE456660T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-09-18 DE DE60141213T patent/DE60141213D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-18 JP JP2002529508A patent/JPWO2002024916A1/ja active Pending
- 2001-09-18 KR KR1020027014671A patent/KR100801873B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-09-18 AU AU2001286269A patent/AU2001286269A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-20 TW TW090123192A patent/TWI316090B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-05-14 US US11/748,003 patent/US20080206873A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002024916A1 (fr) | 2002-03-28 |
US20040214303A1 (en) | 2004-10-28 |
AU2001286269A1 (en) | 2002-04-02 |
EP1319713A4 (en) | 2005-08-03 |
TWI316090B (en) | 2009-10-21 |
JPWO2002024916A1 (ja) | 2004-01-29 |
CN1447858A (zh) | 2003-10-08 |
DE60141213D1 (de) | 2010-03-18 |
US20080206873A1 (en) | 2008-08-28 |
EP1319713A1 (en) | 2003-06-18 |
KR100801873B1 (ko) | 2008-02-11 |
KR20030032946A (ko) | 2003-04-26 |
ATE456660T1 (de) | 2010-02-15 |
EP1319713B1 (en) | 2010-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1254543C (zh) | 方法 | |
AU726386B2 (en) | Vectors and methods for tissue specific synthesis of protein in eggs of transgenic hens | |
CN1177046C (zh) | 增强的病毒介导的dna转移 | |
CN1531596A (zh) | 用病毒载体稳定转导细胞的方法 | |
CA3076270C (en) | Retroviral vectors | |
CN1283233A (zh) | 突变型loxP序列及其应用 | |
Mann et al. | Pseudotyped murine leukemia virus for schistosome transgenesis: approaches, methods and perspectives | |
CN1277636A (zh) | 不含有病毒编码序列的高效逆病毒载体 | |
CN1820072A (zh) | 转基因禽类中的蛋白质生产 | |
CN1134981A (zh) | 携带编码杀虫蛋白质融合基因的表达载体及其转基因植物 | |
US5969211A (en) | Pantropic retroviral vectors for gene transfer in mollusks | |
CN1193095C (zh) | 复合物 | |
Boulo et al. | Infection of cultured embryo cells of the pacific oyster, Crassostrea gigas, by pantropic retroviral vectors | |
CN1388829A (zh) | 含有携带剪接受体的基因工程细胞非编码序列的高效逆转录病毒载体 | |
CN1289370A (zh) | 将基因转移进生殖细胞的方法 | |
CN105274089B (zh) | 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法 | |
CN1686566A (zh) | Cark基因在制备治疗心肌肥厚药物中的应用及一种抑制心肌肥厚的药物 | |
Alrefaei et al. | Progress with schistosome transgenesis | |
CN1908011A (zh) | 一种植物抗逆锌指蛋白及其编码基因与应用 | |
CN101031651A (zh) | 用于产生反转录病毒载体的细胞 | |
CA2351553C (en) | Transgenic animals | |
CN1170943C (zh) | 建立载脂蛋白a-i细胞靶标筛药系统及筛选升高密度脂蛋白药的方法 | |
CN1234871C (zh) | 一种解毒酶基因在家蚕中稳定表达系统的构建方法 | |
CN1845998A (zh) | 通过慢病毒载体构建转基因鸟类的方法以及由此方法得到的转基因鸟类 | |
CN100336904C (zh) | 一种来自水稻的病原和化学诱导型启动子及用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050316 Termination date: 20100918 |