CN1188593A - 培养容器及使用其生产马铃薯微型薯等植物材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种盒式培养容器及使用该容器生产马铃薯微型薯等植物材料的方法。使用该容器可实现多种液体培养方式、均匀接种和非无菌环境下原位换液,用于组织培养大量生产具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的植物材料。在该容器中接种马铃薯脱毒试管苗的小茎段,采用浅层接触培养方式,在间歇强制通气的光照条件下生产出小苗,非无菌环境下更换培养液,在间歇强制通气的黑暗条件下生长出小薯。此方法适用微薯的大规模工厂化生产。

Description

培养容器及使用其生产马铃薯微型薯等植物材料的方法
本发明涉及一种盒式培养容器及使用其生产马铃薯微型薯等植物材料的方法，尤其是生产马铃薯微型薯方面的应用。
应用植物组织培养技术培养具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的材料(如生产马铃薯微型薯)所使用的培养容器一般有：三角瓶、广口瓶、罐头瓶、培养皿等普通玻璃或塑料容器，浸没式、喷雾式等生物反应器。对于这些容器、装置的基本要求是具有可灭菌性、隔菌密闭性、接种防污染性和气体可交换性，根据具体培养要求还需具有透光、可实现较低的相对湿度、坚固、易于清洗、便于使用等性能。例如马铃薯脱毒苗和微型种薯(微型块茎)是具有器官形态的植物材料，在组织培养过程中对相对湿度要求较严格，在高湿度下容易玻璃化而不结微薯。
目前广泛使用的三角瓶(图1)、广口瓶(图2)、罐头瓶(图3)、培养皿(图4)等普通容器在覆盖或包裹组织培养封口膜后即可基本满足植物组织培养的要求，它们具有价格低廉，可方便地使用手术刀、镊子等简单工具进行手工操作，培养过程在培养间中进行而不需要再附加昂贵的辅助设备等优点，而且这类容器可以容易地实现较低的相对湿度，适合实验室小规模培养芽、茎、根以及小苗等具有器官形态的植物材料。但这些容器的容积小、手工清洗、装配、灭菌、接种、换液、搬运、摆放等操作耗时多，如用于上述植物材料的大规模工厂化生产，不仅需要大量的容器，其清洗、装配、灭菌、接种、换液、搬运、摆放等操作的效率低，消耗大量劳动力，而且由于单个容器占用培养空间大、培养材料与培养基之比小，培养过程中消耗大量原材料和能源，所以生产成本高、产量小。扩大培养容器容量是提高组织培养生产规模、降低生产成本的有效途径。然而，由于上述这些容器缺乏必要的结构，其容积不能过大，通常不大于0.5升，如容积过大就会因开口面积过大，在接种大量材料时因接种操作时间长而难以控制杂菌的污染；另一方面，如在扩大容量的同时限制其开口的面积，会降低大量材料手工接种的速度，以至延长操作时间，增加污染几率，而且开口面积小造成接种操作困难，难以保证大量接种材料在大容器中均匀分散的要求，影响材料在容器中生长的个体一致性，降低生产效率。因此，采用现有结构的普通培养容器难以实现大规模生产具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的植物材料。
目前适用于培养具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的植物材料的生物反应器较少，主要有液体浸没式和喷雾式，它们可以制成较大的容积，但这些生物反应器结构复杂，对其制造所用原材料和制造工艺要求高，反应器材质多为不锈钢及特种玻璃，此外还需要附加复杂的灭菌、通气、液体循环、光照等设备和温度、pH、CO2/O2、相对湿度、气体液体流量等的测定和控制设备，制造成本高。这些生物反应器在使用中存在笨重不易移动、容易损坏、接种不便的不足，用它们培养具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的植物材料容易发生玻璃化等不正常生长现象，降低所生产的植物材料的质量和产量。
文献“System for micropropagation by nutrient mist supply”，(AmericanSociety of Agricultural Engineers，1991，34(2)：621-624页)，公开了一种可用于培养马铃薯茎段及小苗的喷雾式生物反应器，其结构如图5所示。该生物反应器是由一个顶部具有进气口(4)和出气口(3)、底部具有超声波换能器(8)、内部一定高度处具有培养材料支盛物(5)的密闭的罐体(1)，外套一个开放的盛有水(6)的槽(2)组成的培养容器，和大功率高频电子振荡器(9)组成的培养装置。培养液(7)位于培养容器底部浸没超声波换能器但不接触培养材料，由振荡器产生的高频电流驱动换能器发出的超声波，将培养液雾化喷出液面，充满培养容器的整个内部空间，使培养材料接触到培养液的雾滴而获得营养。该装置需要附加气泵(12)、储气罐(13)等强制通气设备，水温控制设备(10、11)以及光照设备(14)，并可以通过计算机(15、16)进行控制。该培养装置的特点是采用营养雾均匀地供给植物组织养分使其同步生长，可以通过间歇喷雾和强制通气降低培养环境的相对湿度减轻材料的玻璃化现象。该装置的不足是培养容器由罐体和水浴槽构成，结构复杂，制造所用原材料和制造工艺要求高，需要附加强制通气设备和温度测定和控制设备，所以制造成本高。这种生物反应器较笨重不易移动，超声波换能器容易损坏。由于采用营养雾方式，容器内的相对湿度大，培养材料表面全部附着培养液，即使采用各种方法降低容器内的相对湿度，培养材料表面的实际湿度仍很高，所以在培养一些不宜在较高湿度下生长的植物材料时，容易发生玻璃化等不正常生长现象，降低生产的植物材料的质量和产量。
文献“Stimulation of potato(Solanum tuberosum L.)tuberization bysemicontinuous liquid surface level control”，(Plant Cell Reports，1994，13：184-187页)，公开了一种可用于培养马铃薯小苗并诱导结薯的浸没式生物反应器，其结构如图6所示。该生物反应器是一个盖上具有进气管(3)、出气口(2)和进液口(4)、出液管(5)的密闭罐体(1)。(4)和(5)分别通过输液泵(8、7)连接至同一个储液罐(11)中，进气管(3)通到培养罐底部与气泡发生器(6)相接。培养过程中由控制器(9、10)控制周期性地向培养罐内输液升高液面浸没培养材料，排出液体降低液面不浸泡材料，实现间歇浸没式培养方式。在培养马铃薯时，采用MS+30克/升蔗糖的培养基和25℃、光照强度2.5瓦/米2、每6小时浸没1小时的条件培养4周，可以繁殖大量小苗；将储液罐中的培养基更换为MS+90克/升蔗糖，在25℃、光照强度0.9瓦/米2的暗光条件下培养6周，可以结出小薯。该培养装置的特点是采用液面控制方法实现间歇浸没式培养，既可以达到浸没式培养的供养效果，又在一定程度上减轻了由于液体浸没对具有器官形态的植物材料的不良影响。该方法典型实施的规模为10升培养罐，每10周可生产500-960个微薯，其中70％大于0.2克。该装置的不足是虽然采用间歇浸没式培养，在一定程度上减轻了液体浸没的不良影响，但是容器内的相对湿度仍然大，培养材料表面全部附着培养液，即使采用各种方法降低容器内的相对湿度，培养材料表面的实际湿度仍很高，在培养一些不宜在较高湿度下生长的植物材料(如马铃薯)时，也容易发生玻璃化等不正常生长现象，降低所生产的植物材料的质量和产量。该方法对培养基的消耗大，结薯周期长，单位容积的微薯产量小，微薯体积小，不宜进行大规模生产。
马铃薯脱毒苗和微型种薯(微型块茎)是具有器官形态的植物材料，在组织培养过程中对相对湿度要求较严格，在高湿度下容易玻璃化而不结微薯。目前，用于生产马铃薯脱毒微型种薯的方法主要是两类，一类是通过组织培养获得脱毒无菌苗，采用三角瓶、广口瓶、罐头瓶、培养皿等组织培养常规容器和手工操作方法，在光照培养条件下繁殖小苗，然后在黑暗条件下诱导结薯。这类方法的特点是能确保已脱毒的马铃薯在生产微薯过程中不会接触带有病毒的蚜虫等昆虫而重新感染病毒，但操作繁琐，生产规模小，成本高。另一类方法是通过组织培养获得脱毒无菌苗后，切取含腋芽茎段移栽到蛭石等人工基质上，在半人工控制环境条件的隔虫网室中生长成苗，再不断地切取小苗的含腋芽茎段进行扦插繁殖小苗，通过控制温、光、水、肥等条件诱导小苗结薯。这类方法的特点是成本较低，但劳动力消耗大，易受地区、气候和季节的影响，难以实现大规模工厂化生产。
中国专利申请(申请号90101337.4，公开号CN1045906A)“大量生产人工种用马铃薯(马铃薯微型块茎)的方法”在25℃、16小时/天光照培养条件下用一种培养基培养含腋芽茎段不断继代繁殖小苗。培养基成分为：改良MS1+0.1毫克/升赤霉素+0.1毫克/升核苷玉米素+50毫克/升维生素C+20克/升蔗糖+10克/升琼脂。继代培养约20天后，将小苗置于30℃光照条件培养约1周，再转为10℃黑暗条件培养约1周，更换另一种成分为改良MS2+100毫克/升矮壮素+0.1毫克/升核苷玉米素+90克/升蔗糖+10克/升琼脂的培养基，并在温度25℃左右、500勒克斯光照强度、光周期6小时/天的条件下培养40-50天即可获得微薯。在这一方法中所使用的培养容器是高度小于3厘米的圆形培养皿，典型尺寸为直径10厘米、高1.5厘米。它可以使继代繁殖的小苗自动向水平方向生长，促进侧枝数量的增加，显著提高繁殖系数。该方法典型实施的微薯产量平均为10个/培养容器，微薯直径0.5厘米左右。此方法的不足之处是培养容器容积过小，手工操作繁琐、效率低，劳动力消耗大，且结薯周期长，微薯体积小，不能实现大规模工厂化生产。
中国专利申请(申请号94112881.4，公开号CN1109706A)，“生产马铃薯微薯块茎的方法”。采用直径13-15厘米、高18-22厘米(2-4升)、从底部强制通气的玻璃容器，接种含腋芽茎段10-12段/升·容积，在18-25℃、光照强度4000-6000勒克斯、光周期12-24小时/天、通气速度0.2-0.4升/分钟的条件下，用含有低蔗糖的液体培养基(成分：MS+20克/升蔗糖，pH5.8)培养20-40天，小苗可长高到容器高的一半以上。此时更换高含糖(成分：MS+80克/升蔗糖，pH5.8)的培养液，在前述的光照条件下培养1-2周，再变为黑暗条件培养5周左右即可收获微薯。该方法典型实施的微薯产量为33.5个/升·容积(鲜重0.5克以上的微薯)。此方法的不足之处是培养容器容积较小且结构不够合理，培养密度小不能充分利用培养容器的内空间，大量的手工操作繁琐、效率低，大规模工厂化生产成本高。
中国专利申请号90106636.2(公开号CN1048141A)和中国专利申请号93100096.3(公开号CN1089076A)是同一发明人的两项专利申请，后者是前者的改进。该方法是将组织培养快速繁殖出的马铃薯试管苗切成含腋芽茎段，用含有0.1-5ppm GA3+10-100ppm ABT1溶液浸泡5-30分钟，在相对湿度100％、温度26℃的黑暗条件下生根，再移栽到蛭石盘中，置于昼温26℃、夜温15℃、相对湿度90-100％的塑料棚内7-10天，此后逐渐降低湿度至60-70％。含腋芽茎段扦插30天后长成再生苗，切取再生苗的含腋芽茎段重新扦插繁殖，如此反复扦插繁殖直至小苗达到一定的群体数量，通过用一定成分的营养液浇灌小苗并控制温光水肥条件，诱导小苗结薯。在自然光照和前述的温湿度条件下，从扦插含腋芽茎段到结薯收获需30-40天。该方法典型实施的微薯产量为5000-9000个/米2蛭石盘·年。此方法的不足之处是需要较大面积的、可控制环境条件的、严密阻止蚜虫等昆虫进入的网室，即使这样仍要有组织培养的设备和步骤，并且难以完全杜绝可传播病毒的蚜虫等昆虫进入大型网室，因而难以消除已脱毒的马铃薯苗重新感染病毒的可能性，影响微型薯的质量，同时还会因控制环境条件成本高而难以实现周年生产，加之手工扦插工作量大，不易进行大规模工厂化生产。
针对已有技术的不足，本发明的目的是提供一种盒式培养容器，该容器可以实现多种液体培养方式，且结构简单，操作方便，性能优良，可用于组织培养大量生产各种具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的植物材料，实现上述植物材料的大规模工厂化生产。
本发明的另一目的是提供一种使用上述盒式培养容器培养植物材料的方法，尤其是生产马铃薯微型薯的方法，该方法省土地、高效率、高质量、低成本、可周年大规模生产脱毒微型种薯等植物材料。
本发明所提供的一种盒式培养容器具有一个接种口、至少一个换液和/或进气口及至少一个出液口，由盒盖与盒身紧密结合构成。
所述盒盖与所述盒身的密闭结合可以通过结合面磨口、结合面间夹密封材料、螺钉或手柄螺钉固定的方法实现。
所述盒盖与所述盒身所封闭的内部空间即培养空间，高度为所培养的植物材料适宜生长的高度。根据具体需要可将培养容器横断面或纵断面制作成方形(长方形)、圆形(椭圆形)、梯形、多边形或其他不规则形状。
图7、8是本发明提供的盒式培养容器的一种具体实施结构示意图。以下内容所引用的标号，只是为说明方便，并不是将本发明限制于具体实施例。
方形横断面的容器尺寸可以为边长15-100厘米，圆形容器可以为直径15-100厘米，容积可为2-200升。
所述接种口(2)的面积可以为培养容器横断面积的1/5-100。所述容器的高度视所培养的植物材料的类型与所期望生长的高度而定。容器容积的增加是通过扩大容器横断面的面积来实现的。
所述接种口(2)可以覆盖各种类型常规的组织培养封口膜，起到对外隔菌、对内气体交换的作用。
所述接种口(2)基部可以有外径较大的气密磨口(4)和螺纹(3)，能够在必要时扣上气密盖(5)暂时密封接种口。
所述容器至少有1个换液口或进气口(6或8)和至少1个出液口(18)，也可以有多个类似结构的连通容器内外的开口。
换液口或进气口(6或8)及其它类似结构的开口可以安装微孔滤膜(10)，滤膜的微孔径小于环境中微生物的大小，可以＜0.65微米。微孔滤膜的直径视容器容积大小可以取10-100毫米。
换液口或进气口(6或8)及其它类似的开口可以与阀门(7、9等)相连以便控制其开闭。
进气口(8)可以位于培养容器相对于接种口(2)的另一侧，以获得良好的通气、换气效果。
出液口可以制成虹吸管形式与容器外连通。
所述容器中可以设置培养筛板(17)，用于支盛所培养的植物材料，处于距离容器底面适宜的高度上，其高度视培养方式而定。
培养筛板(17)可以是网筛状，或是有大量小孔贯穿两面的板，它距离容器底面的高度可以是0.5-4厘米。
培养筛板可以是固定在容器底面上方一定的高度处，也可以随培养容器中的培养液液面高度的升降而上下浮动。实现培养筛板上下浮动的方法可以是培养筛板采用密度低于水的材料、或在筛板上设置浮漂，使载有培养材料的筛板能够漂浮在培养液的表面。也可以采用其它常规方法。
所述容器中可以设置网眼状支撑网(21)，该网位于容器内植物接种材料上方，其网眼有足够空间让生长的植物材料通过，且网眼的周边可支撑培养的植物材料，使其直立生长、防止倒伏。
支撑网(21)可以水平固定、悬挂、支撑在容器内，于容器顶部与培养筛板之间可通过外力作用使该网上下任意移动。
支撑网(21)内部可以有软磁性材料(14)，以便借磁力移动支撑网；也可以在四角安装软连接(12)与盒盖(1)下面相连，通过调节软连接调整支撑网高度。
支撑网(21)网格间隙或孔径大于培养筛板的网格间隙或孔径，具体尺寸取决于所培养的植物材料的形状及大小。
支撑网(21)上可以有与接种口(2)近似大小的粗网口区域(22)，这部分的网格间隙或孔径大于(21)的其它部位，可以供接种时植物材料穿过支撑网。
所述容器包含的所有部件都可以由金属、玻璃、塑料等材料制成。
盒盖(1)和盒身(15)及换液口(6)、进气口(8)、虹吸管(16)、出液口(18)、培养筛板(17)、支撑网(21)和支脚(20)以及换液阀门(7)、进气阀门(9)、出液阀门(19)等部件，可以用耐高温或耐辐照塑料注塑而成。
盒盖(1)和盒身(15)可以分别与换液口(6)、进气口(8)、虹吸管(16)、出液口(18)、培养筛板(17)、支脚(20)以及阀门(7)、进气阀门(9)、出液阀门(19)等部件中的任一个乃至全部制成一体。
本发明提供的培养容器可应用于如下的培养方式中：
由于本发明所提供的盒式培养容器可以具有密闭、通气、排液、进液和支盛筛板等结构，所以可以提供的培养方式有：连续浸没式培养、间歇浸没式培养、浅层培养、浅层接触式培养、非接触式培养等，并可以在培养过程中灵活变换培养方式，适合不同植物种类、不同形态器官的组织的生长分化和连续继代培养。
使用本发明提供的培养容器培养具有芽、茎、根及小苗等器官形态的植物材料的方法，包括以下步骤：
(1)按常规方法消毒所述容器，
(2)将植物接种材料从所述接种口放入容器中，通过振荡或者加无菌水或常规培养基等液体介质后搅拌使接种材料均匀分布于培养容器中；也可以在加入所述液体介质之后再加入接种材料；
(3)从出液口排出无菌水再加入常规培养基或排出多余常规培养基调节培养基液面，使培养基的高度符合常规的连续浸没式培养方式、间歇浸没式培养方式、浅层培养方式、浅层接触式培养方式或非接触式培养方式的要求，按常规方法和条件培养植物材料，其中培养基的更换和液面的调节通过从出液口排出液体和换液口输入液体的方式进行；植物材料在培养过程中自始至终可以在同一容器中。
所述培养方式详述如下：
连续浸没式培养：接种的植物材料的各个部分始终浸没在液体中，在培养过程中不进行液面高度变化的操作。
间歇浸没式培养：在培养过程中周期性地进行培养液液面高度变化的操作，使培养材料在一段时间内因液面升高而浸没在液体中，在另一段时间内因液面降低而不被液体浸没或不接触液面。
浅层培养：接种的植物材料浸泡在薄层液体中，在培养过程中不进行液面高度变化的操作。随着材料的不断生长，材料的一些部分长出液面而不再被液体浸泡。
浅层接触式培养：植物材料接种在培养筛板等支盛物上，并与薄层培养液相接触而不被浸泡。在培养过程中不进行液面高度变化的操作。随着材料的不断生长，材料的一些部分向上生长而不再与液体接触。
非接触式培养：植物材料接种在培养筛板等支盛物上但并不与培养液相接触，培养一段时间后植物材料上长出根等器官与培养液相接触。
本发明提供的培养容器可以按以下方法装配：
用组织培养封口膜封闭接种口(2)，在进气口(8)、换液口(6)及其类似的连通容器内外的开口处，安上微孔滤膜(10)，微孔径＜0.65微米。
容积10升以下的培养容器可以采用直径25-50毫米的滤膜，容积大于10升可以采用大于50毫米的滤膜。
旋紧手柄螺钉(11)使盒盖(1)与盒身(15)密闭连接；关闭阀门(7)、(9)、(19)等所有类似开口的阀门。
支撑网(21)可以水平放置于盒中或悬挂、固定在其它部件上，但其粗网口区域(22)位置必须与接种口(2)一致。
本发明提供的培养容器可以按以下方法灭菌：
装配好的培养容器可以用辐照灭菌、高温蒸汽灭菌、药剂浸泡或熏蒸等常规方法灭菌。
原料为耐辐照的塑料、玻璃或金属的培养容器灭菌，可以用剂量为2-5×104戈瑞的γ-射线。
原料为耐高温的塑料、玻璃或金属的培养容器灭菌，可以用0.9-1.2大气压蒸汽灭菌15-25分钟。
本发明提供的培养容器可按以下方法接种：
接种可以在超净工作台中进行，接种时接种口必须在无菌环境下，培养容器的其他部分可以暴露在非无菌环境下。
培养容器内的支撑网可以水平固定于盒中某一高度，在接种操作过程的前后，其位置不改变。
支撑网也可以在接种操作过程前后处于不同的位置。其方法可以是在接种前将支撑网固定在盒中接近顶部的高度处，在接种操作完成后将支撑网移动至另一高度处。
接种前固定支撑网的方法可以用磁场力从培养容器外吸住支撑网，在接种完成时将磁场力消除，使支撑网(21)落在指定的高度上。磁场力可以由永磁体、电磁体(13)等产生。
揭开接种口(2)的封口膜，将切成一定大小和形状的芽、茎、根以及小苗等具有器官形态的植物材料从接种口(2)放入盒中，通过振动或加液体介质后搅拌完成植物材料在培养容器内的均匀分布。
为使植物材料在培养容器内分布均匀，可以向盒中加无菌水或液体培养基等液体介质至适宜高度，摇动、振动培养容器或搅拌液体介质使小茎段均匀分布在液体介质中，通过排液而降低盒内液面高度使接种的材料均匀分布于培养筛板或盒底上。
排除培养容器内液体的方法可以是向培养容器内压气造成内高外低的气压差，使液体从出液口流出。排除培养容器液体的过程中可以用气密盖(5)密封接种口(2)。
排除培养容器液体的方法可以是打开出液阀门(19)和接种口(2)，使盒内液体从出液口(18)自行流出。
接种过程中为使材料均匀分布于培养筛板或盒底上而加入的液体搅拌介质，可以是液体培养基或无菌水等。采用液体培养基为搅拌介质，可在排液时将液体培养基液面降至指定高度即可；采用无菌水等为搅拌介质，可在排液时可将其排尽，然后加入液体培养基至适宜高度。
向培养容器加入的液体介质，可以不经灭菌而从换液口(6)通入，完毕时可通入少量水冲洗进液通道。
本发明提供培养容器的摆放和培养环境的控制：
接种植物材料后的培养容器可以放在可提供各种培养条件的培养箱中、培养室内、培养架上及各种摇床上进行培养。摆放方法可以单个，也可以通过支脚(20)两两或多个摞放，然后分层整齐摆放在上述培养设备上。
a.光照控制：
该培养容器可以是全透明、半透明、不透明的，也可以是不同部分具有不同透光性的。该培养容器可以安装光照设备，也可以不具备发光装置，所以培养容器在培养过程中所需的光照条件，可以由盒内或盒外光源控制。
通过控制光源的种类、亮度、入射角度和开启关闭时间，即可方便地控制光照强度、光周期、光质以及光照方向和散射光等植物组织培养所需的各种光照参数。
b.气体交换和相对湿度控制：
该培养容器在培养植物组织的过程中，可以通过隔菌且透气的膜自动进行盒内外的气体交换而不需附加任何强制通气设备；也可以不通过膜进行气体交换而完全通过强制通气的方法进行气体交换；也可以同时或交替采用上述两种方式，从而保证植物组织培养所需的CO2/O2、相对湿度等气相条件。
所述的隔菌且透气的膜可以是微孔滤膜，也可以是组织培养封口膜。这些膜可以安置在培养容器的接种口、进气口、换液口和其他连通盒内外的开口处。采用这种透气膜控制的培养容器内CO2/O2、相对湿度等气相条件，其参数由膜的性质如对CO2、O2、水蒸气的通透性、亲和性等按常规方法决定。
所述的强制通气方法可以是向盒内连续或间歇通入气体，所通气体可以是空气、CO2、O2、水蒸气或以上多种气体的混合气体。
如连续通气，则培养容器内的气相条件参数取决于所通气体的CO2/O2、相对湿度等参数；如采用膜进行气体交换并间歇通气，则培养容器内的气相条件参数由膜的性质及通入气体的CO2/O2、相对湿度、通气量等参数共同决定。
为了提供植物材料正常生长所需的气相条件，可以在强制通气时，人为提高所通气体的CO2/O2促进植物材料的光合作用；降低CO2/O2促进植物材料的呼吸作用；提高相对湿度促进植物材料的快速生长；降低相对湿度控制植物材料的玻璃化。
c.温度控制：
为了提供植物材料正常生长所需的温度条件，可以通过调节盒外环境温度、盒体的温度、通入气体温度和通入液体温度等多种途径控制该培养容器内环境的温度。
调节盒外环境温度可以通过在培养间内安装空调等控温设备来实现。
调节盒体的温度可以通过在盒体上或与盒体接触的装置上安置加温、降温设备来实现。
调节通入气体温度可以通过在强制供气通路(如储气装置、管道等)上安装控温设备来实现。
调节通入液体温度可以通过在供液通路(如储液装置、管道等)上安装控温设备来实现。
本发明提供的培养容器中培养液的液面控制及更换可按以下方法进行：
该培养容器在培养植物材料过程中可以变化培养液的液面高度或更换培养容器内的培养液，这些操作可以在无菌环境下或在培养间等非无菌环境下进行。
改变培养容器内培养液的液面高度，可以从换液口(6)通入培养液使液面提高，也可以向培养容器内压气造成内高外低的外气压差，使培养液从出液口流出而降低液面高度。
在无菌环境下更换盒内培养液，可以揭开封口膜，从出液口(18)吸液，旧培养液通过虹吸管(16)自动流尽，从接种口(2)或换液口加入新培养液。
在非无菌环境下换液，可以向培养容器内压气造成内高外低的气压差，使培养液从出液口流出而排尽，再从换液口(6)通入未灭菌的新培养液。
本发明所提供的生产马铃薯微型薯的方法包括以下步骤：
(1)准备好灭菌处理后的本发明提供的培养容器。
(2)用组织培养技术得到马铃薯无病毒试管苗，把试管苗切成含顶芽或腋芽的小茎段，将切好的试管苗小茎段从接种口(2)倒入所述培养容器中，向容器中加无菌水或常规培养基至浸没所述小茎段的高度，摇动培养容器使小茎段均匀分布在上述液体中；
(3)从出液口排出水，从换液口加入常规繁苗培养基，或从出液口排出多余的培养基，至适宜高度，其高度视培养方式而定，按常规方法培养繁殖小苗；
(4)小苗长至5厘米以上时，从出液口排出旧培养基液，从换液口加入新的常规诱导微薯培养基液，按常规方法培养，至微型薯长至可收获。
用培养容器培养马铃薯的培养方式可以采用前述的间歇浸没式培养、浅层培养、浅层接触式培养或非接触式培养，在接种时可以按照前述的相应方法的采用相应的培养液高度。
采用本发明提供的培养容器浅层接触式培养方式，培养马铃薯小苗和诱导微薯效果最好。
马铃薯小茎段的接种量可以是0.3-1.5段/厘米2·底面积。
加入无菌水的高度可以是盒高的0.2-0.9倍，也可以是2-12厘米。
为排出无菌水可以向培养容器内通气，其通气的速度可以是0.2-4升/分钟。
接种完成时支撑网所处的位置可以在盒底上方0.3-0.7倍盒高处，也可以距离盒底或培养筛板2-12厘米高处。
加入繁殖小苗的液体培养基可以从换液口(6)通入而不必灭菌。加入速度可以是0.5-5升/分钟，
繁苗培养基的成分可以为MS+2％白糖，pH5.8。
根据所采用的培养方式，加入液体培养基的高度可以至培养筛板(17)高度处，也可以至盒底0.5-5厘米高度处。
从换液口加入培养液后可以再通入50-200毫升水冲洗进液通道。
在第(3)光照培养繁殖小苗的过程中，可采用以下条件：
接种后的培养容器可以两两摞放后分层整齐摆放在培养架上，在周期8-14小时/天、1000-5000勒克斯光照强度、温度23-27℃，盒内相对湿度60-95％，每48小时从进气口(8)强制通气1-4次、通气速度0.1-1升/分钟、每次通气2-30分钟的条件下培养25-30天繁殖小苗。
光照培养约25天小苗长至5厘米以上时，可以在培养间内不移动培养容器的非无菌环境下，从出液口排出旧培养液，从换液口加入新的常规培养液，其方法可按照前述的非无菌环境下换液的方法进行。
排液时可向盒内通入空气，通气的速度可以是1-10升/分钟。
通入未灭菌新诱导微薯培养液的成分可以是：MS+8％白糖，pH5.8。加入速度可以是0.5-5升/分钟，所加培养液高度可以根据所采用的培养方式的相应常规要求选择，可以加液至培养筛板(17)高度处，也可以至盒底0.5-5厘米高度处。
在第(4)步黑暗培养生产微薯的过程中可采用以下条件：
换液后的培养容器在温度23-27℃、盒内相对湿度50-90％的黑暗条件且通气方法同前面第(3)步的条件下培养30-40天即可收获微型薯。
本发明的积极效果：
1.本发明提供的培养容器，具备隔菌密闭、液体培养、透光、通气的功能，能够方便地获得植物组织培养所必须的无菌、光照或黑暗、CO2/O2、相对湿度和营养供给等培养条件。
由于该容器接种口面积被限定在一定的范围内，容器容积的增加是通过扩大容器横断面的面积来实现的，因而在扩大容器培养容积的同时保证了接种的安全性。由于具有培养筛板和排液的功能，配合使用可以实现大量材料的均匀接种。
接种口可以覆盖各种类型的组织培养封口膜，起到了对外隔菌、对内气体交换的作用，可以减少强制通气的时间和次数甚至不用强制通气，节约培养成本。具有强制通气的气体交换功能，可以人为调节培养容器内的CO2/O2、相对湿度等气相条件，适合不同植物材料的生长，控制植物材料的玻璃化或畸形生长的发生。
在培养过程中可以在原位变化培养液的液面高度或更换培养容器内的培养液，可以灵活实现连续浸没式培养、间歇浸没式培养、浅层培养、浅层接触式培养、非接触式培养等多种植物组织培养方式；可以在不移动所培养的植物材料、不移动或不开启培养容器的情况下原位更换培养液，可以适合不同植物种类、不同形态器官的组织的生长和连续继代培养。
可以具有支撑网防止了直立生长的试管苗等组织、器官在生长过程中倒伏，保证在高密度培养下健壮快速生长。
因此本发明的培养容器适用于大规模培养各种具有芽、茎、根以及小苗等器官形态的植物材料。
2.本发明提供的培养容器及与其相应的培养和操作方法可大量培养具有器官形态的植物材料，具有程序简单、操作方便、安全可靠、减少手工劳动强度和必要劳动时间的优点。装配一个体积为长40×宽30×高12厘米、内容积12升(下同)的培养容器仅需3分钟·人，分装40个300毫升容积的普通培养瓶(下同)需20分钟·人；培养容器(耐辐射材料制成)可以大批量反复进行γ-射线快速灭菌，每天可处理6000盒以上，相当于24万个培养瓶，效率大大高于高温蒸汽灭菌；接种40个培养瓶需60分钟·人，接种一个培养容器只需10分钟·人，而且从开口面积远小于容器底面积的接种口，可以克服大容积培养器皿接种容易污染的缺陷，确保污染几率不高于培养瓶的水平(1％)；培养容器重量轻、形状为扁形，适合在普通培养架或简单的专用培养架上集中摆放，能在保证光照、通气条件及方便地原位加液、换液、变化液面等操作的前提下显著提高培养密度。40×30×12厘米的培养容器可以两两摞放在一层培养架上，在160厘米×50厘米×7层的培养袈上可整齐摆放70盒，培养容量相当于2330个300毫升培养瓶，培养密度是培养瓶(每架600瓶)的3倍；采用本发明的原位换液方法，不需反复搬动培养容器即可安全、快速地完成换液操作，时间为每盒4分钟·人，不但省去搬运、拆装容器和培养基、工具消毒灭菌等步骤，而且比培养瓶换液(40分钟·人/40瓶)效率高10倍。
3.本方法较现有方法具有培养密度高、单位面积产量高、生产规模大的特点，能够实现大规模、集约化、工厂化生产。
4.本发明提供的培养容器，其原材料价格低廉，制造工艺简单，坚固不易损坏且可以方便地反复使用，因而其制造和使用成本低；本发明提供的大容量培养容器生产植物材料的操作方法简便，安全可靠、减少手工劳动强度和必要劳动时间，液体培养生长快、节省培养基，培养容器集中摆放节省培养空间，间歇强制通气甚至不需强制通气节省通气设备及能源消耗；本发明提供的大容量培养容器，可以大批同时使用而只需附加一套供气、供液设备，并由一台计算机控制所有培养容器的阀门开闭、供气成分和压力、供液成分和数量、光照条件等，构成廉价的类似生物反应器的工厂化组织培养培养系统。因此本发明大规模实施的成本比现有方法低。
5.本发明提供的使用本发明的培养容器大量生产马铃薯微型种薯的方法具有以下优点：
用组织培养技术生产马铃薯微型薯，生产条件容易控制，可以不受地区、气候、季节的限制实现周年稳定生产，并确保在生产微薯的过程中不会重新感染病毒。
采用液体浅层接触式培养方式，不仅使马铃薯组织只有少部分接触培养基而大部分暴露在湿度适宜的空气中，为马铃薯小苗的生长提供理想的相对湿度、营养供给以及CO2/O2等气相、液相条件，保证快速健壮生长，而且消耗的培养基比现有方法少。
由于该培养容器容量大而接种口面积小，可以确保接种大量含腋芽茎段的安全性；由于具有培养筛板和排液的功能，可以采用本发明提供的液体介质搅拌方法实现大量材料的均匀接种，保证马铃薯小苗在高培养密度下正常同步地生长，提高单位面积的微薯产量和总产量。
可以采用的原位非无菌换液方法，不需反复搬动培养容器即可安全、快速地完成换液操作，实现了小苗繁殖和诱导结薯两个培养过程在培养容器中合二为一，成为连续培养，不但省去其他方法换液过程必需的搬运、拆装容器和培养基、工具消毒灭菌等步骤，而且比普通培养瓶换液效率大为提高，降低生产成本。
实施例1：本发明提供的培养容器及其使用方法
1.培养容器的结构：
图7和图8是本发明所提供的培养容器的实施例结构示意图。
(1).参照图7，该容器是由盒盖(1)与盒身(15)通过在结合面间夹密封材料和手柄螺钉固定，密闭结合形成的具有接种口(2)、换液口(6)、进气口(8)、出液口(18)的扁形培养容器。培养容器横断面为长方形，边长15-100厘米，高度8-20厘米，容积2-200升。
(2).接种口(2)位于盒盖(1)上，其开口面积为容器横断面积的1/5-100。接种口(2)上覆盖组织培养封口膜(塑料)。接种口(2)基部有气密磨口(4)和螺纹(3)，能够扣上气密盖(5)暂时密封接种口。
(3).换液口(6)和进气口(8)处安装孔径为0.2-0.45微米微孔滤膜(10)。换液口(6)、进气口(8)和出液口(18)与阀门(7、9、19)相连以便控制其开闭。进气口(8)位于培养容器相对于接种口(2)的另一侧。出液口通过虹吸管(16)与容器外连通。
(4).位于容器底面上方1-2厘米的高度处设置固定的网筛状培养筛板(17)。
(5).支撑网(21)通过长度为盒高0.5倍的软连接水平悬挂盒盖下方，其内部有软磁性材料(14)。支撑网(21)网格间隙为1.5×1.5厘米。支撑网(21)与接种口(2)一致的位置上有与接种口(2)等大的粗网口区域(22)，这部分的网格间隙为3×3厘米。
(6).盒盖(1)和盒身(15)及换液口(6)、进气口(8)、虹吸管(16)、出液口(18)、培养筛板(17)、支撑网(21)和支脚(20)以及换液阀门(7)、进气阀门(9)、出液阀门(19)等部件，用全透明的耐辐照或耐高温塑料注成。其中(1)、(15)分别与(6)、(8)、(16)、(18)、(17)和(20)以及阀门(7)、(9)、(19)等部件注成一体。
2.培养容器的使用方法：
(1).装配培养容器：
用1-2层组织培养封口膜封闭接种口(2)，在进气口(8)、换液口(6)处安上微孔径0.2-0.45微米的微孔滤膜(10)。旋紧手柄螺钉(11)使盒盖(1)与盒身(15)密闭连接；关闭阀门(7)、(9)、(19)等。
(2).培养容器灭菌：
原料为耐辐照塑料的培养容器，用剂量为3-5×104戈瑞的γ-射线灭菌。原料为耐高温的塑料的培养容器，用1-1.2大气压蒸汽灭菌15-20分钟。
(3).培养容器的接种：
在接种前用永磁体(13)将支撑网(21)吸附在盒盖(1)下方，在接种完成时将磁体移开使支撑网自动落下，由软连接水平悬挂于盒中指定高度上。
接种时接种口必须在超净台中的无菌环境下。揭开接种口(2)的封口膜，将切好的芽、茎、根以及小苗等植物材料从接种口(2)倒入盒中，向盒中加无菌水至6-10厘米高度，封好封口膜，水平摇动培养容器使植物材料均匀分布在水中；用气密盖(5)密封接种口(2)，打开出液阀门(19)，从进气口(8)以0.5-1升/分钟的速度通气，水通过虹吸管(16)从出液口(18)排尽，在液面下降的过程中，植物材料均匀分布于培养筛板(17)上；移去盒盖上的磁体(13)使支撑网(21)落下，悬挂在距培养筛板(17)4-6厘米的高度上。
最后从换液口(6)通入未经灭菌的液体培养基至培养筛板高度，完毕时通入100-200毫升水冲洗进液通道。
(4).培养容器的摆放和培养环境的控制：
接种植物材料后的培养容器通过支脚(20)两两摞放，然后分层整齐摆放在培养架上。
a.光照控制：该培养容器是全透明的，所以培养容器在培养过程中所需的光照条件由盒外光源提供。通常的光源是日光灯，照度1000-3000勒克斯，置于培养容器的上方或侧面，光周期8-14小时/天。
b.气体交换和相对湿度控制：该培养容器在培养过程中，主要通过覆盖在接种口上的组织培养封口膜自动进行盒内外的气体交换，可以通过间歇强制通气的方法进行辅助换气。所通气体通常是空气，可以提高所通气体中的CO2浓度促进植物材料的光合作用；提高O2浓度促进呼吸作用；提高相对湿度促进快速生长；降低相对湿度抑制玻璃化现象。
一般通气速度为0.1-4升/分钟，每48小时通气1-4次，每次2-30分钟。通常培养间内的环境及通入空气的相对湿度均为60-85％。
c.温度控制：通过调节培养间内气温为24-26℃，使培养容器内环境的温度也为24-26℃。
(5).培养容器中培养液的液面控制及更换：
某些植物材料需要间歇浸没式培养，即周期性地改变培养容器内培养液的液面高度以实现浸没与不接触交替的培养。方法是从换液口(6)以1-2升/分钟的速度通入未灭菌的培养液浸没的植物组织，一段时间后以1-4升/分钟的速度向密闭的培养容器内通气造成内高外低的气压差，培养液从开启的出液口流出而降低液面高度至培养筛板以下，植物组织不再接触培养液。通常每24小时液面升降1-2次，每次浸没时间1-4小时。
在非无菌环境下更换培养液，方法是以1-4升/分钟的速度向密闭的培养容器内通气造成内高外低的气压差，使培养液从开启的出液口流出而排尽，再从换液口(6)以1-2升/分钟的速度通入未灭菌新培养液。
实施例2：使用本发明提供的培养容器大量生产马铃薯微型薯
本发明在一个面积20米2、放置12个160×50厘米×7层的培养架的培养间、容纳840个长40×宽30×高12厘米(内容积12升)培养容器的规模下具体实施的方法如下：
采用的本发明提供培养容器的具体结构如图7、8，可以按照图9所示的方法将多个培养容器(1)并联，与计算机(6)控制的气泵(3)、储液罐(4)、废液罐(5)和光照设备(2)组成一套培养系统，实现大规模的工厂化生产。
1.培养容器装配和灭菌：
按实施例1中2(1)所述的方法装配培养容器。其中微孔膜用孔径0.2微米，直径50毫米的硝酸纤维微孔膜，装配完毕时关闭换液阀门(7)、进气阀门(9)、出液阀门(19)。装配好的培养容器(原料为耐辐照塑料的培养容器)用剂量为3×104戈瑞的γ-射线灭菌。
2.用组织培养技术得到马铃薯无病毒试管苗，把试管苗切成1-2厘米长、含1-3个腋芽的小茎段。
3.培养容器的接种：
采用液体浅层接触式培养方式。按实施例1中2(3)所述的方法向培养容器接种马铃薯小茎段。其接种量为0.5-1段/厘米2·底面积，平均600段/盒。
4.光照培养繁殖小苗：
接种后的培养容器两两摞放后分层整齐摆放在160×50厘米×7层的培养架上，从换液口(6)通入成分为MS+2％白糖，pH5.8的未灭菌培养液至培养筛板(17)高度处(2.0厘米，约2升)，速度2升/分钟，最后通入100毫升水冲洗进液通道，关闭换液阀门(7)。培养容器在周期12小时/天、3000勒克斯光照强度、温度24-26℃、每48小时从进气口(8)强制通气1-4次、速度0.1-1升/分钟、每次2-30分钟，使盒内相对湿度保持在70-90％的条件下培养25-30天，可繁殖约600个小苗/盒。
5.换液：
光照培养约25天，小苗长至6厘米以上时在培养间中的非无菌环境下，且不移动培养容器更换培养液。先用气密盖(5)密封接种口(2)，打开出液阀门(19)，从进气口(8)以2-4升/分钟的速度通入空气，旧培养液通过虹吸管(16)流出排尽，移去气密盖(5)，关闭(9)和(19)，以1-2升/分钟的速度从换液口(6)通入未灭菌新培养液(成分：MS+8％白糖，pH5.8)至培养筛板(17)高度(约2.5升)，最后通入100毫升水冲洗进液通道，关闭换液阀门(7)。
6.黑暗培养生产微薯：
换液后的培养容器在黑暗且盒内相对湿度保持在60-80％(通气方法同4)的条件下培养30-40天即可收获约600个微型薯。
每个培养容器经两个培养过程共65天左右可生产微薯约600个，一年可生产5-6茬共3500个，每个培养架可整齐摆放70盒，一年可生产24.5万个微薯，20米2、放12个培养架的普通培养间一年可生产近300万个微薯。

Claims (10)

1.一种培养容器，由盒盖与盒身紧密结合构成，其特征在于所述盒盖和盒身上具有一个接种口、至少一个换液和/或进气口和至少一个出液口。
2.按权利要求1所述的培养容器，其特征在于所述容器中有一培养筛板以支盛所培养的植物材料。
3.按权利要求1所述的培养容器，其特征在于所述容器中有一网眼状支撑网，该网位于容器内植物接种材料上方，其网眼有足够空间让生长的植物材料通过，且网眼的周边可支撑培养植物材料，防止其倒状。
4.按权利要求1所述的培养容器，其特征在于所述换液口和进气口安装有微孔滤膜。
5.按权利要求4所述的培养容器，其特征在于所述微孔滤膜的微孔直径小于0.65微米。
6.一种使用权利要求1所述的培养容器培养具有芽、茎、根及小苗等器官形态的植物材料的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)按常规方法消毒所述容器，
(2)将植物接种材料从所述接种口放入容器中，通过振荡或者加无菌水或常规培养基等液体介质后搅拌使接种材料均匀分布于培养容器中；也可以在加入所述液体介质之后再加入接种材料；
(3)从出液口排出无菌水再加入常规培养基或排出多余常规培养基调节培养基液面，使培养基的高度符合常规的连续浸没式培养方式、间歇浸没式培养方式、浅层培养方式、浅层接触式培养方式或非接触式培养方式的要求，按常规方法和条件培养植物材料，其中培养基的更换和液面的调节通过从出液口排出液体和换液口输入液体的方式进行；植物材料在培养过程中自始至终可以在同一容器中。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于所述的植物材料为马铃薯，使用所述的容器培养获得马铃薯微型薯的方法包括以下步骤：
(1)准备好灭菌的所述培养容器；
(2)将切好的由组织培养技术得到的马铃薯无病毒试管苗的茎段，由所述接种口倒入所述培养容器中，向容器中加无菌水或常规繁苗培养基至浸没所述茎段的高度，摇动容器使茎段均匀分布；
(3)从出液口排出水，从换液口加入常规繁苗培养基，或从出液口排出多余的培养基，至适宜高度，其高度视培养方式而定，按常规方法培养繁殖小苗；
(4)小苗长至5厘米以上时，从出液口排出旧培养基液，从换液口加入新的常规诱导微薯培养基液，按常规方法培养，至微型薯长至可收获。
8.按权利要求6或7所述的方法，其特征在于为从容器中排出液体，由所述进气口向容器内通空气。
9.按权利要求7所述的方法，其特征在于第(3)步中所述的培养方法为浅层接触式培养方式。
10.按权利要求7所述的方法，其特征在于第(3)步中的培养条件为在周期8-14小时/天、1000-5000勒克斯光照强度、温度23-27℃，盒内相对湿度60-95％，每48小时从进气口强制通气1-4次、通气速度0.1-1升/分钟、每次通气2-30分钟的条件下培养25-30天繁殖小苗；第(4)步中培养条件为：在温度23～27℃，相对湿度50～90％通气方法同第(3)步的黑暗条件下培养至收获微型薯。
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