CN119241663B - 一种抗酶解的抗菌肽frl及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗酶解的抗菌肽FRL及其制备方法和应用，属于生物工程领域，该抗菌肽FRL的序列如SEQ ID No.1所示。该抗菌肽FRL表现出窄谱抑菌作用，可以有效抑制革兰氏阴性细菌，具有在治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中应用的潜力。该抗菌肽具有很低的溶血活性和真核细胞毒性。该抗菌肽在128μmol/L浓度下未能引起10％的红细胞溶血以及小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率达到80％以上。该抗菌肽在pH＝5、37℃条件下对胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K(0.4mg/mL；0.5h)表现出较好的稳定性。综上所述，抗菌肽FRL具有成为抗生素替代物的发展潜力。

Description

一种抗酶解的抗菌肽FRL及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种抗酶解的抗菌肽FRL及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是一种广泛存在于生物体内的具有抗菌作用的活性多肽，属于生物非特异性免疫防御的应答产物。抗菌肽具有广谱的抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。抗菌肽杀菌的主要机制为通过物理渗透作用破坏细菌细胞膜；而细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构；因此，抗菌肽成为有吸引力的解决病原微生物耐药性的候选方案。目前，抗菌肽已成为药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。
虽然，已经从各种动植物体中提取出来上千种抗菌肽，但可作为抗生素替代品用于医疗领域的抗菌肽却很少。限制天然抗菌肽成为抗生素替代物的主要原因有两个：一是天然抗菌肽对于红细胞的溶血作用；二是天然抗菌肽在体内的低稳定性。因此，寻找一种开发稳定又安全抗菌肽的方法势在必行。
发明内容
基于以上需求，本发明公开一种抗酶解的抗菌肽FRL，该抗菌肽在胃肠道中具有较高的稳定性，同时具有很低的溶血活性。
本发明所采用的技术方案如下：一种抗酶解的抗菌肽FRL的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解的抗菌肽FRL的制备方法，如下：以柔性序列Resilin作为模板，通过将亲疏水交替抗菌片段两者相连接，抗菌片段的序列为：FFRLFFRLRRR，设计出的多肽序列如SEQ ID No.1所示；采用固相化学合成法得到多肽，再经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成所述的多肽的制备；然后对所述的多肽进行抗菌活性的检测、溶血活性的检测和蛋白酶稳定性检测，最后命名为抗菌肽FRL。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种抗酶解的抗菌肽FRL在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
进一步的如上所述的应用，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
本发明的另一目的是提供一种适用于治疗和/或预防革兰氏阴性菌感染的药物，所述药物含有如上所述的一种抗酶解的抗菌肽FRL。
本发明的优点及有益效果：本发明的抗菌肽FRL对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等革兰氏阴性菌种有高效的抑制作用，但对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的抑制作用较弱；具有窄谱抗菌作用。而且具有很低的溶血活性(最低溶血浓度>128mM)。吸光度检测发现，抗菌肽FRL在pH＝5时，表现出温度响应特征；随温度升高具有聚集的趋势，说明其具有稳定通过胃肠道前段的特性。在口服情况下，具有有效保留抗菌活性至胃肠道末端的潜力。综上所述，抗菌肽FRL是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为本发明的抗菌肽FRL的高效液相色谱图。
图2为本发明的抗菌肽FRL的高效液相质谱图。
图3为本发明的抗菌肽FRL与蜂毒素ME的溶血活性对比图。
图4为本发明的抗菌肽FRL蜂毒素ME对小鼠巨噬细胞的细胞毒性影响对比图。
图5为本发明的抗菌肽FRL在不同环境下OD350nm吸光度。
图6为本发明抗菌肽FRL与不同蛋白酶孵育0.5小时后的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合说明书附图举例对本发明作进一步详细的说明，下列实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
抗菌肽的设计
抗菌肽FRL的氨基酸序列为：
GGRPSDSWGAPGGGNFFRLFFRLRRR；
以柔性序列Resilin作为模板，设计刺激响应抗菌肽，命名为FRL。抗菌肽的序列如表1所示。
表1氨基酸序列
其分子式如式(I)所示：
抗菌肽FRL的电荷数为为+5，通过将亲疏水交替抗菌片段与源自Resilin的序列模块连接，使其具有Resilin高生物相容性、低免疫原性、刺激相应的特征。
实施例2
固相化学合成法合成抗菌肽FRL
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：
抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(OD492nm)处测定光吸收值，,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。
表2抗菌肽FRL的抑菌活性
通过表2可以看出，抗菌肽FRL对于革兰氏阴性菌表现出较高的抑菌活性。
表3短肽的MHC(μM)、GM(μM)和SI值
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％ Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见图3。通过图3可以看出，抗菌肽FRL在检测范围内未表现出溶血活性，于对照组蜂毒素呈显著性差异。
真核细胞毒性的测定：采用MTT，并通过小鼠巨噬细胞RAW264.7进行细胞毒性检测。
(1)培养基的制备及细胞的培养：将DMEM(培养基)与胎牛血清9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的小鼠巨噬细胞RAW264.7，以细胞长满瓶底80％-90％为宜。
(2)待用细胞的试验处理：无菌PBS清洗并重悬细胞3次，并用0.25％胰蛋白酶液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入终浓度约为2×104的50μL细胞悬液。
(3)抗菌肽处理：另附96孔板第一孔内加10μL抗菌肽并倍比稀释后，取出50μL肽液加入原96孔板1-10孔，11孔加50μL完全培养基，12孔加100μL完全培养基。恒温培养4h；
(4)毒性检测：取50μL 5mg/mL MTT溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加150μLDMSO(二甲基亚砜)，酶标仪OD570nm测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然。检测结果见图4。
通过图4可以看出，抗菌肽FRL在检测范围内未表现出对小鼠巨噬细胞的毒性，于对照组蜂毒素呈显著性差异。
实施例4：
抗菌肽FRL的环境响应特征通过检测OD350nm下的吸光度来测定。将抗菌肽FRL溶于去离子水得到终浓度为64μM的肽溶液。用NaOH和HCl配置pH＝9和pH＝5的溶液。将pH＝9、pH＝5、去离子水与等体积的64μM肽溶液混合，得到终浓度为32μM的pH＝9、pH＝7、pH＝5的抗菌肽FRL溶液。在透明96孔板中，加入上述溶液，每种溶液三个平行，每个平行100μL，读取不同温度下的吸光度。每个温度下读取三次；读取方式为由最低温度起依次升高，降低，再升高。检测结果见图5。
通过图5可以看出，在pH＝5时，抗菌肽FRL表现出温度响应的特征，随着温度升高展现出聚集的趋势。该特征使抗菌肽FRL具有胃肠道中稳定抗菌的潜力。
多肽在胃肠道中的稳定性，通过检测pH＝5环境下，多肽对于存在于胃肠道的蛋白酶的稳定性来测定。按上文所述，配置pH＝5的0.2mg/mL肽溶液，与0.8mg/mL的蛋白酶溶液等体积混合，37℃孵育0.5小时。高效液相色谱检测多蛋白酶对多肽的降解。高效液相色谱参数与实施例2(图1)相同。检测结果见图6。
通过图6可以看出，在pH＝5时，抗菌肽FRL在0.4mg/mL的糜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶存在的环境下，37℃孵育0.5小时后，结构依然相对完整，说明具有良好的稳定性。
由于人胃的pH为1.5-3.5、十二指肠pH为6、空肠到结肠的pH为6.8-9左右。单胃动物，如猪的胃pH为3-5、由十二指肠到结肠的pH由6增加到7-8。对肽活性影响较大的蛋白酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶多分泌在胃肠道前端(pH较低段)。因此，抗菌肽FRL在低pH条件下具有聚集趋势，说明其具有稳定通过胃肠道前段的特性。在口服情况下，具有有效保留抗菌活性至胃肠道末端的潜力。综上所述，抗菌肽FRL是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

Claims (4)

1.一种抗酶解的抗菌肽FRL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗酶解的抗菌肽FRL的制备方法，其特征在于，方法如下：以柔性序列Resilin作为模板，通过将亲疏水交替抗菌片段两者相连接，抗菌片段的序列为：FFRLFFRLRRR，设计出的多肽序列如SEQ ID No.1所示；采用固相化学合成法得到多肽，再经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成所述的多肽的制备；然后对所述的多肽进行抗菌活性的检测、溶血活性的检测和蛋白酶稳定性检测，最后命名为抗菌肽FRL。
3.根据权利要求1所述的一种抗酶解的抗菌肽FRL在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用，所述的革兰氏阴性菌为大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
4.一种适用于治疗和/或预防革兰氏阴性菌感染的药物，其特征在于，所述药物含有如权利要求1所述的一种抗酶解的抗菌肽FRL。
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