CN118515544A - 从发酵液中提取辅酶q10的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中提取辅酶Q10的方法，包括以下步骤：从发酵液中分离出湿菌渣一；用极性有机溶剂脱水，使湿菌渣中的水分降至干固的15％以下；然后用非极性溶剂从中萃取辅酶Q10，萃取液通过水洗去除其中的极性溶剂；再经提纯得到高纯度的辅酶Q10产品。本发明的方法采用温和的方式去除水分，避免高温干燥等工艺对辅酶Q10的破坏，减少粉尘与废气，操作简单易行，安全环保，绿色经济，有利于发酵法生产辅酶Q10的工业化应用。

Description

从发酵液中提取辅酶Q10的方法

技术领域

本发明属于化学工程领域，具体涉及一种从发酵液中提取辅酶Q10的方法，尤其涉及一种适合于工业化生产规模的提取发酵液中辅酶Q10的方法。

背景技术

辅酶Q10，又称泛醌，是一种存在于自然界的脂溶性醌类化合物，其结构与维生素K、维生素E及质体醌相似。辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能。医学上将它广泛用于心血管系统疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。

辅酶Q10的制造方法已知有以下几种：化学合成，天然物质提取法，微生物发酵法。化学合成法反应步骤多，且产物生物活性低，不易被人体吸收。天然物质提取法是直接从动物肝脏等器官提取，虽然产物生物活性较高，但是生产成本高，价格昂贵，受季节、原材料限制，难以大规模生产。目前大规模生产辅酶Q10主要以发酵法为主，利用发酵法生产的辅酶Q10产品无论是生产成本还是产品品质方面都有较大的竞争优势。

从辅酶Q10发酵液中提取辅酶Q10，首先需要从发酵液中获得菌粉，即将发酵液预处理后经过过滤或者离心得到菌渣，菌渣经干燥得到需要的菌粉，再进一步从中分离出辅酶Q10并提纯。现有技术都是采用干燥的方法降低菌渣中的水分，再用石油醚、正已烷等溶剂提取，收率有限，产物生物活性不如天然物质提取法产物。

专利文献CN106222209A公开了一种提取辅酶Q10的方法，先离心分离收集细胞体，用水洗涤细胞体，然后经喷雾干燥获得干燥的细胞体，再进行辅酶Q10提取。CN106497993A公开的方法是将含有大量还原型辅酶Q10的细胞液进行加酸液处理、离心分离、喷雾干燥、有机溶剂萃取浓缩、冷却结晶得到还原型辅酶Q10。CN109400458A公开的方法是将微生物发酵液过滤，干燥得到菌粉，再经超微粉碎后进行提取和固液分离，层析，结晶得到辅酶Q10成品。CN112174796A公开的方法是辅酶Q10发酵液经预处理、浸提、结晶、溶解、层析、减压浓缩、水洗和干燥等过程提取辅酶Q10，其中预处理过程采用了板框过滤、洗涤与闪蒸干燥湿菌渣。CN107337593A公开的方法是将辅酶Q10发酵液采用陶瓷膜微滤、喷雾干燥方法粉碎菌丝，再经丙酮回流浸提、陶瓷膜过滤器分离，将菌丝细胞破壁、分离，富集辅酶Q10。

上述公开的方法的缺陷在于都是采用热干燥的方法去除湿菌渣中的水分，干燥过程中将大量从发酵液中带来的色素、蛋白等杂质干燥固化进菌粉中，造成后续提取困难；干燥后的菌渣粒度不均，表面硬化程度高，传质效果差，萃取收率低；干燥湿菌渣的过程消耗大量的能源，产生大量的废气及粉尘，增加安全风险和环保压力；干燥过程处于高热、高湿环境中，对菌渣中的产品造成一定程度的破坏，降低收率及产品生物活性。

专利文献CN101429108A公开的方法是辅酶Q10发酵液过滤得到湿滤渣，用无水乙醇在55-80℃浸泡，过滤得到浸泡液，浸泡液减压浓缩后，加入水和正己烷进行萃取，分出正己烷层过柱得到辅酶Q10。但经实验验证发现辅酶Q10产物收率仅为75％左右。

发明内容

为了克服现有技术提取辅酶Q10的上述问题，发明人另辟蹊径地开发出从发酵菌体中提取辅酶Q10的新工艺，经过反复试验验证了该新工艺切实可行，虽然整个工艺都在室温等温和的条件下进行，但是不仅产物收率大大提高，而且产物质量尤其是纯度和生物活性都比较高。具体而言，本发明包括以下技术方案。

一种从发酵液中提取辅酶Q10的方法，包括以下步骤：

(1)从辅酶Q10生产菌发酵液中分离出菌体，得到湿菌渣一；

(2)将湿菌渣一投入极性有机溶剂中，充分搅拌，使得湿菌渣一中60％以上、优选70％以上、优选75％以上、更优选80％以上水分被所述极性有机溶剂置换和/或脱除，分离得到湿菌渣二；

(3)将湿菌渣二用非极性溶剂萃取/浸提，得到含辅酶Q10的萃取液；

(4)含辅酶Q10的萃取液加水洗涤，除去萃取液中残留的极性有机溶剂，油液分层，得到辅酶Q10有机相；

(5)从步骤(4)中得到的水洗去除极性有机溶剂后的辅酶Q10有机相中提纯出辅酶Q10。

步骤(1)中所述的湿菌渣一中水分含量可以为30wt％～90wt％。

上述辅酶Q10生产菌可以是任何用于发酵法生产辅酶Q10的微生物，包括细菌或者真菌，例如是细菌，选自红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌、甲烷微环菌、荚膜红细菌、类球红细菌、浑球红细菌、沼泽红假单胞菌、深红红螺菌、嗜硫小红卵菌、根癌农杆菌、大肠杆菌工程菌等。

步骤(1)中和步骤(2)中所述的分离的方式可以是过滤例如陶瓷膜过滤、板框过滤，或者是离心。

在一种实施方式中，步骤(2)中所述极性有机溶剂尤其是指极性不低于4.0、优选不低于4.3、且能与水混溶的有机溶剂。

优选地，步骤(2)中所述极性有机溶剂是低级醇、酮，选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮中的任意一种或者它们中两种以上的混合物。

更优选步骤(2)中所述极性有机溶剂是指对辅酶Q10生产菌细胞不具破壁(破胞)能力的极性有机溶剂。例如，二甲基亚砜、羧酸、有机碱等有机溶剂具有破壁能力，故在本发明技术方案中不作为所述的极性有机溶剂使用。

步骤(2)中所述的极性有机溶剂的重量为湿菌渣一重量的1～4倍，例如是2～3倍。

在一种实施方式中，步骤(2)中极性有机溶剂置换/脱水操作次数为1-3次，或者连续动态地边流加溶剂边过滤脱水。

优选地，步骤(2)中所述湿菌渣二的含水量为15wt％以下、优选12wt％％以下、更优选10wt％以下。

在一种实施方式中，步骤(3)中所述非极性溶剂尤其是指极性不高于2.5、优选不高于2.4、优选不高于2.0、更优选不高于1.5、更优选不高于1.5、最优选不高于0.5、且不溶于水的有机溶剂。

步骤(3)中所述非极性溶剂优选是石油醚、正已烷、环已烷、庚烷、辛烷、异辛烷中的任意一种或者它们中两种以上的混合物。

步骤(4)中所述的加水洗涤方式可以是分批(间歇式)搅拌洗涤，或者是连续离心洗涤。

在一种实施方式中，步骤(5)中的辅酶Q10提纯方法包括辅酶Q10有机相硅胶柱层析、富含辅酶Q10段洗脱液浓缩、结晶以及干燥步骤。

进一步地，上述方法还可以包括下述步骤：

(6)对步骤(2)中分离后得到的含水极性有机溶剂进行精馏提纯回收，重复使用；或者采用廉价的、不与极性有机溶剂结合的固体干燥剂对其中的水分进行吸收，从而对极性有机溶剂进行干燥回收。

(7)对步骤(5)中提取出辅酶Q10后得到的非极性溶剂进行蒸馏回收，重复使用。

上述步骤(6)和步骤(7)对有机溶剂的回收和重复利用能够降低辅酶Q10的生产成本，而且有助于防治环境污染，具有经济效益和社会效果。

可选地，上述方法还可以包括下述步骤：

(1-1)将步骤(1)得到的湿菌渣一用水洗涤，除去残留的发酵液成分(包括碳源、氮源、蛋白质、多糖、色素等)，通过过滤或者离心，得到除杂后的湿菌渣一。除去湿菌渣一中的杂质后，后续工序中回收的含水极性有机溶剂的精馏提纯变得更加容易，回收率更高。

本发明的工艺条件温和，辅酶Q10的提取在室温或常温(15-35℃)下进行，避免高温干燥对产品分子结构的破坏，减少了粉尘与废气，而且操作简单，安全环保，所制得的辅酶Q10产物收率至少在90％以上，纯度不低于98.5％，特别适合于工业化生产规模的辅酶Q10提取纯化，具有推广价值。

具体实施方式

本发明技术方案的一个重要特点在于对辅酶Q10菌株发酵后湿菌渣、尤其是湿菌渣一的处理工艺与众不同。该技术构思来源于对辅酶Q10本身的物理和化学性质的研究和利用。辅酶Q10是一种醌环类化合物，化学名称为2-[(全-E)3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-十甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基]-5,6-二甲氧基-3-甲基-p-苯醌，因其母核六位上的侧链--聚异戊烯基的聚合度为10而得名，分子中包含许多不饱和双键，很容易发生氧化反应而失去生物活性，且受光照易分解。

辅酶Q10为脂溶性物质，水溶性差。研究发现其在极性有机溶剂中的溶解度较小，在极性有机溶剂的水溶液中溶解度更小。

我们在生产中发现，从辅酶Q10生产菌发酵液中分离出湿菌渣后，如果不对湿菌渣进行干燥降低水分，直接用石油醚、正已烷等有机溶剂萃取，会产生大量的乳化物，且由于石油醚、正已烷等有机溶剂是非极性溶剂，与菌体细胞内的水互不相溶，在细胞胞浆中水分排斥下，难以渗透进细胞内部，对于菌体细胞内的辅酶Q10产品提取十分不利，产物收率一般不超过80％。

本发明开发的方法利用极性有机溶剂与非极性溶剂的合理组合，先后对湿菌渣进行浸提，并对极性有机溶剂和非极性有机溶剂的种类进行了一系列研究和筛选，能够高效率地提取得到生物活性高的高纯度辅酶Q10，产物收率能够至少达到90％以上，经济效益显著提高。

选用的极性有机溶剂的极性的下限为4.0，优选不低于4.3，且能与水混溶。如果极性低于4.0，则湿菌渣一中的胞内辅酶Q10有可能被该极性有机溶剂萃取出来，造成最终辅酶Q10产品收率降低；而且残留在菌渣中的水溶性杂质如色素、蛋白等发酵液成分的去除率有下降趋势。另一方面，优选该极性有机溶剂不具有对菌体细胞破壁(破胞)的能力，否则浸提液容易发生乳化，降低非极性溶剂对辅酶Q10的萃取。

在一种优选的实施方式中，采用的极性有机溶剂是低级醇、酮，选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮。

选用的非极性溶剂的极性上限是2.5，优选不高于2.4、不高于2.0，更优选不高于1.5、最优选不高于0.5，且不溶于水。如果极性高于2.5，则湿菌渣二中胞内有可能残留较多辅酶Q10，不能被全部萃取出来，造成辅酶Q10产品收率降低；而且残留在湿菌渣二中的水溶性杂质也有可能被萃取出来，导致产品纯度和品质下降。

在一种优选的实施方式中，采用的非极性溶剂选自石油醚、正已烷、环已烷、庚烷、辛烷、异辛烷。

本领域技术人员容易理解，极性有机溶剂对湿菌渣一进行脱水处理后，包含一定量的水分，可以采用精馏手段回收极性有机溶剂，重复循环使用；或者可以采用廉价的、不与极性有机溶剂结合的固体干燥剂对其中的水分进行吸收，从而对极性有机溶剂进行干燥回收，重复循环使用，避免浪费。

例如，所述的固体干燥剂可以是氧化铝、氧化钙、氧化镁等，也可以是气凝胶比如亲水性二氧化硅气凝胶。

非极性溶剂在对湿菌渣二进行浸提、水洗、过柱回收后，可以通过对洗脱液进行蒸馏回收得到非极性溶剂，重复循环使用，避免浪费。

极性有机溶剂和非极性溶剂的回收和循环使用具有一定的经济意义和环保意义，符合产业发展趋势。

相比现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：

1.以有机溶剂脱水代替热干燥湿菌渣除水，在常温或低温条件下进行，不对产品造成额外的氧化破坏。

2.以有机溶剂脱水代替热干燥湿菌渣除水，避免了热介质与产品直接接触，产生的粉尘和废气大大减少。

3.有机溶剂脱水过程中，含水的溶剂体系几乎不溶解辅酶Q10，而附着在湿菌渣中的色素、蛋白等杂质随溶剂脱水过程过滤除去，既脱去水分，又除去了杂质，同时避免了辅酶Q10的损失。

4.极性有机溶剂脱水过程中，极性有机溶剂与菌体细胞内水分相互交换，增加了细胞通透性，有利于提高后续非极性溶剂的萃取效率。

5.经过极性有机溶剂脱水的湿菌渣在用非极性溶剂萃取时，残留的极性有机溶剂只需通过简单的水洗即可与非极性溶剂分层除去，不影响后续硅胶柱层析。

6.经过极性有机溶剂脱水的湿菌渣同样也可以进行干燥，干燥有机溶剂相对于直接干燥湿菌渣中水分的条件更温和，操作温度更低，操作更容易，获得的菌粉性状更佳，对产品的破坏更小。

以下通过实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明构思对其做出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

实施例

实施例中所用到主要仪器设备：Agilent 1200型高效液相色谱仪(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)，美国安捷伦科技有限公司。SHJ-6AB型恒温水浴锅，金坛市良友仪器有限公司。

应用高效液相分析方法测定辅酶Q10的含量。高效液相色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，检测波长275nm，柱温35℃，流动相：甲醇-乙醇(1：1)，进样量20μL，流速1mL/min。

实施例中使用的化学试剂购自中国医药(集团)上海化学试剂公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司，化学纯或者分析纯。

辅酶Q10生产菌发酵液由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供，生产菌是类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，发酵液78m³，发酵单位3392mg/L，经板框过滤得到湿菌渣一18.5吨，湿菌渣一含水54.5wt％，辅酶Q10含量1.40wt％，折干重细胞中辅酶Q10含量3.08wt％。

实施例1

取辅酶Q10湿菌渣一5.00kg，加入20kg丙酮，充分搅拌，过滤得湿菌渣二4.32kg，湿菌渣二干燥失重为49.7％，水分7.6％，辅酶Q10含量1.59％，折干辅酶Q10含量3.16％，脱水收率98.1％。

在湿菌渣二中加入正已烷萃取，得到含辅酶Q10的已烷萃取液7980ml，辅酶Q10含量8.5g/L，萃取收率98.7％，萃取后废菌渣中辅酶Q10残留为390ppm。

将已烷萃取液加水洗涤二次，分层除去其中的丙酮和水，然后经硅胶(200-300目柱层析硅胶)柱层析(柱Φ60mm，装填高度400mm)、富含辅酶Q10段洗脱液浓缩、结晶、干燥，得到64.9g纯度99.3％的辅酶Q10，辅酶Q10总收率92.1％，工艺评价结果见表1和表2。

实施例2

参照实施例1，取辅酶Q10湿菌渣一5.00kg，加入10kg甲醇，充分搅拌，过滤得滤饼，滤饼再次加入10kg甲醇，充分搅拌，过滤得湿菌渣二4.42kg，湿菌渣二干燥失重为50.9％，水分6.8％，辅酶Q10含量1.56％，折干辅酶Q10含量3.18％，脱水收率98.6％。

在湿菌渣二中加入异辛烷萃取，得到含辅酶Q10的异辛烷萃取液8380ml，辅酶Q10含量8.1g/L，萃取收率98.4％，萃取后废菌渣中辅酶Q10残留为415ppm。

将异辛烷萃取液加水洗涤二次，分层除去其中的甲醇和水，然后经硅胶层析、浓缩、结晶、干燥等再提纯过程得到65.1g纯度99.2％的辅酶Q10，辅酶Q10总收率92.3％。

实施例3

取辅酶Q10发酵液21.1L用陶瓷膜过滤至12L，然后连续加入乙醇，维持陶瓷膜循环体积不变继续过滤，用乙醇置换料液中的水分，直至陶瓷膜出口滤液中乙醇浓度≥85％停止置换，然后将循环液离心过滤得湿菌渣二4.38kg，湿菌渣二干燥失重为50.5％，水分7.0％，辅酶Q10含量1.57％，折干辅酶Q10含量3.17％，脱水收率98.3％。

在湿菌渣二中加入正已烷萃取，得到含辅酶Q10的已烷萃取液8080ml，辅酶Q10含量8.4g/L，萃取收率98.7％，萃取后废菌渣中辅酶Q10残留为366ppm。

将已烷萃取液加水洗涤二次，分层除去其中的乙醇和水，然后经硅胶层析、浓缩、结晶、干燥等再提纯过程得到64.8g纯度99.3％的辅酶Q10，辅酶Q10总收率91.9％。

对比例1

取辅酶Q10湿菌渣一5.00kg，减压真空干燥得干菌粉2.46kg，水分7.7％，辅酶Q10含量2.76％，折干辅酶Q10含量2.99％，干燥收率97.0％。

在干菌粉中加入正已烷萃取，得到含辅酶Q10的已烷萃取液8050ml，辅酶Q10含量8.2g/L，萃取收率97.2％，萃取后废菌渣中辅酶Q10残留为835ppm。

将已烷萃取液经硅胶层析、浓缩、结晶、干燥等再提纯过程得到纯度大于98.5％的辅酶Q10，辅酶Q10总收率88.0％。工艺评价结果见表1和表2。

对比例2

取辅酶Q10湿菌渣一5.00kg，热空气流中沸腾干燥得干菌粉2.48kg，水分8.4％，辅酶Q10含量2.72％，折干辅酶Q10含量2.97％，干燥收率96.4％。

在干菌粉中加入正已烷萃取，得到含辅酶Q10的已烷萃取液7880ml，辅酶Q10含量8.3g/L，萃取收率96.9％，萃取后废菌渣中辅酶Q10残留为887ppm。

将已烷萃取液经硅胶层析、浓缩、结晶、干燥等再提纯过程得到纯度大于98.5％的辅酶Q10，辅酶Q10总收率87.4％。

对比例3

取辅酶Q10湿菌渣一5.00kg，加入10kg水，打浆，然后经喷雾干燥得干菌粉2.40kg，水分5.4％，辅酶Q10含量2.80％，折干辅酶Q10含量2.96％，干燥收率96.0％。

在干菌粉中加入正已烷萃取，得到含辅酶Q10的已烷萃取液7800ml，辅酶Q10含量8.4g/L，萃取收率97.5％，萃取后废菌渣中辅酶Q10残留为759ppm。

将已烷萃取液经硅胶层析、浓缩、结晶、干燥等再提纯过程得到纯度大于98.5％的辅酶Q10，辅酶Q10总收率87.7％。

上述实验的工艺评价结果见表1和表2。

表1、各实验的辅酶Q10收率对比结果

由表1可见，相比现有技术先对湿菌渣进行真空干燥/气流干燥/喷雾干燥脱水、再进行萃取的工艺，采用极性有机溶剂先对湿菌渣脱水、再进行萃取的本发明工艺的辅酶Q10收率有了一定程度的提高，原因至少包括极性有机溶剂脱水条件温和，不破坏辅酶Q10的分子结构，而且增加了细胞通透性使得非极性溶剂萃取效率提高，极性有机溶剂脱水过程带走了一部分杂质，使精制收率更高。

表2、各实验的工艺特点

由表2可见，实施例1-3采用极性有机溶剂在常温或低温条件下对湿菌渣进行脱水，蒸汽耗用少，产生废气粉尘少，不仅节约能源，而且环保优势突出。

上述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从发酵液中提取辅酶Q10的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从辅酶Q10生产菌发酵液中分离出菌体，得到湿菌渣一；

(2)将湿菌渣一投入极性有机溶剂中，搅拌，使得湿菌渣一中60％以上水分被所述极性有机溶剂置换和/或脱除，分离得到湿菌渣二；

(3)将湿菌渣二用非极性溶剂萃取，得到含辅酶Q10的萃取液；

(4)含辅酶Q10的萃取液加水洗涤，除去萃取液中残留的极性有机溶剂，油液分层，得到辅酶Q10有机相；

(5)从步骤(4)中得到的辅酶Q10有机相中提纯出辅酶Q10。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中和步骤(2)中的分离方式为过滤或者离心。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述极性有机溶剂是极性不低于4.0且能与水混溶的有机溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮中的任意一种或者它们中两种以上的混合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述非极性溶剂是极性不高于2.5且不溶于水的有机溶剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述非极性溶剂选自石油醚、正已烷、环已烷、庚烷、辛烷、异辛烷中的任意一种或者它们中两种以上的混合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的极性有机溶剂的重量为湿菌渣一重量的1～4倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的湿菌渣二中的水分含量为15wt％以下。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的加水洗涤方式为分批搅拌洗涤或者连续离心洗涤。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中的辅酶Q10提纯方法包括辅酶Q10有机相硅胶柱层析、辅酶Q10段洗脱液浓缩、结晶。